Western blot analysisIn order to ob

Western blot analysis
In order to obtain total cellular extracts, P19
cells were harvested by trypsinization, washed with
PBS and centrifuged for 5 minutes at 1,000 g. The
cellular pellet was resuspended in RIPA buffer (R0278;
Sigma) supplemented with 2 mM ditiothreitol (DTT),
100 μM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), and
a protease inhibitor cocktail (containing 1 μg/ml of
leupeptin, antipain, chymostatin, and pepstatin A),
physically ruptured by sonication and kept at –80ºC
until used. Protein contents were determined by using
the BCA protein assay (23227; Thermo Scientific).
After denaturation at 95ºC for 5 minutes in a Laemmli
buffer (161–0737; BioRad, Hercules, CA, USA),
equivalent amounts of protein (30 μg) were separated
by electrophoresis in 12% sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide
gel electrophoresis (SDS–PAGE) and
electrophoretically transferred to a polyvinylidene
difluoride (PVDF) membrane. Ponceau S staining
was used to ensure equal loading [23]. After blocking
membranes with 5% skim milk in TBS-T (50 mM Tris–
HCl, pH 8; 154 mM NaCl and 0.1% Tween-20) for
1 hour at room temperature, membranes were incubated
overnight at 4ºC with the antibodies directed against
B-cell lymphoma 2 (BCL-2; 2870), BCL-2-associated X
protein (BAX, 2772) and pyruvate dehydrogenase (PDH;
3205) from Cell Signaling (Danvers, MA, USA); and
pSer293-PDH-E1α (ab92696) from Abcam (Cambridge,
UK), each previously diluted 1:1, 000 in blocking buffer
(1% skim milk in TBS-T). After three 5 minutes-washes
in PBS-T, the membranes were incubated with a dilution
(1:10, 000 in blocking buffer) of a corresponding alkaline
phosphatase-conjugated secondary antibody (Santa Cruz
Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) for 2 hours at room
temperature. After three washes in PBS-T for 15 minutes
each, membranes were developed with the ECF detection system (RPN5785; GE Healthcare, Piscataway, NJ)
and imaged with Versa Doc imaging system (Bio-Rad)
according to the manufacturers’ protocols. Densities of
each band were calculated with Quantity One Software
(Bio-Rad) or ImageJ software. All data presented are
representative from at least three separate experiments.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิเคราะห์ตะวันตกคืนในตาเพื่อให้ได้ผลรวม กับสารสกัดจาก P19เซลล์เก็บเกี่ยว โดย trypsinization ล้างด้วยPBS และ centrifuged 5 นาทีที่ 1000 กรัมเม็ดโทรศัพท์มือถือถูก resuspended ในบัฟเฟอร์ริป้าราคา (R0278ซิกมา) เสริม ด้วย 2 มม. ditiothreitol (DTT),100 μM phenylmethylsulfonyl ฟลูออไรด์ (PMSF), และค็อกเทลผลรติเอส (μg 1 ml ของประกอบด้วยleupeptin, antipain, chymostatin และ pepstatin A),พุ่งกระฉูด โดย sonication และเก็บไว้ที่-80ºCจนกว่าจะใช้ โปรตีนเนื้อหาถูกกำหนดโดยวิเคราะห์โปรตีนของ BCA (23227 เทอร์โมวิทยาศาสตร์)หลังจาก denaturation ที่ 95ºC 5 นาทีในการ Laemmliบัฟเฟอร์ (161 – 0737 BioRad เฮอร์คิวลิส CA, USA),จำนวนเทียบเท่าโปรตีน (30 μg) ได้แบ่งโดย electrophoresis ใน 12% โซเดียม dodecyl sulfatepolyacrylamideเจ electrophoresis (SDS – หน้า) และโอนย้ายไป polyvinylidene electrophoreticallyเมมเบรนของ difluoride (PVDF) S Ponceau ย้อมสีใช้ให้โหลดเท่า [23] หลังจากบล็อกเข้า 5% อ่านอย่างคร่าว ๆ นมใน TBS-T (50 มม.ตรี –HCl, pH 8 154 มม. NaCl และ 0.1% Tween-20) สำหรับ1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง เยื่อหุ้มถูก incubatedนอนที่ 4ºC กับแอนตี้ที่ตรงกับคอลลาเซลล์ B 2 (BCL 2; 2870), BCL 2-เกี่ยวข้องกับ Xโปรตีน (BAX, 2772) และ pyruvate dehydrogenase (PDH3205) จากเซลล์ตามปกติ (เดนเวอร์ MA, USA); และpSer293-PDH-E1α (ab92696) จาก Abcam (เคมบริดจ์สหราชอาณาจักร), แต่ละก่อนหน้านี้ผสม 1:1, 000 ในบัฟเฟอร์การบล็อค(1% skim นมใน TBS-T) หลังจากสาม 5 นาที washesใน PBS-T เยื่อหุ้มมี incubated มีการเจือจาง(1:10, 000 ในบัฟเฟอร์บล็อก) ของที่เกี่ยวข้องด่างแอนติบอดีรองกลวงฟอสฟาเตส (ซานตาครูซเทคโนโลยีชีวภาพ ซานตาครูซ CA, USA) ห้อง 2 ชั่วโมงอุณหภูมิ หลังจาก washes สามใน PBS T 15 นาทีแต่ละ เยื่อหุ้มถูกพัฒนา ด้วยระบบตรวจจับการ ECF (RPN5785 ดูแลสุขภาพ GE ปิสกาตาเวย์ NJ)และ imaged กับเอกสารในทางกลับภาพระบบ (ไบ-Rad)ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต ความหนาแน่นของแต่ละแถบได้คำนวณปริมาณหนึ่งซอฟต์แวร์(ไบโอ-Rad) หรือซอฟต์แวร์ ImageJ ข้อมูลทั้งหมดที่นำเสนอตัวแทนจากทดลองที่สามแยก

