1. IntroductionU.S. fuel ethanol pr

1. Introduction
U.S. fuel ethanol production exceeded 13 billion gals in 2014,
with most production based on conventional yeast fermentation
of starch from the dry-grind processing of corn (ethanol.rfa.org).
Fermentations are not conducted under pure culture conditions,
and chronic microbial contamination is considered normal
(Connolly, 1999; Beckner et al., 2011). Nevertheless, contamination
can reduce the efficiency of ethanol production and even result in
‘‘stuck’’ fermentations, requiring costly shutdowns for cleaning
(Bischoff et al., 2009; Muthaiyan et al., 2011; Khullar et al.,
2013). Despite the economic importance of microbial contamination,
relatively few studies have attempted to define the problem
under production conditions. Skinner and Leathers (2004) reported
that lactic acid bacteria, and particularly Lactobacillus sp., were
endemic in fuel ethanol plants. Subsequently, fuel ethanol contaminants
were shown to form biofilms under laboratory conditions
(Skinner-Nemec et al., 2007). Pure cultures of contaminants
showed strain-specific variability in the capacity to form biofilms
(Rich et al., 2011). Biofilms are difficult to remove by cleaning
and are generally considered to be resistant to antimicrobial agents
(Stewart et al., 2004). Fuel ethanol production facilities have many
sites that are difficult to adequately clean, such as heat exchangers
and dead-end pipes, and biofilm growth could explain the persistence
of bacterial contamination. Bischoff et al. (2009) developed
a model system for evaluating contaminants, and demonstrated
that different strains of the same species vary in their capacity toinhibit yeast fermentations of corn mash. This suggests that many
strains may be innocuous, or even beneficial as part of a healthy
microflora that excludes or controls harmful strains. Given the
scarcity of relevant field data, a longitudinal survey of a
dry-grind, corn-based fuel ethanol plant was carried out over a
two year period. Contaminants were isolated from multiple collection
sites in the plant, identified, and characterized for their ability
to form biofilms and inhibit ethanol fermentation.
2. Methods
2.1. Isolation and identification of bacterial contaminants
Samples collected from a Midwestern dry-grind fuel ethanol
plant were serially diluted in phosphate buffered saline and spread
on plates containing MRS medium (Difco Becton Dickinson, Sparks,
MD) with 0.001% (w/v) cycloheximide added to suppress yeast
growth (Skinner and Leathers, 2004). Cultures were incubated
anaerobically at 37 C using the Mitsubishi AnaeroPack system
(Thermo Fisher Scientific, Pittsburg PA) or the GasPak EZ System
(Becton Dickinson) and strains were purified twice as single colonies
and stored at 80 C in 40% (v/v) glycerol in 96-well microtiter
plates.
Strains were identified by sequencing of 16S rRNA genes via
polymerase chain reaction using 16Sf (50
-GAGAGTTTGATYCTGGC
TCAG) and 16Sr (50
-GAAGGAGGTGWTCCARCCGCA) primers as previously
described (Whitehead and Cotta, 2001). The resulting products
(about 1.6 kbp) were purified using a 5 Prime PCR purification
kit, and sequenced by standard methods using the forward primer.
The sequences obtained were compared with sequences in the
GenBank database using BLASTN program (Altschul et al., 1997)
at the National Center for Biotechnology Information (http://
blast.ncbi.nlm.nih.gov/).
2.2. Biofilm formation
Biofilm formation was measured using a rapid microtiter plate
assay as previously described (Rich et al., 2011). Isolates stored
in 96-well microtiter plates were replicated onto Omnitray plates
with MRS (Thermo Scientific, Rochester, NY) using a sterile
96-pin replicator lid (Nunc, Denmark, oxidized polystyrene).
