V. EXAMPLES[00149] Example 1: Produ

V. EXAMPLES


[00149] Example 1: Production and characterization of รีคอมบิแนนต์ human

PCSK9 and ฮิวเมน PCSK9 mutant


[00150] ฮิวเมน PCSK9 (SEQ ID NO: 34) containing a C-tenninal FLAG tag was expressed in transfected HEK293F cells. 600ml of transfected cells were cultivated in DMEM/TS/0.05% BSA for 6 days and the ส่วนลอย containing the hPCSK9 was recovered. hPCSK9 was bound to FLAG M2 resin, washed with 50CV wash buffer (lOmM Tris/HCL pH7.4, 150ml NaCl, 2mM Cacl2, 10% glycerol) and eluted with 5 CV wash buffer containing lOOµg/ml 3x FLAG peptide. The eluted protein was further purified via gel filtration using a Superdex 200 16/60 column (GE Healthcare). Functionality was tested with a LDL-R cell-ELISA using HepG2 cells.

[00151] For selection and screening of ไลโปคาลิน มิวทีน of interest, hPCSK9 may be biotinylated. hPCSK9 was incubated with a 5 times molar excess of EZ-Link NHS• Chromogenic Biotin reagent (Thermo Scientific) for 1 hr at room temperature. Excess of biotin was removed and the biotinylated protein was concentrated by ultrafiltration. A Streptacin pull-down assay confirmed biotinylation.

[00152] The gain of function hPCSK9_D374Y mutant, cynomolgus PCSK9 and mouse

PCSK9 were produced and characterized in the same way.


[00153] Example 2: Generation of a ไลบรารี with 2xl010 independent ไลโปคาลิน มิวทีน and phagemid selection of ไลโปคาลิน มิวทีน against PCSK9

[00154] A random ไลบรารี of 2xl 010 ไลโปคาลิน มิวทีน with high diversity was generated by random การก่อกลายพันธุ์ of ไลโปคาลิน น้ำตามนุษย์ เต็มวัย (see, for example, W02007/107563). For selection of PCSK9-specific ไลโปคาลิน มิวทีน, 2xl012 phagemids from this ไลบรารี were incubated with 200 nM biotinylated humand and/or cynomolgus PCSK9. Paramagnetic beads coated with neutravidin หรือ streptavidin were used to capture PCSK9/phagemid complexes which were subsequently isolated with a magnet. Unbound phagemids were removed by washing the beads eight times with 1 ml PBS/T. Bound phagemids were eluted by incubation first with triethylamine and then with 0.1 M glycine pH 2.2. Four consecutive rounds of selection were performed.
[00155] The mutagenized central cassette of the phasmid preparation obtained after phage display selection was isolated by digestion of the DNA with BstXl and subsequent purification via agarose gel electrophoresis using standard methods (Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: a laboratory manual). The DNA was inserted into the likewise cut เวกเตอร์ pTlcl 0 which allows bacterial production of the มิวทีน under the control of a tetracyclin โปรโมเตอร์. CaCh-competent TG 1-F' cells were transformed with the ligation ของผสม and plated on LB/Amp plates. Individual colonies were used to inoculate 2xYT/Amp medium and grown overnight (14-18 h) to stationary phase. Subsequently, 50 µl 2xYT/Amp were inoculated from the stationary phase cultures and incubated for 3h at 37°C and then shifted to
22°C until an ODs9sof 0.6-0.8 was reached. Anticalin production was induced by addition of

10 µl 2xYT/Amp supplemented with 1.2 µg/ml anhydrotetracyclin. Cultures were incubated at 22°C until the next day. After addition of 40 µl of 5% (w/v) BSA in PBS/T and incubation for lh at 25°C cultures were ready for use in screening assays.

[00156] For selection of ไลโปคาลิน มิวทีน, human and cynomolgus PCSK9 (1 µg/ml in PBS/T), which all carried a FLAG-tag, were captured on microtiterplates by means of an anti-FLAG-tag antibody (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) which was coated on the plates the day before with an final concentration of 5 ug/ml in PBS. Anti-Flag-tag antibody alone served as negative control. Subsequently, 20 µl of BSA-blocked cultures were added and incubated for lh at 25°C. Bound มิวทีน were detected with a 1: 10000 dilution of anti-T7 antibody conjugated with ฮอร์สเรดิช เปอร์ออกซิเดส ("HRP", Merck KgaA, Darmstadt) in PBS/T. For quantification, 20 µl QuantaBlu fluorogenic peroxidase substrate was added and measured at an excitation wavelength of320 nm and an emission wavelength of 430 nm.

[00157] Example 3: Generation of a biased maturation ไลบรารี for optimization of

PCSK9-specificไลโปคาลิน มิวทีน


[00158] For optimization of PCSK9-specific มิวทีน identified from the ไลโปคาลิน ไลบรารี in above Example 2, additional ไลบรารี based on ไลโปคาลิน มิวทีน SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 7 (hereafter, named "mother clone(s)" in this example), respectively, were generated. The ไลบรารี were generated in a manner that leads to partial randomisation of selected positions only. The design was made such that, for each of the selected positions, the amino acid encoded corresponds to the amino acid found in the respective mother clone with a probability of 70%, while it can be a different amino acid with a 30% probability. With N the number of targeted positions and B as bias, the most probable number of exchanges per clone is N x (1-B). For example, if 20 amino acid positions are

partially randomised with a 70% bias on the amino acid of the mother clone, this will result in a ไลบรารี of mutants on average containing six mutations overall compared to the mother clone, but on the targeted positions only. However, not all of the clones would have six exchanges: the frequency of mutations per clone will follow a binomial distribution, as depicted in รูป 11 D.