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การวิเคราะห์ดวงตะวัน
เพื่อให้ได้สารสกัดจากโทรศัพท์มือถือรวม P19
เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวโดย trypsinization ล้างด้วย
พีบีเอสและปั่นเป็นเวลา 5 นาทีที่ 1,000 กรัม
เม็ดโทรศัพท์มือถือถูก resuspended ในบัฟเฟอร์ RIPA (R0278;
ซิก) เสริมด้วย 2 มิลลิ ditiothreitol (DTT)
100 ไมครอนฟลูออไร phenylmethylsulfonyl (PMSF) และ
ยับยั้งเอนไซม์โปรติเอค๊อกเทล (ที่มี 1 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร
leupeptin, antipain, chymostatin และ pepstatin )
แตกร่างกาย sonication และเก็บไว้ที่-80ºC
จนใช้ ปริมาณโปรตีนได้รับการพิจารณาโดยใช้
การทดสอบโปรตีน BCA (23227; เทอร์โมวิทยาศาสตร์).
หลังจากที่สูญเสียสภาพธรรมชาติที่95ºCเป็นเวลา 5 นาทีใน Laemmli
บัฟเฟอร์ (161-0737; BioRad ดาว, CA, USA)
จำนวนเงินเทียบเท่าของโปรตีน (30 ไมโครกรัม) ถูกแยกออก
โดย electrophoresis ใน 12% โซเดียมโดเดซิล sulfatepolyacrylamide
ข่าวคราว (SDS-PAGE) และ
โอน electrophoretically เพื่อ Polyvinylidene
difluoride (PVDF) เมมเบรน การย้อมสี Ponceau S
ถูกนำมาใช้เพื่อให้แน่ใจว่าการโหลดเท่ากัน [23] หลังจากที่ปิดกั้น
เยื่อ 5% นมพร่องมันเนยใน TBS-T (50 มิลลิ Tris-
HCl ค่า pH 8; 154 มิลลิโซเดียมคลอไรด์และ 0.1% Tween-20) สำหรับ
1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องเยื่อถูกบ่ม
ค้างคืนที่4ºCกับแอนติบอดีโดยตรงต่อ
B-cell lymphoma 2 (BCL-2; 2870) BCL-2-X เกี่ยวข้อง
โปรตีน (BAX, 2772) และ dehydrogenase ไพรู (PDH;
3205) จากการส่งสัญญาณของเซลล์ (เดนเวอร์, MA, USA); และ
pSer293-PDH-E1α (ab92696) จาก Abcam (เคมบริดจ์,
สหราชอาณาจักร) แต่ละเจือจางก่อนหน้านี้ 1: 1, 000 ในการป้องกันบัฟเฟอร์
(1% นมพร่องมันเนยใน TBS-T) หลังจากสาม 5 นาทีล้าง
ใน PBS-T, เยื่อถูกบ่มกับการเจือจาง
(1:10, 000 ในการปิดกั้นกันชน) ของอัลคาไลน์ที่สอดคล้อง
แอนติบอดี phosphatase-ผันรอง (ซานตาครูซ
เทคโนโลยีชีวภาพซานตาครูซ, CA, USA) สำหรับ 2 ชั่วโมงที่ห้อง
อุณหภูมิ หลังจากสามล้างใน PBS-T เป็นเวลา 15 นาที
ในแต่ละเยื่อได้รับการพัฒนาด้วยระบบตรวจจับ ECF (RPN5785; GE Healthcare, พิสแคต, นิวเจอร์ซีย์)
และถ่ายภาพด้วยระบบการถ่ายภาพในทางกลับกันคุณหมอ (Bio-Rad)
ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต ความหนาแน่นของ
แต่ละกลุ่มจะถูกคำนวณกับจำนวนหนึ่งซอฟแวร์
(Bio-Rad) หรือซอฟต์แวร์ ImageJ ข้อมูลทั้งหมดที่นำเสนอเป็น
ตัวแทนจากอย่างน้อยสามการทดลองแยกต่างหาก