Omnitray plates were incubated for 48 h under anaerobic conditions
at 37 C, and colonies were transferred to fresh Omnitray
plates and grown for an additional 48 h. A 96 well master microtiter
plate (Nunc) was prepared containing 150 lL of MRS in each
well. The master plate was inoculated with colonies from the
Omnitray using a replicator lid and the plate was incubated for
48 h under anaerobic conditions at 37 C. After 48 h, cells were agitated
and a new lid was dipped into the cells and transferred to a
new plate which was incubated for 48 h, corresponding to the static
attachment phase of a conventional biofilm reactor. Lids were
transferred to fresh plates (time point zero) and subsequently
transferred every 48 h until the assay endpoint at 144 h. Analysis
of the biofilm formation was performed as previously described
(Rich et al., 2011). Replicator lid pins were stained with a 0.1% crystal
violet solution for 30 min at room temperature, and destained
with 95% ethanol. The amount of crystal violet staining, representing
biofilm growth, was measured at 600 nm using a SpectraMax
M5 microtiter plate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
2.3. Inhibition of ethanol production
Biofuel contaminants were assayed for inhibition of ethanol
fermentation of corn mash using a model system (Bischoff et al.,
2009). Isolates recovered from 96-well microtiter plates were
grown anaerobically for two days on solid MRS medium, then
transferred individually into sterile 15 mL tubes containing 5 mL
MRS liquid medium and incubated without shaking for 24 h at
37 C. Preinocula of Saccharomyces cerevisiae strain NRRL Y-2034
were grown in 300 mL Erlenmeyer flasks with 75 mL yeast peptone
(YP) media supplemented with 5% (w/v) dextrose at 32 C and
200 rpm for 24 h. Yeast and bacterial cells were harvested by centrifugation
at 4000g, 4 C for 15 min and resuspended in phosphate
buffered saline to an OD600 of 80 and 8 for the yeast and bacteria,
respectively.
Liquefied corn mash was obtained from a commercial dry-grind
ethanol facility and stored in 4 L aliquots at 20 C. Model
fermentations were in duplicate 40 mL cultures in 50 mL flasks,
containing corn mash (33% solids) supplemented with 0.12%
(w/v) ammonium sulfate and 0.05% (v/v) glucoamylase (Optidex
L-400, Genencor International Inc., Rochester, NY). Cultures were
inoculated with 0.5 mL of diluted yeast and bacterial preinocula,
equivalent to final concentrations of 6  107 yeast cells/mL and
1  107 bacterial cells/mL. Sterile saline (0.5 mL) served as a negative
control in place of a bacterial challenge. Isolate BR0315-1
Lactobacillus fermentum was used as a positive control challenge
for a ‘‘stuck’’ fermentation in each batch (Bischoff et al., 2009).
Flasks were capped with a vented rubber stopper and incubated
at 32 C and 100 rpm for 72 h.
For analysis, cultures were clarified by centrifugation and
supernatants were diluted 10-fold with ddH2O. Ethanol, glucose,
lactic acid, and acetic acid were determined by high performance
liquid chromatography using a 300 mm Aminex HPX 87H column
(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) on a HP 1100 Series
HPLC system equipped with a refractive index detector (Agilent
Technologies, Santa Clara, CA). Samples (10 ll) were injected onto
the column at 65 C and eluted with a 5 mM H2SO4 mobile phase at
0.6 mL/min.
3. Results and discussion
3.1. Occurrence and distribution of contaminants
The dry-grind ethanol process involves milling, liquefaction,
saccharification, fermentation, and distillation (Kelsall and Lyons,
1999; Kwiatkowski et al., 2006). Inspected corn is hammer milled
and an aqueous slurry is prepared for jet-cooking and treatment
with a-amylase (liquefaction). The product is corn mash, which
is cooled and further treated with glucoamylase to convert
oligosaccharides to glucose (saccharification). Saccharified corn
mash proceeds to a combined liquefaction stream where it may
be mixed with backset (thin stillage from distillation) before transfer
to the fermentation tank. Yeast is propagated in a separate tank
before being added to the fermentor. In the current study, eight
separate points were sampled over a period of two years (Fig. 1).
It should be noted that the production facility was considered
‘‘healthy’’ during the entire sampling period, and that no stuck
fermentations occurred.
Samples from the slurry tank (1), mash tank (2), and before (3)
and after (4) the beer/mash cooler, consistently showed less than
100 viable contaminants/mL (the limit of detection in this
method). The combined liquefaction sample (5) was consistently
contaminated with >106 viable bacteria/mL (Fig. 2A). Since samples
prior to the combined liquefaction stream showed low levels of
contamination, it is possible that contaminants originated from
the backset going into the combined liquefaction sample. It is also
possible that plumbing associated with the combined liquefaction
stream is chronically contaminated, possibly with bacterial bio-
films. The yeast propagation tank was also consistently contaminated
over time, with >104 viable bacteria/mL (Fig. 2A). Potential
sources of contamination at this point include the yeast inocula
and plumbing. Contents of the combined liquefaction stream and
yeast propagation tank are transferred to the fermentation tank.