[00159] To assemble such ไลบรารี, recursive assembly of โอลิโกนินิs in a polymerase chain reaction ("PCR") reaction (Stemmer et al., (1995) Gene 164:49-53) was used. The โอลิโกนินิs are generated by standard phosphoramidite chemistry (Beaucage et al., (1981) Tetrahedron Lett. 22, 1859-62; McBride et al., (1983) Tetrahedron Lett. 24,
245-8). To allow an encoding of a 70% bias, we have calculated optimised ของผสม for each

position of a nucleotide triplet for each of the 20 canonical amino acids. For example, a ของผสม encoding serine with a bias of 70% and allowing various different amino acids in the remaining 30% is generated by the ของผสม of nucleoside phosphoramidite building blocks "abc", where a corresponds to a ของผสม of 85% thymidine, and 5% guaninidine, ไซโตซีน and adenosine each, b corresponds to a ของผสม of 85% ไซโตซีน and 5% of the other nucleosides each, and c comesponds to a ของผสม of 50% guanidine and 50% thymidine (see Figure11).

[00160] Using the technology described above, said ไลบรารี based on SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 7, respectively, were generated by recursive PCR. Subsequently, the generated ไลโปคาลิน มิวทีน were cloned with high efficiently into a phagemid เวกเตอร์ essentially as described (see, for example, Kim et al., (2009) J Am Chem Soc
131(10):3565-76). The ไลบรารี size ranged from 7xl09 to llxl09 mutants. The ไลบรารี were

employed in subsequent phage panning (see Example4).


[00161]

PCSK9

Example 4: Phagemid selection of optimized ไลโปคาลิน มิวทีน against

[00162] For selection of optimized PCSK9-specific ไลโปคาลิน มิวทีน, 2x1012 phagemids from the ไลบรารี described in Example 3 were used. Phagemids were dissolved in PBS supplemented with 0.1% Tween-20 (v/v) (i.e. PBS/T), 50 mM benzamidine and 1 % (w/v) casein. To select ไลโปคาลิน มิวทีน with increased แอฟฟินิตี้, phagemids were incubated with reduced concentrations ofbiotinylated PCSK9 proteins that ranged from 0.01 - 10 nM. In several instances, phagemids were incubated at 65°C for 10 min to select for มิวทีน with increased heat-tolerance. Blocked phagemids were incubated for 40 min with biotinylated PCSK9 proteins before 0.3 mM desthiobiotin was added to the solution to saturate free streptavidin binding ตำแหน่ง and incubation was continued for 20 min. Subsequently, blocked (1 % (w/v) casein in PBS/T) and drained paramagnetic beads that were either coated with streptavidin หรือ neutravidin were added for 20 min to capture PCSK9-phagemid complexes. Uncomplexed phagemids were removed by washing the beads eight times with 1 ml PBS/T by thorough resuspension followed by collection of beads with a magnet. To specifically select มิวทีน with reduced k0ff rates either a more stringent wash protocol was applied by
performing 5 additional wash steps after round 1, 10 after round 2, 15 after round 3 and 20 after round 4 หรือ มิวทีน-PCSK9 complexes were incubated with different amounts (10 nM- 5
µM) of purified parental มิวทีน (e.g. SEQ ID NO: 3, 4 หรือ 7) to allow competition in PCSK9- binding between optimized and parental ไลโปคาลิน มิวทีน. Additionally, combinations of both methods were applied. Bound phagemids were first eluted with 300 µl 70 mM triethylamine for 10 min followed by immediate neutralization of the ส่วนลอย with 100 µl lM Tris-Cl pH 6.0. After one intermediate wash cycle remaining phagemids were eluted with 100 mM glycin pH 2.2 for 10 min followed by immediate neutralization with 50 µl 0.5 M Tris-base. Both elution :fractionswere pooled and used to infect 4 ml oflog-phase E. coli culture (OD550
0.45-0.6) for reamplification. After incubation for 30 min under agitation bacteria were collected by centrifugation at 5000xg for 2 min, resuspended in 1 ml 2xYT medium an