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

Western blot การวิเคราะห์
เพื่อให้ได้ทั้งหมดของเซลล์ สารสกัด p19
เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวโดย trypsinization , ล้างด้วย
PBS ไฟฟ้าสำหรับ 5 นาทีที่ 1000 g .
เม็ดโทรศัพท์มือถือเป็น resuspended ในบัฟเฟอร์ ( RIPA r0278 ;
Sigma ) เสริมด้วย 2 มม. ditiothreitol ( DTT )
100 μ M phenylmethylsulfonyl ฟลูออไรด์ ( PMSF ) , และการใช้ ( มี 1 μเอสเทลลูเพปติน
g / ml ,antipain chymostatin , และ pepstatin ) ,
ร่างกายฉีกขาด โดย sonication และเก็บไว้ที่ - 80 º C
จนใช้ ปริมาณโปรตีนที่ถูกกำหนดโดยการใช้โปรตีนโปรตีน assay ( 23227
; เทอร์โมวิทยาศาสตร์ .
หลังจาก ( 95 ºองศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีใน laemmli
บัฟเฟอร์ ( 161 ) 0737 ; biorad , Hercules , CA , USA ) ,
เทียบเท่าปริมาณของโปรตีน ( μ 30 g )
แยกกันโดยวิธีอิเล็กโทรโฟรีซีสใน 12 % โซเดียมโดเดซิลอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส ( SDS )

electrophoretically หน้า ) และโอนไปยังีน
ไดฟลูออไรด์ ( PVDF ) เยื่อ ใน S .
ถูกใช้เพื่อให้แน่ใจว่าเท่ากับโหลด [ 23 ] หลังจากการปิดกั้น
+ 5% หางนมผงใน tbs-t ( จาก 50 mm –
กรดไฮโดรคลอริก pH 8 154 mM NaCl และ 0.1% tween-20 )
1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องเยื่อแผ่นแบบบ่ม
ค้างคืนที่ 4 º C กับแอนติบอดีโดยตรงต่อ
- มะเร็งต่อมน้ำเหลือง 2 ( bcl-2 ; 0 ) bcl-2-associated x
โปรตีน ( bax 2772 ) และ pyruvate dehydrogenase ( PDH ;
3205 ) จากสัญญาณมือถือ ( เดนเวอร์ , MA , USA ) ;
pser293-pdh-e1 α ( ab92696 ) จาก ABCAM ( เคมบริดจ์
, UK ) แต่ละก่อนหน้านี้เจือจาง 1 : 1 , 000 ในบล็อกบัฟเฟอร์
( 1% หางนมผงใน tbs-t ) หลังจากที่สาม 5 นาทีล้าง