Not surprisingly then, samples taken early in the fermentation
(50 h) were far more variable in terms
of contamination, ranging from >108 to

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

1. บทนำผลิตเอทานอลน้ำมันสหรัฐฯ เกิน gals 13 ล้านในปี 2014กับการผลิตส่วนใหญ่ใช้หมักยีสต์ทั่วไปของแป้งจากการประมวลผลมันแห้งข้าวโพด (ส่วน ethanol.rfa.org)หมักแหนมจะไม่ดำเนินการภายใต้เงื่อนไขวัฒนธรรมบริสุทธิ์และจุลินทรีย์ปนเรื้อรังถือเป็นปกติ(Connolly, 1999 Beckner et al., 2011) อย่างไรก็ตาม การปนเปื้อนสามารถลดประสิทธิภาพของการผลิตเอทานอลและผลแม้ในนิ้วติด '' หมักแหนม ต้องเสียค่าใช้จ่ายปิดทำความสะอาด(Bischoff et al., 2009 Muthaiyan et al., 2011 Khullar et al.,2013) แม้ มีความสำคัญทางเศรษฐกิจการปนเปื้อนจุลินทรีย์การศึกษาค่อนข้างน้อยได้พยายามที่จะกำหนดปัญหาภายใต้เงื่อนไขการผลิต สกินเนอร์และเครื่องหนัง (2004) รายงานว่า แบคทีเรียกรดแล็กติก และโดยเฉพาะอย่างยิ่งแลคโตบาซิลลัส sp. ถูกยุงในน้ำมันพืชเอทานอล ในเวลาต่อมา เชื้อเพลิงเอทานอลสารปนเปื้อนได้แสดงฟอร์ม biofilms ภายใต้สภาพห้องปฏิบัติการ(สกินเนอร์ Nemec et al., 2007) วัฒนธรรมบริสุทธิ์ของสารปนเปื้อนแสดงให้เห็นว่าต้องใช้เฉพาะความแปรผันในความสามารถในการแบบฟอร์ม biofilms(รวย et al., 2011) Biofilms ยากเอาออก โดยการทำความสะอาดและโดยทั่วไปถือว่าสามารถทนกับจุลินทรีย์ตัวแทน(สจ๊วต et al., 2004) เชื้อเพลิงเอทานอลผลิตสิ่งอำนวยความสะดวกได้มากเว็บไซต์ที่ถูกต้องเพียงพอสะอาด เช่นแลกเปลี่ยนความร้อนและท่อ dead-end และ biofilm เติบโตสามารถอธิบายการคงอยู่การปนเปื้อนแบคทีเรีย พัฒนา Bischoff et al. (2009)ระบบแบบจำลองสำหรับประเมินสารปนเปื้อน และสาธิตว่า สายพันธุ์ที่แตกต่างกันของชนิดเดียวกันแตกต่างกันในการหมักแหนมยีสต์ toinhibit ของพวกเขากำลังการผลิตของข้าวโพดคลุกเคล้า นี้แนะนำที่หลายสายพันธุ์อาจ innocuous หรือแม้แต่ประโยชน์เป็นส่วนหนึ่งของการมีสุขภาพดีmicroflora ที่แยก หรือควบคุมสายพันธุ์อันตราย ได้รับการขาดแคลนของข้อมูลของเขตข้อมูลที่เกี่ยวข้อง การสำรวจระยะยาวของการมันแห้ง ข้าวโพดโดยใช้เชื้อเพลิงเอทานอถูกดำเนินการผ่านการรอบระยะเวลาสองปี สารปนเปื้อนแยกต่างหากจากหลายชุดในโรงงาน ระบุ และลักษณะสำหรับความสามารถในการแบบฟอร์ม biofilms และขัดขวางการหมักเอทานอล2. วิธี2.1 การแยกและระบุสารปนเปื้อนเชื้อแบคทีเรียตัวอย่างที่เก็บรวบรวมจากเอทานอลเป็นเชื้อเพลิงแห้งมัน