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

V. ตัวอย่าง[00149] ตัวอย่าง 1: การผลิตและคุณสมบัติของมนุษย์รีคอมบิแนนต์PCSK9 และฮิวเมน PCSK9 mutantฮิวเมน [00150] PCSK9 (ลำดับ ID ไม่: 34) ประกอบด้วยแท็กซี tenninal ธงถูกแสดงในเซลล์ HEK293F transfected 600ml ของเซลล์ transfected ถูกปลูกในบีเอสเอ DMEM/TS/0.05% วันที่ 6 และส่วนลอยที่ประกอบด้วย hPCSK9 ถูกกู้คืน hPCSK9 กับยางธง M2 ล้าง ด้วย 50CV ล้างบัฟเฟอร์ (lOmM ตรี/HCL pH7.4, 150ml NaCl, Cacl2 กลีเซอร 10% 2 มม.) และ eluted มี 5 CV ล้างบัฟเฟอร์ประกอบด้วย lOOµg/ml 3 x เพปไทด์ธง โปรตีน eluted ถูกเพิ่มเติมบริสุทธิ์ผ่านการกรองเจลโดยใช้คอลัมน์ Superdex 200 16/60 (GE สุขภาพ) ทดสอบฟังก์ชันการทำงานกับ ELISA-เซลล์ที่ LDL-R ใช้เซลล์ HepG2[00151] สำหรับการเลือกและคัดมิวทีนไลโปคาลินน่าสนใจ hPCSK9 อาจจะ biotinylated ได้ hPCSK9 เป็น incubated กับมีเวลาเกินสบของรีเอเจนต์ EZ-ลิงค์ NHS• Chromogenic ไบโอติน (เทอร์โมวิทยาศาสตร์) 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ส่วนที่เกินของไบโอตินถูกเอาออก และ biotinylated โปรตีนเข้มข้น โดย ultrafiltration การทดสอบดึงลง Streptacin ยืนยัน biotinylation[00152] กำไรของฟังก์ชัน hPCSK9_D374Y mutant, cynomolgus PCSK9 และเมาส์PCSK9 ผลิต และลักษณะเดียวกัน[00153] ตัวอย่างที่ 2: สร้างการไลบรารี ด้วย 2xl010 อิสระไลโปคาลินมิวทีนและ phagemid มิวทีนไลโปคาลินกับ PCSK9[00154] A ไลบรารีสุ่มของ 2xl มิวทีนไลโปคาลิน 010 พลังงานมีความหลากหลายสูงถูกสร้างขึ้น โดยสุ่มการก่อกลายพันธุ์ของไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย (ดู เช่น W02007/107563) สำหรับตัวเลือกเฉพาะ PCSK9 ไลโปคาลินมิวทีน phagemids 2xl012 จากไลบรารีนี้ได้ incubated กับ 200 nM biotinylated humand / cynomolgus PCSK9 ประคำ paramagnetic ที่เคลือบ ด้วย neutravidin หรือ streptavidin ถูกใช้ในการจับสิ่งอำนวยความสะดวก PCSK9/phagemid ซึ่งต่อมาแยก ด้วยแม่เหล็ก Phagemids ผูกถูกลบ โดยการซักผ้าลูกปัดแปดเท่ากับ 1 ml phagemids PBS/ต. ผูกถูก eluted โดยคณะทันตแพทยศาสตร์ ด้วย triethylamine ก่อน แล้ว ด้วย 0.1 M glycine pH 2.2 รอบสี่ต่อเนื่องที่เลือกดำเนินการ [00155] เทปเซ็นทรัล mutagenized เตรียม phasmid ได้รับหลังจากที่เลือกแสดง phage ถูกแบ่งแยกย่อยอาหารเอ็นกับ BstXl และต่อมาฟอกผ่าน agarose เจ electrophoresis โดยใช้วิธีมาตรฐาน (Sambrook et al., (1989) โคลน: คู่มือปฏิบัติการ) ดีเอ็นเอถูกแทรกลงใน pTlcl เวกเตอร์ในทำนองเดียวกันตัด 0 ซึ่งทำให้แบคทีเรียผลิตมิวทีนภายใต้การควบคุมของ tetracyclin โปรโมเตอร์ เชี่ยวชาญ CaCh TG 1-F' เซลล์แตกต่างของผสมไข่ และชุบบนแผ่น ปอนด์/Amp แต่ละอาณานิคมถูกใช้ฉีด 2xYT/แอมป์ กลาง และปลูกข้ามคืน (14-18 h) กับระยะ ในเวลาต่อมา 50 µl 2xYT/แอมป์ inoculated จากวัฒนธรรมระยะเครื่องเขียน และ incubated สำหรับ h 3 ที่ 37° C และจากนั้น22° C จนถึง ODs9sof ที่ถึง 0.6-0.8 Anticalin ผลิตถูกเหนี่ยวนำ โดยเพิ่ม10 µl 2xYT/แอมป์ เสริม ด้วย 1.2 ไมโครกรัมเป็น เครื่อง/ml anhydrotetracyclin วัฒนธรรมถูก incubated ที่ 22° C จนถึงวันถัดไป วัฒนธรรมไม่พร้อมสำหรับการใช้ในการคัดกรอง assays หลังแห่ง µl 40 5% (w/v) บีเอสเอใน PBS/T และคณะทันตแพทยศาสตร์สำหรับ lh ที่ 25° C[00156] สำหรับการเลือกของมนุษย์ ไลโปคาลินมิวทีน และ cynomolgus PCSK9 (1 ไมโครกรัมเป็น เครื่อง/ml ใน PBS/T), ซึ่งทั้งหมดดำเนินธงแท็ก ถูกจับบน microtiterplates โดยใช้วิธีการป้องกัน-FLAG-แท็กแอนติบอดี (Aldrich ซิก St. Louis, MO) ที่ถูกเคลือบบนแผ่นวันก่อนที่จะ มีความเข้มข้นสุดท้ายของยูจี 5 ml ใน PBS แอนติบอดีต่อต้าน-Flag-แท็กเดียวทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมค่าลบ ในเวลาต่อมา 20 µl ของบีเอสเอบล็อควัฒนธรรมเพิ่ม และ incubated สำหรับ lh ที่ 25 องศาเซลเซียส มิวทีนผูกพบกับเจือจาง 1:10000 ของแอนติบอดีต้าน T7 กลวงกับเปอร์ออกซิเดสฮอร์สเรดิช ("HRP" ผล ดาร์มส) ใน PBS/ต. การนับ 20 µl QuantaBlu fluorogenic peroxidase พื้นผิวถูกเพิ่ม และวัดในการกระตุ้นความยาวคลื่น of320 nm และความยาวคลื่นการเล็ดรอดของ 430 nm[00157] ตัวอย่าง 3: รุ่นไลบรารีพ่อแม่ biased สำหรับเพิ่มประสิทธิภาพของมิวทีน PCSK9-specificไลโปคาลิน[00158] สำหรับเพิ่มประสิทธิภาพของมิวทีน PCSK9 เฉพาะที่ระบุจากไลบรารีไลโปคาลินในข้างบน 2 อย่าง ไลบรารีเพิ่มเติมตามไลโปคาลินมิวทีนลำดับ ID ไม่: 3 เลขรหัสลำดับ: 4 และเลขลำดับ ID: 7 (ปรโลก ชื่อ "ย่า clone(s)" ในตัวอย่างนี้), ตามลำดับ สร้างขึ้น