2.4. Sampling and processingAt the

2.4. Sampling and processing

At the end of the experiment (day 13), blood samples were taken from the jugular vein and coagulated at room temperature for 60 min. Serum was separated by centrifugation (3,000 rpm, 10 min, 4 °C) and stored at −20 °C until biochemical analysis and ELISA. After blood sampling, all of the piglets were euthanized. The abdomen was immediately opened and intestinal contents of colon and cecum were collected for bacterial counts. Tissues from terminal ileum were removed and immediately frozen in liquid nitrogen. The samples were stored at −80 °C until analysis. Tissues from the jejunum were collected and fixed in 4% paraformaldehyde solution for analysis.

2.5. Biochemical determinations

Serum levels of pig major acute-phase protein (Pig-MAP), D-lactate and diamine oxidase (DAO) were determined using commercial ELISA kits purchased from Beijing Luyuan Byrd biological technology Co., Ltd. (Beijing, China), following the standard procedures described by the manufacturer. Serum levels of SA were measured using a commercial SA assay kit purchased from Nanjing Jiancheng Institute of Bioengineering (Jiangsu, China) according to the manufacturer's protocols.

Histological measurements of jejunum were analyzed according to H&E staining described by Moeser et al. (2012). Villus height and crypt depth were measured under a Leica microscope (DM3000; Leica, Wetzlar, Germany). A minimum of 10 villi from each pig were measured.

Intestinal segments were removed from distal ileum of each piglet, rinsed with 1 × PBS to remove excess blood, homogenized in 1 mL of 1 × PBS, and stored overnight at −20 °C. After 2 freeze–thaw cycles to break up the cell membranes, the homogenate was centrifuged at 5,000 × g for 5 min at 4 °C, and the supernatant was collected, aliquoted in a 1.5 mL tube, and stored at −20 °C until use ( Gao et al., 2013). The ileal protein amount was determined using BCA Protein Assay Kit (KEYGEN, Nanjing, China) following the manufacturer's procedures. The ileal secretory immunoglobulin A (SIgA) levels (pg/mL) were measured using a commercially available ELISA kit (Luyuan Byrd biological technology Co., Ltd., Beijing, China) according to the manufacturer's protocols. The final results were calculated in the form of mg SIgA per g protein.

The intestinal content samples were diluted in ten-fold serial dilutions. The 10 μL of each serial dilution was spread on bacteriological media to allow enumeration of specific bacterial types (Broom et al., 2006). E. coli was determined by growth on Eosin-Methylene Blue Agar (Hopebio, Qingdao, China), following incubation at 37 °C for 18–24 h in air.