Midwesternพืชที่ผสมในน้ำเกลือฟอสเฟต buffered และแพร่กระจาย seriallyบนแผ่นที่ประกอบด้วยนางกลาง (Difco Becton สัน สปาร์คMD) กับเพิ่มไม่ใส่ยีสต์ cycloheximide 0.001% (w/v)เจริญเติบโต (สกินเนอร์และเครื่องหนัง 2004) วัฒนธรรมถูก incubatedanaerobically ที่ 37 C ใช้ระบบ AnaeroPack มิตซูบิชิ(Fisher เทอร์โมวิทยาศาสตร์ Pittsburg PA) หรือระบบอีซี่ GasPak(Becton สัน) และสายพันธุ์ที่บริสุทธิ์สองเดียวเป็นอาณานิคมและเก็บไว้ที่ 80 C ในกลีเซอร 40% (v/v) ใน microtiter 96-ดีแผ่นสายพันธุ์ที่ระบุลำดับของ 16S rRNA ยีนผ่านปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสที่ใช้ 16Sf (50-GAGAGTTTGATYCTGGCTCAG) และ 16Sr (50-GAAGGAGGTGWTCCARCCGCA) ไพรเมอร์เป็นก่อนหน้านี้อธิบาย (Whitehead และ Cotta, 2001) ผลิตภัณฑ์ได้(ประมาณ 1.6 kbp) ที่บริสุทธิ์ใช้ฟอกตัว PCR นายก 5kit และเรียงลำดับตามวิธีมาตรฐานที่ใช้รองพื้นไปข้างหน้าลำดับที่รับได้เมื่อเทียบกับลำดับในการฐานข้อมูล GenBank ที่ใช้โปรแกรม BLASTN (Altschul และ al., 1997)ที่แห่งชาติศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพ (ของ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)2.2. Biofilm ก่อผู้แต่ง Biofilm ถูกวัดโดยใช้จาน microtiter อย่างรวดเร็วassay เป็นก่อนหน้านี้อธิบาย (Rich et al., 2011) แยกเก็บไว้ใน microtiter ดี 96 แผ่นถูกจำลองลงบนแผ่น Omnitrayมีนาง (เทอร์โมวิทยาศาสตร์ โรเชสเตอร์ NY) ใช้การฆ่าเชื้อฝาตัวทำซ้ำ 96-pin (Nunc เดนมาร์ก ออกซิไดซ์โฟม)แผ่น Omnitray ได้ incubated สำหรับ h 48 ภายใต้เงื่อนไขที่ไม่ใช้ออกซิเจนที่ 37 C และอาณานิคมถูกโอนย้ายไป Omnitray สดแผ่น และ h 48 เพิ่มเติมโต 96 ดีหลัก microtiterแผ่น (Nunc) ถูกเตรียมไว้ประกอบด้วย 150 จะของนางในแต่ละดี จานหลักเป็น inoculated กับอาณานิคมจากการOmnitray ที่ใช้ฝาตัวทำซ้ำและแผ่นถูก incubated สำหรับh 48 ภายใต้เงื่อนไขที่ไม่ใช้ออกซิเจนที่ 37 เซลเซียส หลังจาก 48 h เซลล์ถูกนั้นกระตุ้นทำและฝาใหม่ถูกสอดเข้าไปในเซลล์ และถูกโอนย้ายไปจานใหม่ที่ถูก incubated สำหรับ h 48 จะคงขั้นตอนการแนบของเครื่องปฏิกรณ์แบบธรรมดา biofilm มีฝาโอนย้ายแผ่นสด (เวลาจุดศูนย์) และในเวลาต่อมาโอนย้ายทุก h 48 จนถึงปลายทางวิเคราะห์ที่ 144 h. วิเคราะห์ของ biofilm ผู้แต่งทำการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้เป็น(รวย et al., 2011) ตัวแทนทำสำเนาฝาหมุดมีสี ด้วยคริสตัล 0.1%โซลูชั่นไวโอเลท 