ไลบรารีที่สร้างขึ้นในลักษณะที่นำไปสู่ randomisation บางส่วนของตำแหน่งที่เลือกเท่านั้น ทำการออกแบบที่ สำหรับแต่ละตำแหน่งที่เลือก กรดอะมิโนที่เข้ารหัสตรงกับกรดอะมิโนที่พบในโคลนแม่เกี่ยวข้องกับความน่าเป็น 70% แม้ว่าจะเป็นกรดอะมิโนแตกต่างกันกับความน่าเป็น 30% N จำนวนตำแหน่งเป้าหมายและ B เป็นความโน้มเอียง มีจำนวนแลกเปลี่ยนต่อโคลนสุดน่าเป็น N x (1-B) ตัวอย่างเช่น ถ้า 20 กรดอะมิโนตำแหน่งrandomised บางส่วน มีความโน้มเอียง 70% ในกรดอะมิโนของโคลนแม่ นี้จะทำไลบรารีของสายพันธุ์โดยเฉลี่ยประกอบด้วยหกกลายพันธุ์โดยรวมเมื่อเทียบ กับโคลนแม่ แต่ ในตำแหน่งเป้าหมายเท่านั้น อย่างไรก็ตาม ไม่ทั้งหมดของโคลนต้องแลกเปลี่ยน 6: ความถี่ของการกลายพันธุ์ต่อโคลนจะตามการแจกแจงทวินาม แสดงในรูป d. 11[00159] ประกอบเช่นไลบรารี โอลิโกนินิs ในปฏิกิริยาปฏิกิริยาลูกโซ่ ("PCR") เป็นพอลิเมอเรสประกอบซ้ำ (Stemmer et al., (1995) ยีน 164:49-53) ใช้ โอลิโกนินิs สร้างขึ้น โดยมาตรฐาน phosphoramidite เคมี (Beaucage et al., (1981) ทรงสี่หน้าปลาย Lett. 22 ปี 1859-62 Al. ร้อยเอ็ด McBride พญาไท (1983) 24245-8) ให้การเข้ารหัสของอคติ 70% เราได้คำนวณของผสมบวมสำหรับแต่ละตำแหน่งของ triplet นิวคลีโอไทด์แต่ละกรดอะมิโนมาตรฐาน 20 ตัวอย่าง ของผสมเข้าแถ มีความโน้มเอียงของ 70% และให้กรดอะมิโนต่าง ๆ ที่แตกต่างกันในส่วนที่เหลือ 30% จะถูกสร้างขึ้น โดยของผสมของ nucleoside phosphoramidite สร้างบล็อก "abc" ที่สอดคล้องกับของผสมไซโตซีน thymidine และ guaninidine 5%, 85% และอะดีละ b ตรงกับของผสมของไซโตซีน 85% และ 5% ของอื่น ๆ nucleosides แต่ละ และ c comesponds เพื่อของผสม guanidine 50% และ 50% thymidine (ดู Figure11)[00160] โดยใช้เทคโนโลยีที่อธิบายไว้ข้างต้น กล่าวว่า ไลบรารีตามลำดับ ID ไม่: 3 เลขรหัสลำดับ: 4 และเลขลำดับ ID: 7 ตามลำดับ สร้างขึ้น โดยซ้ำ PCR ต่อ มิวทีนไลโปคาลินสร้างถูกโคลน ด้วยสูงได้อย่างมีประสิทธิภาพเป็น phagemid เวกเตอร์หลักเป็นอธิบาย (ดู เช่น Kim et al., (2009) เจกำลังเค็ม Soc131(10):3565-76) ขนาดไลบรารีที่อยู่ในช่วงจาก 7xl09 กับสายพันธุ์ llxl09 ได้ไลบรารีจ้างในภายหลัง phage ส่ายกล้อง (ดู Example4) [00161]PCSK9 ตัวอย่างที่ 4: ตัวเลือก Phagemid มิวทีนไลโปคาลินให้เหมาะกับ [00162] สำหรับเลือกให้เหมาะเฉพาะ PCSK9 ไลโปคาลินมิวทีน 2 x 1012 phagemids จากไลบรารีที่อธิบายไว้ในตัวอย่างที่ 3 ใช้ Phagemids ถูกละลายใน PBS เสริม ด้วย 0.1% Tween-20 (v/v) (เช่น PBS/T), 50 มม. benzamidine และเคซีน 1% (w/v) เลือกมิวทีนไลโปคาลินกับแอฟฟินิตี้ที่เพิ่มขึ้น phagemids ได้ incubated กับโปรตีน ofbiotinylated PCSK9 ลดความเข้มข้นที่อยู่ในช่วงจาก$ 0.01 - 10 nM ในหลายกรณี phagemids ได้ incubated ที่ 65° C สำหรับ 10 นาทีเลือกมิวทีนด้วยทนความร้อนเพิ่มขึ้น บล็อก phagemids ได้ incubated ในนาทีที่ 40 กับโปรตีน biotinylated PCSK9 desthiobiotin 0.3 มม.ถูกเพิ่มไปยังโซลูชันการทำตำแหน่งผูก streptavidin ฟรี และบ่มเพาะวิสาหกิจได้อย่างต่อเนื่องสำหรับ 20 นาที ต่อมา บล็อก (1% (w/v) เคซีนใน PBS/T) และลูกปัด paramagnetic ที่การเคลือบ ด้วย streptavidin หรือ neutravidin เพิ่มสำหรับ 20 นาที PCSK9 phagemid คอมเพล็กซ์จับ ระบายออก Uncomplexed phagemids ถูกเอาออก โดยการซักผ้าลูกปัดแปดเท่ากับ 1 ml PBS/T โดย resuspension ตะกอนละเอียดตาม ด้วยชุดของลูกปัดด้วยแม่เหล็ก โดยเลือกมิวทีน k0ff ที่ลดราคาจะ ใช้โพรโทคอล้างเข้มงวดมากขึ้นโดยทำ 5 ล้างเพิ่มเติมขั้นตอนหลังจากรอบ 1, 10 หลังรอบ 2, 15 หลังจาก 3 รอบและ 20 หลังจากออกเป็น 4 รอบคอมเพล็กซ์มิวทีน PCSK9 ได้ incubated มียอดแตกต่างกัน (10 nM-5µM) of purified parental มิวทีน (e.g. SEQ ID NO: 3, 4 หรือ 7) to allow competition in PCSK9- binding between optimized and parental ไลโปคาลิน มิวทีน. Additionally, combinations of both methods were applied. Bound phagemids were first eluted with 300 µl 70 mM triethylamine for 10 min followed by immediate neutralization of the ส่วนลอย with 100 µl lM Tris-Cl pH 6.0. After one intermediate wash cycle remaining phagemids were eluted with 100 mM glycin pH 2.2 for 10 min followed by immediate neutralization with 50 µl 0.5 M Tris-base. Both elution :fractionswere pooled and used to infect 4 ml oflog-phase E. coli culture (OD5500.45-0.6) for reamplification. After incubation for 30 min under agitation bacteria were collected by centrifugation at 5000xg for 2 min, resuspended in 1 ml 2xYT medium an

