2.11. PCR-DGGE analysis of total ba

2.11. PCR-DGGE analysis of total bacteria
The three replicate DNA extracted from a combination of three
replicates were separately analyzed by PCR-DGGE. PCR amplification of the variable region of the bacterial 16S rRNA was performed
with the universal bacterial primers PBR338F with a GC clamp and
PBR518R[30].
DGGE analyses were conducted using a D-Code Universal
Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA). Twenty
microliter PCR product samples with 5ml of loading dye were
loaded into wells of an 8% polyacrylamide gel (acrylamide:bisacrylamide 37.5:1) containing a gradient of 40e60% denaturants (a
100% denaturant concentration was defined as 7 M urea and 40% v/
v deionized formamide). Electrophoresis was performed in 1TAE
buffer at 60

C with a constant voltage of 80 V for 16 h. The gel was
visualized by silver staining and scanned using a scanner (Epson
perfection v33, Seiko Epson Corporation, Japan). Strengthened intensity DGGE bands from the BIO treatment were excised and
sequenced, as described by Lang et al. (2012)[11].
The DGGE images were analyzed by the Quantity One software
program (Version 4.6.3, Bio-Rad Laboratories) for band detection
and intensity. Cluster analysis was determined by the UPGMA algorithm (Quantity One Version 4.6.3, Bio-Rad Laboratories). The
ShannoneWiener diversity index (H) was calculated using the
formula:H¼
P
pi lnpi ¼
P
(ni/N)ln(ni/N), wherepi is the ratio
between the number of bands in a specific group and the total
number,ni was the intensity of a band andNwas the sum of all
band intensities in the densitometry profile [11]

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.11 การวิเคราะห์แบคทีเรียรวม PCR-DGGEสามการจำลองดีเอ็นเอที่สกัดจากการรวมกันของสามเหมือนกับถูกแยกวิเคราะห์ โดย PCR DGGE PCR ขยายของขอบเขตตัวแปรของแบคทีเรีย 16S rRNA ทำกับที่สากลแบคทีเรียไพรเมอร์ PBR338F กับคีมหนีบ GC และPBR518R [30]DGGE วิเคราะห์ได้ดำเนินการใช้สากลรหัส Dระบบตรวจสอบ (ห้องปฏิบัติการชีวภาพ Rad เฮอร์คิวลิส สหรัฐอเมริกา) 20ตัวอย่างผลิตภัณฑ์ PCR ไมโครลิตร ด้วย 5ml ของการโหลดย้อมได้โหลดลงในบ่อของเจ polyacrylamide เป็น 8% (acrylamide:bisacrylamide 37.5:1) ที่ประกอบด้วยการไล่ระดับสีของ 40e60% denaturants (a100% ความเข้มข้น denaturant ถูกกำหนดเป็น 7 M urea และ 40% v /v deionized formamide) ทำ electrophoresis ในเต้ 1บัฟเฟอร์ที่ 60C กับแรงดันไฟฟ้าคงที่ 80 V สำหรับ 16 h เจมีvisualized โดยซิลเวอร์ย้อมสี และสแกนโดยใช้สแกนเนอร์ (Epsonสมบูรณ์แบบ v33, Seiko Epson Corporation ญี่ปุ่น) ความเข้มแข็งความเข้ม DGGE วงจากการรักษาทางชีวภาพถูก excised และเรียงลำดับ ตามที่อธิบายไว้โดยทองหลาง et al. (2012) [11]มีวิเคราะห์ภาพ DGGE ซอฟต์แวร์ปริมาณหนึ่งโปรแกรม (รุ่น 4.6.3 ห้องปฏิบัติการชีวภาพ Rad) สำหรับการตรวจหาวงดนตรีและความเข้ม แบ่งได้ตามขั้นตอนวิธี UPGMA (ปริมาณหนึ่ง 4.6.3 ห้องปฏิบัติการชีวภาพ Rad) ที่มีคำนวณโดยใช้ดัชนีความหลากหลาย ShannoneWiener (H)สูตร: H¼Pพี่ lnpi ¼P(ni/N)ln(ni/N), wherepi เป็นอัตราส่วนระหว่างจำนวนวงดนตรีเฉพาะกลุ่มและผลรวมหมายเลข ni มีความเข้มของ andNwas วงผลรวมทั้งหมดวงการปลดปล่อยก๊าซในโปรไฟล์ densitometry [11]