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง และ destainedมีเอทานอล 95% จำนวนคริสตัลไวโอเลตย้อมสี การแสดงมีที่วัดเติบโต biofilm, 600 nm โดยใช้การ SpectraMaxM5 microtiter แผ่นอ่าน (อุปกรณ์โมเลกุล Sunnyvale, CA)2.3 การยับยั้งการผลิตเอทานอลเชื้อเพลิงชีวภาพสารปนเปื้อนได้ assayed ในการยับยั้งของเอทานอลหมักผสมข้าวโพดโดยใช้แบบจำลองระบบ (Bischoff et al.,2009) แยกกู้จากแผ่น microtiter 96-ดีได้ปลูก anaerobically สองวันในแข็ง MRS กลาง จากนั้นซื้อทีละ 15 mL ใส่หลอดที่ประกอบด้วย 5 mLนางเหลวปานกลาง และไม่ มีการสั่นใน 24 ชมที่ incubated37 Preinocula C. ของ Saccharomyces cerevisiae สายพันธุ์ NRRL Y-2034มีปลูกในน้ำ Erlenmeyer 300 มล.ด้วย peptone ยีสต์ 75 mLสื่อ (YP) เสริม ด้วยขึ้น 5% (w/v) ที่ 32 C และมีการเก็บเกี่ยว 200 rpm สำหรับ 24 h. ยีสต์และเซลล์แบคทีเรีย โดย centrifugationที่ 4000g, C 4 ใน 15 นาทีและฟอสเฟต resuspended ในน้ำเกลือถูกบัฟเฟอร์จะเป็น OD600 ของ 80 และ 8 สำหรับยีสต์และแบคทีเรียตามลำดับผสมข้าวโพดเหลวได้รับจากมันแห้งค้าสินเชื่อเอทานอลและ aliquots L 4 เก็บไว้ในที่ 20 ค.จำลองได้หมักแหนมในวัฒนธรรมซ้ำ 40 มล.ในน้ำ 50 mLประกอบด้วยผสมข้าวโพด (33% ของแข็ง) เสริม ด้วย 0.12%(w/v) แอมโมเนียมซัลเฟตและ glucoamylase 0.05% (v/v) (OptidexL-400, Genencor International Inc. โรเชสเตอร์ NY) มีวัฒนธรรมinoculated กับ 0.5 mL ของยีสต์แตกออกและเชื้อแบคทีเรีย preinoculaความเข้มข้นเท่ากับสุดท้ายของ 6 107 ยีสต์เซลล์/มล. และ1 107 แบคทีเรีย เซลล์/mL ใส่น้ำเกลือ (0.5 มล.) เป็นการลบควบคุมแทนความท้าทายจากแบคทีเรีย แยก BR0315-1มีใช้แลคโตบาซิลลัส fermentum เป็นความท้าทายบวกควบคุมสำหรับการหมัก ''ติดนิ้วในแต่ละชุด (Bischoff et al., 2009)นำปรบมือ ด้วยจุกยาง vented และ incubatedที่ 32 C และ 100 rpm สำหรับ 72 hวิเคราะห์ วัฒนธรรมที่ละเอียด โดย centrifugation และsupernatants ถูกทำให้เจือจาง 10-fold กับ ddH2O เอทานอล กลูโคสกรด กรดอะซิติกได้ถูกตามประสิทธิภาพสูงใช้ 300 mm Aminex HPX chromatography เหลวคอลัมน์ 87H(ห้องปฏิบัติการชีวภาพ Rad, Inc. เฮอร์คิวลิส CA) ที่เป็น HP 1100ระบบ HPLC พร้อมจับดรรชนี (Agilentเทคโนโลยี ซานตาคลารา CA) ตัวอย่าง (10 จะ) ถูกฉีดลงบนคอลัมน์ที่ 65 C และ eluted กับ 5 มม.