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ตัวอย่างโวลต์[00149] ตัวอย่างที่ 1: การผลิตและลักษณะของรีคอมบิแนนต์ของมนุษย์PCSK9 และฮิวเมนกลายพันธุ์ PCSK9 [00150] ฮิวเมน PCSK9 (SEQ ID NO: 34) ที่มี C-tenninal แท็กธงได้แสดงออก ในเซลล์ transfected HEK293F 600ml ของเซลล์ transfected ได้รับการปลูกฝังใน DMEM / TS / 0.05% บีเอสเอเป็นเวลา 6 วันและส่วนลอยที่มี hPCSK9 หาย hPCSK9 ถูกผูกไว้กับธง M2 เรซินล้างด้วยบัฟเฟอร์ล้าง 50CV (lOmM ทริส / HCL pH7.4, 150ml โซเดียมคลอไรด์, 2mm CaCl2, กลีเซอรีน 10%) และมีบัฟเฟอร์ชะล้าง 5 CV มีlOOμg / ml 3x ธงเปปไทด์ โปรตีนชะบริสุทธิ์ต่อไปผ่านการกรองโดยใช้เจล Superdex 200 16/60 คอลัมน์ (GE Healthcare) ฟังก์ชั่นได้รับการทดสอบที่มีระดับ LDL-R เซลล์ ELISA โดยใช้เซลล์ HepG2. [00151] สำหรับการเลือกและการคัดกรองของไลโปคาลินมิวทีนที่น่าสนใจ hPCSK9 อาจจะไบโอติน hPCSK9 ถูกบ่มกับ 5 ครั้งส่วนที่เกินโมลของพลุกพล่าน EZ-Link •วิทยาสารไบโอติน (เทอร์โมวิทยาศาสตร์) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ส่วนเกินของไบโอตินจะถูกลบออกและโปรตีน biotinylated เป็นความเข้มข้นโดยกรอง ทดสอบ Streptacin เลื่อนลงได้รับการยืนยัน biotinylation. [00152] กำไรจากฟังก์ชั่นที่กลายพันธุ์ hPCSK9_D374Y ที่ PCSK9 cynomolgus และเมาส์PCSK9 มีการผลิตและลักษณะในทางเดียวกัน. [00153] ตัวอย่างที่ 2: การสร้างไลบรารีกับ 2xl010 อิสระไลโปคาลิ นมิวทีนและการเลือก phagemid ของไลโปคาลินมิวทีนกับ PCSK9 [00154] เป็นไลบรารีสุ่มของ 2xl 010 ไลโปคาลินมิวทีนที่มีความหลากหลายสูงที่สร้างขึ้นโดยการสุ่มการก่อกลายพันธุ์ของ ไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย (ดูตัวอย่างเช่น W02007 / 107563) สำหรับการเลือกของไล PCSK9 เฉพาะโปคาลินมิวทีน, 2xl012 phagemids จากไลบรารีนี้ถูกบ่มกับ 200 นาโนเมตร biotinylated humand และ / หรือ cynomolgus PCSK9 ลูกปัด paramagnetic เคลือบด้วย neutravidin หรือ streptavidin ถูกนำมาใช้ในการจับภาพเชิงซ้อน PCSK9 / phagemid ซึ่งต่อมาถูกแยกกับแม่เหล็ก phagemids หลุดถูกถอดออกโดยการล้างลูกปัดแปดครั้ง 1 มล. พีบีเอส / T phagemids Bound ถูกชะโดยการบ่มครั้งแรกกับ triethylamine แล้ว 0.1 M glycine ค่า pH 2.2 รอบสี่ติดต่อกันของการเลือกดำเนินการ. [00155] ที่ mutagenized เทปกลางของการเตรียมความพร้อม phasmid ได้รับหลังจากการเลือกการแสดงผลทำลายจุลินทรีย์ที่แยกได้จากการย่อยอาหารของดีเอ็นเอที่มี BstXl และการทำให้บริสุทธิ์ตามมาผ่าน agarose ข่าวคราวใช้วิธีการมาตรฐาน (Sambrook et al. ( 1989) โคลนโมเลกุล: คู่มือการตรวจทางห้องปฏิบัติการ) ดีเอ็นเอถูกแทรกเข้าไปก็ตัดเวกเตอร์ pTlcl 0 ซึ่งจะช่วยให้การผลิตแบคทีเรียของมิวทีนภายใต้การควบคุมของ tetracyclin โปรโมเตอร์ Cach อำนาจ-TG-F 1 เซลล์ถูกเปลี่ยนด้วย ligation ของผสมและชุบใน LB / แผ่นแอมป์ อาณานิคมส่วนบุคคลถูกนำมาใช้ในการฉีดวัคซีนกลาง 2xYT / แอมป์และเติบโตขึ้นในชั่วข้ามคืน (14-18 ชั่วโมง) เพื่อเฟส ต่อมา 50 ไมโครลิตร 2xYT / แอมป์ถูกเชื้อจากวัฒนธรรมเฟสและบ่มเป็นเวลา 3h ที่ 37 องศาเซลเซียสและจากนั้นขยับไปที่ 22 องศาเซลเซียสจน ODs9sof 0.6-0.8 ก็มาถึง การผลิต Anticalin ถูกชักนำโดยนอกเหนือจาก10 ไมโครลิตร 2xYT / แอมป์เสริมด้วย 1.2 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร anhydrotetracyclin วัฒนธรรมที่ถูกบ่มที่ 22 องศาเซลเซียสจนกระทั่งวันรุ่งขึ้น หลังจากที่นอกเหนือจาก 40 ไมโครลิตร 5% (w / v) บีเอสเอในพีบีเอส / T และบ่มสำหรับ lh ที่ 25 ° C วัฒนธรรมที่มีความพร้อมสำหรับการใช้งานในการตรวจคัดกรอง. [00156] สำหรับการเลือกของไลโปคาลินมิวทีน , PCSK9 มนุษย์และ cynomolgus (1 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรในพีบีเอส / T) ซึ่งทั้งหมดถือธงแท็กถูกจับใน microtiterplates โดยวิธีการของแอนติบอดีต่อต้านธงแท็ก (ซิกม่าดิช, เซนต์หลุยส์) ซึ่งเป็น เคลือบบนจานวันก่อนที่จะมีความเข้มข้นสุดท้ายของ 5 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรในพีบีเอส แอนติบอดี Anti-Flag แท็กคนเดียวที่ทำหน้าที่เป็นผู้ควบคุมเชิงลบ ต่อมา 20 ไมโครลิตรของวัฒนธรรม BSA-บล็อกมีการเพิ่มและบ่มเป็นเวลา lh ที่ 25 ° C Bound มิวทีนที่ตรวจพบกับที่ 1: 10000 ลดสัดส่วนของแอนติบอดีต่อต้าน T7 ผันกับฮอร์สเรดิชเปอร์ออกซิเดส ("HRP" เมอร์คเคจีเอเอ Darmstadt) ในพีบีเอส / T สำหรับปริมาณ 20 ไมโครลิตร QuantaBlu พื้นผิว peroxidase แจงถูกบันทึกและวัดที่ความยาวคลื่นกระตุ้น of320 นาโนเมตรและความยาวคลื่นปล่อย 430 นาโนเมตร. [00157] ตัวอย่างที่ 3: การสร้างของการเจริญเติบโตลำเอียงไลบรารีสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพของไลPCSK9 เฉพาะโปคาลิน มิวทีน[00158] สำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพของ PCSK9 เฉพาะมิวทีนระบุจากไลโปคาลินไลบรารีในข้างต้นตัวอย่างที่ 2 เพิ่มเติมไลบรารีบนพื้นฐานของไลโปคาลินมิวทีน SEQ ID NO: 3, ID SEQ NO: 4 และ SEQ ID NO: 7 (ต่อจากนี้ในชื่อ "โคลนแม่ (s)" ในตัวอย่างนี้) ตามลำดับถูกสร้างขึ้น ไลบรารีถูกสร้างขึ้นในลักษณะที่นำไปสู่การสุ่มบางส่วนของตำแหน่งที่เลือกเท่านั้น การออกแบบที่ได้รับการทำเช่นนั้นสำหรับแต่ละตำแหน่งที่เลือกให้กรดอะมิโนที่เข้ารหัสสอดคล้องกับกรดอะมิโนที่พบในโคลนแม่นั้นกับความน่าจะเป็น 70% ในขณะที่มันอาจจะเป็นกรดอะมิโนที่แตกต่างกับความน่าจะเป็น 30% กับไม่มีจำนวนตำแหน่งที่ตรงเป้าหมายและ B เป็นอคติจำนวนน่าจะเป็นที่สุดของการแลกเปลี่ยนต่อโคลนคือไม่มี x (1-B) ตัวอย่างเช่นถ้า 20 ตำแหน่งกรดอะมิโนที่สุ่มบางส่วนมีอคติ70% ตามปริมาณกรดอะมิโนของโคลนแม่นี้จะมีผลในไลบรารีของการกลายพันธุ์โดยเฉลี่ยที่มีหกกลายพันธุ์เมื่อเทียบโดยรวมโคลนแม่ แต่ในตำแหน่งเป้าหมาย เท่านั้น แต่ไม่ทั้งหมดของโคลนจะมีหกแลกเปลี่ยนความถี่ของการกลายพันธุ์ต่อโคลนจะเป็นไปตามการกระจายทวินามเป็นที่ปรากฎในรูป 11 D. [00159] เพื่อประกอบไลบรารีดังกล่าวประกอบเวียนเกิดของโอลิโกนินิ s ใน วิธี polymerase chain reaction ("PCR") ปฏิกิริยา (Stemmer, et al (1995) ยีน 164:. 49-53) ถูกนำมาใช้ โอลิโกนินิ s จะถูกสร้างโดยเคมี phosphoramidite มาตรฐาน (Beaucage, et al (1981) จัตุรมุขเลทท์ 22 1859-1862.... ไบรด์, et al (1983) จัตุรมุขเลทท์ 24 245-8) ที่จะช่วยให้การเข้ารหัสของอคติ 70% เราได้คำนวณการเพิ่มประสิทธิภาพของผสมสำหรับแต่ละตำแหน่งของแฝดเบื่อหน่ายสำหรับแต่ละ20 กรดอะมิโนที่ยอมรับ ยกตัวอย่างเช่นของผสมการเข้ารหัสซีรีนที่มีอคติ 70% และช่วยให้กรดอะมิโนที่แตกต่างกันในส่วนที่เหลืออีก 30% จะถูกสร้างขึ้นโดยของผสมของหน่วยการสร้าง phosphoramidite nucleoside "abc" ที่สอดคล้องกับของผสมของ 85% thymidine และ 5% guaninidine, ไซโตซีนและอะดีโนซีนแต่ละขสอดคล้องกับของผสมจาก 85% ไซโตซีนและ 5% ของ nucleosides อื่น ๆ ในแต่ละครั้งและค comesponds ไปของผสมของ guanidine 50% และ thymidine 50% (ดู Figure11). [00160] โดยใช้เทคโนโลยีที่อธิบายข้างต้นกล่าวว่าขึ้นอยู่กับไลบรารี SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 และ SEQ ID NO: 7 ตามลำดับถูกสร้างขึ้นโดยวิธี PCR recursive ต่อจากนั้นสร้างไลโปคาลินมิวทีนถูกโคลนสูงได้อย่างมีประสิทธิภาพเป็น phagemid เวกเตอร์เป็นหลักตามที่อธิบายไว้ (ดูตัวอย่างเช่นคิม, et al, (2009) J Am Chem Soc. 131 (10): 3565 -76) ขนาดไลบรารีตั้งแต่ 7xl09 เพื่อ llxl09 กลายพันธุ์ ไลบรารีที่ถูกใช้ในการปรากฎตัวทำลายจุลินทรีย์ที่ตามมา (ดู Example4). [00161] PCSK9 ตัวอย่างที่ 4: Phagemid การเลือกของที่ดีที่สุดไลโปคาลินมิวทีนกับ[00162] สำหรับการเลือกของที่ดีที่สุด PCSK9 เฉพาะไลโปคาลินมิ วทีน, 2x1012 phagemids จากไลบรารีที่อธิบายไว้ในตัวอย่างที่ 3 ถูกนำมาใช้ Phagemids ถูกกลืนหายไปในพีบีเอสเสริมด้วย 0.1% Tween-20 (v / v) (เช่นพีบีเอส / T) 50 มิลลิ benzamidine และ 1% (w / v) เคซีน ในการเลือกไลโปคาลินมิวทีนที่เพิ่มขึ้นกับแอฟฟินิตี้, phagemids ถูกบ่มที่มีความเข้มข้นลดลง ofbiotinylated PCSK9 โปรตีนที่อยู่ระหว่าง 0.01-10 นาโนเมตร ในหลายกรณี phagemids ถูกบ่มที่ 65 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีเพื่อเลือกสำหรับมิวทีนที่เพิ่มขึ้นกับความร้อนความอดทน phagemids บล็อคถูกบ่มเป็นเวลา 40 นาทีกับโปรตีน PCSK9 biotinylated ก่อน 0.3 มิลลิ desthiobiotin ถูกบันทึกอยู่ในการแก้ปัญหาที่จะเปียกโชก streptavidin ฟรีผูกพันตำแหน่งและการบ่มได้อย่างต่อเนื่องเป็นเวลา 20 นาที ต่อมาถูกบล็อก (1% (w / v) เคซีนในพีบีเอส / T) และเนื้อลูกปัด paramagnetic ที่ถูกเคลือบทั้งที่มี streptavidin หรือ neutravidin ถูกเพิ่มสำหรับ 20 นาทีในการจับภาพเชิงซ้อน PCSK9-phagemid phagemids Uncomplexed ถูกถอดออกโดยการล้างลูกปัดแปดครั้ง 1 มล. พีบีเอส / T โดย resuspension อย่างละเอียดตามด้วยคอลเลกชันของลูกปัดที่มีแม่เหล็ก เลือกเฉพาะมิวทีนที่มีอัตราการลดลง k0ff ทั้งโปรโตคอลล้างที่เข้มงวดมากขึ้นถูกนำมาใช้โดยการดำเนินการ5 ขั้นตอนล้างเพิ่มเติมหลังจากรอบที่ 1, 10 หลังจากรอบที่ 2, 15 หลังจากรอบที่ 3 และ 20 หลังจากรอบ 4 หรือมิวทีน -PCSK9 คอมเพล็กซ์ถูกบ่มด้วยจำนวนเงินที่แตกต่างกัน (10 nM- 5 ไมครอน) ของบริสุทธิ์ผู้ปกครองมิวทีน (เช่น SEQ ID NO: 3, 4 หรือ 7) เพื่อให้การแข่งขันใน PCSK9- ผูกพันระหว่างผู้ปกครองที่ดีที่สุดและไลโปคาลินมิว ทีน นอกจากนี้การรวมกันของทั้งสองวิธีถูกนำไปใช้ phagemids Bound ถูกชะครั้งแรกกับ 300 ไมโครลิตร 70 มิลลิ triethylamine เป็นเวลา 10 นาทีตามด้วยการวางตัวเป็นกลางทันทีส่วนลอย 100 ไมโครลิตร LM Tris-Cl ค่า pH 6.0 หลังจากหนึ่งวงจรล้างกลาง phagemids ที่เหลือถูกชะด้วย 100 มิลลิ glycin ค่า pH 2.2 เป็นเวลา 10 นาทีตามด้วยการวางตัวเป็นกลางทันทีที่มี 50 ไมโครลิตร 0.5 M Tris ฐาน ทั้งสองชะ: fractionswere รวบรวมและใช้ในการติดเชื้อ 4 มล. oflog เฟสอีโคไลวัฒนธรรม (OD550 0.45-0.6) สำหรับ reamplification หลังจากการบ่มเป็นเวลา 30 นาทีภายใต้แบคทีเรียกวนถูกเก็บรวบรวมโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 5000xg เป็นเวลา 2 นาที, resuspended ใน 1 มิลลิลิตรกลาง 2xYT