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.11 PCR-DGGE
วิเคราะห์ของเชื้อแบคทีเรียรวมดีเอ็นเอซ้ำสามสกัดจากการรวมกันของสามซ้ำถูกนำมาวิเคราะห์โดยแยก
PCR-DGGE ขยาย PCR ของภูมิภาคตัวแปรของแบคทีเรีย 16S rRNA
ได้ดำเนินการกับไพรเมอร์ของแบคทีเรียสากลPBR338F กับยึด GC และ
PBR518R [30].
DGGE วิเคราะห์ได้ดำเนินการโดยใช้
D-รหัสสากลระบบตรวจจับ(ห้องปฏิบัติการ Bio-Rad ดาว, สหรัฐอเมริกา ) ยี่สิบไมโครลิตรตัวอย่างผลิตภัณฑ์ PCR กับ 5ml ของสีย้อมโหลดถูกโหลดลงในหลุมของเจลอะคริเลต8% (ริลาไมด์: bisacrylamide 37.5: 1) ที่มีความลาดชัน 40e60% denaturants (เป็นความเข้มข้นdenaturant 100% ได้รับการกำหนดให้เป็น 7 M ยูเรียและ 40% v / วีปราศจากไอออน formamide) อิเล็กได้รับการดำเนินการใน 1 TAE บัฟเฟอร์ที่ 60? C ที่มีแรงดันไฟฟ้าคงที่ของ 80 V 16 ชั่วโมง เจลได้รับการมองเห็นโดยการย้อมสีเงินและสแกนโดยใช้สแกนเนอร์ (Epson สมบูรณ์แบบ V33, เอปสันคอร์ปอเรชั่นประเทศญี่ปุ่น) วงดนตรีที่มีความเข้มแข็ง DGGE ความรุนแรงจากการรักษา BIO ถูกตัดและลำดับขั้นตอนตามที่อธิบายแลงet al, (2012) [11]. ภาพ DGGE วิเคราะห์ซอฟแวร์จำนวนหนึ่งโปรแกรม(เวอร์ชั่น 4.6.3 ห้องปฏิบัติการ Bio-Rad) สำหรับการตรวจสอบวงและความรุนแรง การวิเคราะห์กลุ่มถูกกำหนดโดยขั้นตอนวิธี UPGMA (จำนวนหนึ่งเวอร์ชั่น 4.6.3, Bio-Rad ห้องปฏิบัติการ) ดัชนีความหลากหลาย ShannoneWiener (H) ที่คำนวณโดยใช้สูตร: H¼ P ปี่ lnpi ¼? P (พรรณี / N) LN (พรรณี / N) wherepi คืออัตราส่วนระหว่างจำนวนของวงดนตรีที่อยู่ในกลุ่มที่เฉพาะเจาะจงและรวมจำนวน, พรรณีเป็นความเข้มของวงดนตรีที่ andNwas ผลรวมของทุกเข้มวงในรายละเอียดความหนาแน่น[11]

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.11 . วิเคราะห์จุลินทรีย์ทั้งหมดดีเอ็นเอ 9 แถบบ่งชี้
3 จำลองดีเอ็นเอที่สกัดได้จากการรวมกันของ 3
ซ้ำถูกแยกวิเคราะห์ดีเอ็นเอ 9 แถบบ่งชี้ . โดยการเพิ่มตัวแปรเขตของ 16S rRNA เชื้อทำการ
กับไพรเมอร์ pbr338f กับแบคทีเรียสากลยึด GC
pbr518r [ 30 ] .
การทดลองวิเคราะห์การใช้ d-code สากล
ระบบตรวจจับ ( ไบโอ ราดห้องปฏิบัติการ , Hercules , USA ) 20 ไมโครลิตร PCR ตัวอย่างด้วย

สี 5ml โหลดถูกโหลดลงในหลุมที่ 8 % สารเจลอะคริลาไมด์ : bisacrylamide 37.5:1 ) ที่มีการไล่ระดับของ 40e60 % denaturants ( สมาธิทำให้ผิดธรรมชาติเป็น
100% ได้ เช่น 7 M ยูเรียและ 40 % V /
V คล้ายเนื้อเยื่อประสาน Formamide ) วิธีแสดงในบัฟเฟอร์แท
1  ที่ 60

องศาเซลเซียส แรงดันคงที่ 80 V 16 ชั่วโมง เจลคือ
มองเห็นโดยเงิน staining และสแกนโดยใช้เครื่องสแกน ( Epson Perfection v33
, Seiko Epson Corporation , Japan ) มีการทดลองรักษาความเข้มวงดนตรีจากไบโอ ถูกตัดและ
ลำดับตามที่อธิบายไว้โดย Lang et al . ( 2012 ) [ 11 ] .
ภาพการทดลองวิเคราะห์โดยปริมาณหนึ่งโปรแกรมซอฟต์แวร์ ( รุ่น 4.6.3
,ห้องปฏิบัติการราดไบโอ )
ตรวจสอบวงดนตรีและความเข้ม การวิเคราะห์กลุ่มถูกกำหนดโดยวิธี UPGMA ( ปริมาณรุ่นหนึ่ง 4.6.3 ห้องปฏิบัติการราดไบโอ )
shannonewiener ดัชนีความหลากหลาย ( H ) คำนวณได้โดยใช้สูตร¼ 

: H p
pi lnpi ¼ 
P
( N / n ) ( N / n ) คือ อัตราส่วนระหว่าง wherepi
จำนวนแถบของกลุ่มที่เฉพาะเจาะจงและจำนวน
,ฉันคือความเข้มของวง andnwas ผลรวมของความเข้ม
วงดนตรีทั้งหมดใน densitometry โปรไฟล์ [ 11 ]