กำมะถันเฟสเคลื่อนที่0.6 mL/นาที3. ผลลัพธ์ และสนทนา3.1 การเกิดและการกระจายของสารปนเปื้อนเอทานอลมันแห้งผลิตกัด liquefactionsaccharification หมัก และการกลั่น (Kelsall และรสปี 1999 Kwiatkowski และ al., 2006) ตรวจสอบข้าวโพดเป็นค้อนที่ปลายและสารละลายสเอาท์จะเตรียมไว้สำหรับทำอาหาร jet และรักษากับ a-amylase (liquefaction) ผลิตภัณฑ์เป็นข้าวโพดคลุกเคล้าเข้า ซึ่งระบายความร้อนด้วย และเพิ่มเติม รับ glucoamylase แปลงoligosaccharides กับกลูโคส (saccharification) ข้าวโพด saccharifiedหน่วยดำเนินการ liquefaction รวมกระแสที่อาจสามารถผสมกับ backset (stillage บางจากการกลั่น) ก่อนการโอนย้ายถังหมัก ยีสต์มีการเผยแพร่ในถังแยกก่อนที่จะถูกเพิ่มลงใน fermentor ในการศึกษาปัจจุบัน 8จุดแยกมีความระยะเวลาสองปี (Fig. 1)ควรสังเกตว่า สถานที่ผลิตที่พิจารณา"สุขภาพ" ในระหว่างรอบระยะเวลาสุ่มตัวอย่างทั้งหมด และที่ไม่ติดเกิดการหมักแหนมตัวอย่างสารละลายถัง (1), ถังผสม (2), และ ก่อน (3)และหลังจาก (4) เบียร์/คลุกเคล้า เย็นอย่างต่อเนื่องแสดงให้เห็นน้อยกว่า100 ได้ สารปนเปื้อน/mL (ขีดจำกัดของการตรวจสอบนี้วิธี) ตัวอย่างรวม liquefaction (5) ได้อย่างต่อเนื่องปนเปื้อน > 106 ได้ แบคทีเรีย/mL (Fig. 2A) ตั้งแต่ตัวอย่างก่อนกระแส liquefaction รวมพบว่าระดับต่ำสุดของปนเปื้อน เป็นไปได้ที่สารปนเปื้อนที่มาจากbackset ที่จะเป็นตัวอย่างรวม liquefaction มีสุดไฟฟ้าที่เกี่ยวข้องกับ liquefaction รวมกระแสเป็นโรคเรื้อรังปน อาจจากแบคทีเรียไบโอ-ฟิล์ม ถังยีสต์เผยแพร่ถูกปนเปื้อนยังอย่างสม่ำเสมอช่วงเวลา มี > 104 ได้ แบคทีเรีย/mL (Fig. 2A) เป็นไปได้แหล่งการปนเปื้อนในขั้นตอนนี้รวม inocula ยีสต์และระบบประปา เนื้อหาของกระแส liquefaction รวม และถังยีสต์เผยแพร่จะถูกโอนย้ายไปยังถังหมักไม่น่าแปลกใจแล้ว ตัวอย่างดำเนินการในช่วงการหมัก(< 8 h) นอกจากนี้ยัง มีอย่างต่อเนื่องปนเปื้อน ช่วงประมาณ105-109 ได้ แบคทีเรีย/mL เรื่องน่าสนใจอย่างไรก็ตาม ตัวอย่างมาสายในหมัก (> 50 h) อยู่ไกลมากกว่าตัวแปรในเงื่อนไขการปนเปื้อน ตั้งแต่ > 108 การ < 102 ได้ แบคทีเรีย/mLต่ำสุดที่ระดับการปนเปื้อนในตัวอย่างหมักช้าอาจจะลงบัญชี โดยแข่งขันกับยีสต์ในสารอาหาร หรือโดยยับยั้งโดยสะสมเอทานอล แม้ว่าการผลิตสิ่งอำนวยความสะดวกถูกปิดซักห้าครั้งช่วงสุ่มตัวอย่าง(Fig. 2A), เหตุการณ์เหล่านี้ได้ไม่สม่ำเสมอ correlated กับการเปลี่ยนแปลงในระดับของสารปนเปื้อน แนะนำผลลัพธ์เหล่านี้ปนเรื้อรัง แบบที่ทนต่อการทำความสะอาดอาจเกี่ยวข้องกับแบคทีเรีย biofilms recalcitrant

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

1.