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

โวลต์ตัวอย่าง


[ 00149 ] ตัวอย่าง 1 : การผลิตและการหาลักษณะเฉพาะของรีคอมบิแนนต์มนุษย์

pcsk9 ฮิวเมนกลายพันธุ์และ pcsk9

[ ] ฮิวเมน 00150 pcsk9 ( seq id : 34 ) ประกอบด้วยแท็กธง c-tenninal ถูกแสดงใน transfected hek293f เซลล์ ของ transfected 600ML เซลล์ปลูกใน dmem / TS / 0.05 % BSA เป็นเวลา 6 วัน และส่วนลอยที่มี hpcsk9 ถูกกู้คืนhpcsk9 ถูกธง M2 เรซิน ล้างด้วย 50cv ล้างบัฟเฟอร์ ( lomm บริษัท ph7.4 ล้างหน้าขาว , เกลือ , 2mm CaCl2 , 10% กลีเซอรอล ) และตัวอย่างที่มี 5 CV ล้างบัฟเฟอร์ที่มีลูµ g / ml 3x ธงเปปไทด์ . ตัวอย่างของโปรตีนบริสุทธิ์ที่ผ่านการกรองจากเจลใช้ superdex 200 16 / 60 คอลัมน์ ( GE Healthcare ) ฟังก์ชันการทดสอบกับเซลล์มะเร็งตับ ldl-r ELISA โดยใช้เซลล์ .