2.6. Statistical analysis

All data are presented as means and SEM. The statistical analyses were performed in SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). The significance of the differences between all of the treatment groups was analyzed by one-way ANOVA and means separation using Duncan's significant difference test except for the data of fecal scores and E. coli counts of cecum and colon, which were analyzed by rank sum test. A significance level of 0.05 was used as default and each row with different small letter superscripts meant significant difference.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4. การสุ่มตัวอย่าง และการประมวลผลเมื่อสิ้นสุดการทดลอง (วันที่ 13), เลือดตัวอย่างที่มาจากหลอดเลือดดำ jugular และ coagulated ที่อุณหภูมิห้องใน 60 นาทีเซรั่มถูกคั่น ด้วย centrifugation (3000 รอบต่อนาที 10 นาที 4 ° C) และเก็บไว้ที่ −20 ° C จนวิเคราะห์ชีวเคมีและ ELISA หลังจากเก็บตัวอย่างเลือด ทรูดทั้งหมดถูก euthanized สิ่งนั้น ทันทีเปิดช่องท้อง และลำไส้เนื้อหาคู่และ cecum ถูกเก็บรวบรวมการตรวจนับแบคทีเรีย เนื้อเยื่อจาก terminal ileum ถูกเอาออก และแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวทันที ตัวอย่างถูกเก็บไว้ที่ −80 ° C จนถึงการวิเคราะห์ เนื้อเยื่อจาก jejunum ถูกรวบรวม และถาวรในโซลูชั่น paraformaldehyde 4% สำหรับการวิเคราะห์2.5. ชีวเคมี determinationsระดับ serum ของหมูใหญ่ระยะเฉียบพลันโปรตีน (หมูแผนที่), D lactate และ diamine oxidase (ดาว) ได้กำหนดใช้พาณิชย์ ELISA ชุดซื้อจากปักกิ่ง Luyuan Byrd เทคโนโลยีชีวภาพ Co., Ltd. (ปักกิ่ง ประเทศจีน), ทำตามขั้นตอนมาตรฐานโดยผู้ผลิต ระดับ serum ของ SA ถูกวัดโดยใช้การค้า SA วิเคราะห์ชุดซื้อตามโปรโตคอลของผู้ผลิตจากจิง Jiancheng สถาบันของ Bioengineering (มณฑลเจียงซู จีน)มีวิเคราะห์ประเมินสรีรวิทยาของ jejunum ตาม H & E ย้อมสีอธิบายโดย Moeser et al. (2012) มีวัดความลึกความสูงและ crypt villus ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ไล (DM3000 ไลก้า Wetzlar เยอรมนี) มีวัดอย่างน้อย villi 10 จากหมูแต่ละส่วนลำไส้ออกจาก ileum กระดูกของลูกสุกรแต่ละ rinsed ด้วย 1 × PBS เอาเลือดส่วนเกิน homogenized เป็นกลุ่มใน 1 mL ของ PBS ที่ซื้อ 1 และเก็บค้างคืนที่ −20 องศาเซลเซียส หลังจากที่ 2 หยุด – thaw วงจรการสลายเยื่อหุ้มเซลล์ homogenate ถูก centrifuged ที่ 5000 × g ใน 5 นาทีที่ 4 ° C และ supernatant ถูกรวบรวม aliquoted ในหลอด 1.5 มิลลิลิตร และเก็บไว้ที่ −20 ° C จนถึงใช้ (เกา et al., 2013) ยอดโปรตีน ileal ถูกกำหนดใช้ BCA โปรตีน Assay Kit (KEYGEN นานกิง ประเทศจีน) ตามขั้นตอนของผู้ผลิต การ ileal secretory immunoglobulin ระดับ (SIgA) (pg/mL) ถูกวัดโดยใช้ใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ ELISA ชุด (Luyuan Byrd ชีวภาพเทคโนโลยี Co., ltd ปักกิ่ง จีน) ตามโปรโตคอลของบริษัทผู้ผลิต ผลสุดท้ายถูกคำนวณในรูปของมิลลิกรัม SIgA ต่อกรัมโปรตีนตัวอย่างเนื้อหาลำไส้ถูกทำให้เจือจางใน dilutions ten-fold ประจำ ΜL 10 ของเจือจางแต่ละล็อตได้แพร่กระจายไปบนสื่อ bacteriological เพื่ออนุญาตให้การแจงนับของชนิดแบคทีเรียเฉพาะ (ไม้กวาดและ al., 2006) E. coli ถูกกำหนด โดยเติบโตในเมทิลีนได Eosin บลู Agar (Hopebio ชิงเต่า จีน), ต่อไปนี้บ่มที่ 37 ° C สำหรับ 18-24 h ในอากาศ2.6. สถิติวิเคราะห์มีแสดงข้อมูลทั้งหมดเป็นวิธีและ SEM. มีดำเนินการวิเคราะห์ทางสถิติในโปรแกรม 16.0 (โปรแกรม Inc. ชิคาโก IL) มีวิเคราะห์ความสำคัญของความแตกต่างระหว่างกลุ่มรักษา โดยทางเดียวการวิเคราะห์ความแปรปรวนและวิธีแยกโดยใช้การทดสอบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญของดันแคนยกเว้นข้อมูลของ fecal คะแนนและจำนวน E. coli cecum และลำไส้ใหญ่ ที่ถูกวิเคราะห์ โดยการทดสอบผลอันดับ ระดับนัยสำคัญ 0.05 ถูกใช้เป็นค่าเริ่มต้น และแต่ละแถว มีตัวยกตัวอักษรขนาดเล็กหมายถึง ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4 การเก็บตัวอย่างและการประมวลผลในตอนท้ายของการทดสอบ (วันที่ 13), ตัวอย่างเลือดถูกนำมาจากเส้นเลือดใหญ่เส้นและจับตัวที่อุณหภูมิห้องนาน 60 นาที เซรั่มที่ถูกแยกจากกันโดยการหมุนเหวี่ยง (3,000 รอบต่อนาที, 10 นาที, 4 ° C) และเก็บไว้ที่ -20 ° C จนการวิเคราะห์ทางชีวเคมีและวิธี ELISA หลังจากการเก็บตัวอย่างเลือดทั้งหมดของลูกสุกรที่ถูก euthanized หน้าท้องถูกเปิดทันทีและเนื้อหาในลำไส้ของลำไส้ใหญ่และลำไส้ใหญ่ส่วนต้นถูกเก็บไว้สำหรับการนับจำนวนแบคทีเรีย เนื้อเยื่อจาก ileum ขั้วถูกถอดออกและแช่แข็งทันทีในไนโตรเจนเหลว กลุ่มตัวอย่างที่ถูกเก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียสจนถึงการวิเคราะห์ เนื้อเยื่อจากลำไส้เล็กส่วนกลางถูกเก็บรวบรวมและการแก้ไขใน 4% วิธีการแก้ปัญหาในการวิเคราะห์ paraformaldehyde. 2.5 หาความชีวเคมีระดับเซรั่มหมูโปรตีนที่สำคัญเฟสเฉียบพลัน (หมู-MAP) D-แลคเตทและเดส diamine (DAO) ได้รับการพิจารณาโดยใช้ชุด ELISA เชิงพาณิชย์ที่ซื้อมาจากปักกิ่ง Luyuan เบิร์ดเทคโนโลยีชีวภาพ จำกัด (กรุงปักกิ่งประเทศจีน) ต่อไปนี้ขั้นตอนมาตรฐานที่อธิบายไว้โดยผู้ผลิต ระดับซีรั่มของ SA ถูกวัดโดยใช้ชุดทดสอบเชิงพาณิชย์ SA ซื้อจากหนานจิง Jiancheng สถาบันวิศวกรรมชีวภาพ (Jiangsu, จีน) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต. วัดเนื้อเยื่อลำไส้วิเคราะห์ตามการย้อมสี H & E อธิบายโดย Moeser et al, (2012) ความสูงและความลึก villus ฝังศพใต้ถุนโบสถ์วัดภายใต้กล้องจุลทรรศน์ Leica (DM3000; Leica, Wetzlar, เยอรมนี) อย่างน้อย 10 villi จากหมูแต่ละวัด. ส่วนลำไส้ออกจากปลาย ileum ของแต่ละลูกสุกรล้างด้วย 1 ×พีบีเอสที่จะเอาเลือดส่วนเกินหดหายใน 1 มิลลิลิตร 1 ×พีบีเอสและเก็บไว้ค้างคืนที่ -20 ° C หลังจากนั้น 2 รอบแช่แข็งละลายที่จะทำลายเยื่อหุ้มเซลล์ที่ homogenate ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 5000 ×กรัมเป็นเวลา 5 นาทีที่ 4 ° C และสารละลายที่ถูกเก็บรวบรวม aliquoted ในหลอดมิลลิลิตร 1.5 และเก็บไว้ที่ -20 ° C จน ใช้ (Gao et al., 2013) ปริมาณโปรตีน ileal ถูกกำหนดใช้เก็บกวาดโปรตีน Assay Kit (Keygen หนานจิงประเทศจีน) ทำตามขั้นตอนของผู้ผลิต อิมมูโนหลั่ง ileal A (SIGA) ระดับ (pg / มิลลิลิตร) ถูกวัดโดยใช้ชุด ELISA ใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ (Luyuan เบิร์ดเทคโนโลยีชีวภาพ จำกัด , ปักกิ่ง, จีน) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต ผลสุดท้ายจะถูกคำนวณในรูปแบบของมก. SIGA ต่อกรัมโปรตีน. กลุ่มตัวอย่างเนื้อหาในลำไส้ถูกเจือจางในเจือจางอนุกรมสิบเท่า 10 ไมโครลิตรของแต่ละเจือจางอนุกรมกระจายในสื่อแบคทีเรียเพื่อให้การแจงนับของแบคทีเรียชนิดที่เฉพาะเจาะจง (ไม้กวาด et al., 2006) เชื้อ E. coli ถูกกำหนดโดยการเจริญเติบโตใน Eosin-สีน้ำเงิน Methylene วุ้น (Hopebio ชิงเต่าประเทศจีน) ต่อไปบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 18-24 ชั่วโมงในอากาศ. 2.6 การวิเคราะห์ทางสถิติข้อมูลทั้งหมดจะถูกนำเสนอเป็นวิธีและ SEM การวิเคราะห์ทางสถิติได้ดำเนินการในโปรแกรม SPSS 16.0 (SPSS อิงค์, Chicago, IL) อย่างมีนัยสำคัญของความแตกต่างระหว่างกลุ่มการรักษาได้รับการวิเคราะห์โดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวและหมายถึงการแยกการใช้การทดสอบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญของดันแคนยกเว้นสำหรับข้อมูลของคะแนนอุจจาระและ E. นับ coli ของลำไส้ใหญ่และลำไส้ซึ่งได้รับการวิเคราะห์โดยการจัดอันดับการทดสอบผลรวม . ระดับความสำคัญของ 0.05 ถูกใช้เป็นค่าเริ่มต้นและแถวที่มีอักษรตัวเล็กตัวยกที่แตกต่างกันในแต่ละความหมายแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