[ 00151 ] สำหรับการเลือกและการไลโปคาลินมิวทีนของดอกเบี้ย hpcsk9 อาจไล . hpcsk9 ถูกบ่มกับ 5 ครั้งโดยส่วนเกินของอีซี่ลิงค์ NHS - การสนทนาผ่านข้อความโต้ตอบแบบทันที biotin Reagent ( เทอร์โมวิทยาศาสตร์ ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิห้อง ส่วนเกินของไบโอตินจะถูกลบออกและไลโปรตีนเข้มข้น โดยผสม .เป็น streptacin ทั้งการทดสอบยืนยัน biotinylation

[ เวลา ] ได้รับของฟังก์ชัน hpcsk9_d374y กลายพันธุ์ cynomolgus , pcsk9 และเมาส์

pcsk9 ถูกผลิต และลักษณะ ในลักษณะเดียวกัน


[ 00153 ] ตัวอย่างที่ 2 : รุ่นของไลบรารีกับ 2xl010 อิสระไลโปคาลินมิวทีนและเลือก phagemid ของไลโปคาลินมิวทีนกับ pcsk9

[ 00154 ] ไลบรารีสุ่มของ 2XL 010 ไลโปคาลินมิวทีนที่มีความหลากหลายมากที่ถูกสร้างขึ้นโดยการก่อกลายพันธุ์สุ่มของไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย ( ดู ตัวอย่าง w02007 / 107563 ) สำหรับการเลือก pcsk9 เฉพาะมิวทีนไลโปคาลิน ,2xl012 phagemids จากไลบรารีนี้ถูกบ่มกับ 200 nm ไล humand และ / หรือ cynomolgus pcsk9 . พาราแมกเนติกลูกปัดเคลือบด้วย neutravidin ค็อค streptavidin ถูกจับ pcsk9 / phagemid เชิงซ้อนซึ่งต่อมาแยกด้วยแม่เหล็ก หลุด phagemids ออกซักเม็ด 8 ครั้งกับ 1 ml PBS / ต.phagemids ถูกผูกโดยการบ่มตัวอย่างแรกกับไตรเอตทิลามีนและ 0.1 M glycine pH 2.2 . สี่นัดติดต่อกันของการเลือกแสดง .
[ 00155 ] mutagenized กลางเทปของเฟสมิดเตรียมตัวรับหลังจากเลือกฟาจได้โดยการย่อย DNA และเอนไซม์บำบัดน้ำเสีย ตามมาด้วย bstxl ผ่านเจล ( ใช้วิธีมาตรฐาน ( sambrook et al . , ( 1989 ) การโคลน : ปฏิบัติการคู่มือ )ดีเอ็นเอที่ใส่เข้าไปในทำนองเดียวกันตัดเวกเตอร์ ptlcl 0 ซึ่งช่วยให้การผลิตแบคทีเรียของมิวทีนภายใต้การควบคุมของเตตราไซคลินโปรโมเตอร์ . และพนักงานเจ้าหน้าที่ TG 1-f ' เซลล์ถูกเปลี่ยนด้วยของผสม Ligation และชุบบนปอนด์ ) แผ่น อาณานิคมบุคคลเคยฉีดวัคซีน 2xyt / แอมป์ขนาดกลาง และปลูกในชั่วข้ามคืน ( 14-18 H ) เฟสอยู่กับที่จำนวน 50 µผม 2xyt / แอมป์เป็นหัวเชื้อจากวัฒนธรรมระยะ stationary บ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 3 และจากนั้นย้ายไป
22 ° C จนกระทั่ง ods9sof 0.6-0.8 ครบ anticalin การผลิตการเพิ่ม

10 µผม 2xyt / แอมป์เสริม 1.2 µ g / ml anhydrotetracyclin . วัฒนธรรมที่อุณหภูมิ 22 องศา C จนถึงวันถัดไปหลังจากเพิ่ม 40 µ L 5 % ( w / v ) BSA ใน PBS / T และบ่มที่อุณหภูมิ 25 ° C ลวัฒนธรรมพร้อมสำหรับใช้ตรวจคัดกรอง 00156

[ ] เพื่อเลือกไลโปคาลินมิวทีน cynomolgus , มนุษย์และ pcsk9 ( 1 µ g / ml ใน PBS / T ) ซึ่ง ทุกคนถือธงป้าย , ถูกจับใน microtiterplates โดยวิธีการป้องกันป้ายธงแอนติบอดี ( ซิกม่า Aldrich เซนต์ หลุยส์โม ) ซึ่งเคลือบบนแผ่นวันก่อนที่มีความเข้มข้นสุดท้าย 5 ug / ml ใน PBS ป้ายธงแอนติบอดีต่อต้านคนเดียวทำหน้าที่ควบคุมลบ จำนวน 20 µ L ขนาดของบล็อก วัฒนธรรมถูกเพิ่มโดยเฉลี่ยที่ 25 ° C มิวทีนพบผูกพันกับเจือจาง 1 : 10 , 000 anti-t7 แอนติบอดี conjugated กับฮอร์สเรดิชเปอร์ออกซิเดส ( " HRP "กระตุ้นการทดาร์มสตัดท์ ) , ใน PBS / T . สำหรับปริมาณ 20 µผม quantablu fluorogenic peroxidase ( เพิ่มและวัดที่ความยาวคลื่นกระตุ้น of320 nm และปล่อยความยาวคลื่น 430 nm .

[ 00157 ] ตัวอย่าง 3 : รุ่นของลำเอียงวุฒิภาวะไลบรารีสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพของ pcsk9 เฉพาะ




ไลโปคาลินมิวทีน