บทนำสหรัฐอเมริกา การผลิตน้ำมันเชื้อเพลิงเอทานอลสูงกว่า 13 พันล้าน gals ในปี 2014
มีการผลิตส่วนใหญ่อยู่บนพื้นฐานของการหมักยีสต์ธรรมดาของแป้งจากการประมวลผลแห้งบดข้าวโพด (ethanol.rfa.org). หมักแหนมจะไม่ดำเนินการภายใต้เงื่อนไขวัฒนธรรมบริสุทธิ์และการปนเปื้อนของจุลินทรีย์ที่เป็นเรื้อรังถือว่าเป็นเรื่องปกติ(คอนเนลลี่, 1999. Beckner et al, 2011) อย่างไรก็ตามการปนเปื้อนสามารถลดประสิทธิภาพการผลิตเอทานอลและผลแม้ใน'ติด' 'หมักแหนมต้องปิดค่าใช้จ่ายสำหรับการทำความสะอาด(บิชอฟ et al, 2009;. Muthaiyan et al, 2011;.. Khullar, et al, 2013) แม้จะมีความสำคัญทางเศรษฐกิจของการปนเปื้อนของจุลินทรีย์, การศึกษาค่อนข้างน้อยมีความพยายามในการกำหนดปัญหาที่เกิดขึ้นภายใต้เงื่อนไขการผลิต หนังและเครื่องหนัง (2004) รายงานว่าแบคทีเรียกรดแลคติกและโดยเฉพาะอย่างยิ่งLactobacillus sp. เป็นโรคประจำถิ่นในพืชน้ำมันเชื้อเพลิงเอทานอล ต่อมาปนเปื้อนน้ำมันเชื้อเพลิงเอทานอลที่มีการแสดงในรูปแบบไบโอฟิล์มภายใต้เงื่อนไขที่ห้องปฏิบัติการ(สกินเนอร์ Nemec-et al., 2007) วัฒนธรรมบริสุทธิ์ของสารปนเปื้อนที่แสดงให้เห็นความแปรปรวนสายพันธุ์เฉพาะความสามารถในการที่จะสร้างไบโอฟิล์ม(รวย et al., 2011) ไบโอฟิล์มเป็นเรื่องยากที่จะลบโดยการทำความสะอาดและมีการพิจารณาโดยทั่วไปจะทนต่อยาต้านจุลชีพ(สจ๊วต et al., 2004) สิ่งอำนวยความสะดวกการผลิตเอทานอลเชื้อเพลิงมีหลายเว็บไซต์ที่ยากต่อการทำความสะอาดอย่างเพียงพอเช่นการแลกเปลี่ยนความร้อนและท่อสิ้นตายและการเจริญเติบโตไบโอฟิล์มสามารถอธิบายการติดตาการปนเปื้อนของเชื้อแบคทีเรีย บิชอฟและอัล (2009) การพัฒนาระบบรูปแบบการประเมินผลการปนเปื้อนและแสดงให้เห็นว่าสายพันธุ์ที่แตกต่างกันของชนิดเดียวกันแตกต่างกันในtoinhibit ขีดความสามารถในกระบวนการหมักยีสต์ของข้าวโพดบด นี้แสดงให้เห็นว่าหลายสายพันธุ์ที่อาจจะเป็นอันตรายหรือเป็นประโยชน์แม้จะเป็นส่วนหนึ่งของการมีสุขภาพดีจุลินทรีย์ที่ไม่รวมหรือควบคุมสายพันธุ์ที่เป็นอันตราย ได้รับความขาดแคลนของข้อมูลภาคสนามที่เกี่ยวข้องสำรวจยาวของแห้งบดข้าวโพดจากพืชน้ำมันเชื้อเพลิงเอทานอลได้ดำเนินการมาเป็นระยะเวลาสองปี สารปนเปื้อนที่แยกได้จากการเก็บหลายเว็บไซต์ในโรงงานระบุและโดดเด่นสำหรับความสามารถที่จะสร้างไบโอฟิล์มและยับยั้งการหมักเอทานอล. 2 วิธี2.1 การแยกและบัตรประจำตัวของสารปนเปื้อนเชื้อแบคทีเรียตัวอย่างที่เก็บรวบรวมจากมิดเวสต์ของแห้งบดเชื้อเพลิงเอทานอพืชที่ถูกปรับลดลำดับในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟตและการแพร่กระจายบนจานที่มีขนาดกลางMRS (Difco Becton ดิกคินสันปาร์กส์, MD) กับ 0.001% (w / v) cycloheximide เพิ่ม เพื่อให้การปราบปรามยีสต์เจริญเติบโต(สกินเนอร์และเครื่องหนัง, 2004) วัฒนธรรมถูกบ่มแบบไม่ใช้อากาศที่ 37 องศาเซลเซียสโดยใช้ระบบมิตซูบิชิ AnaeroPack (เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์, พิตต์สเดลเฟีย) หรือ GasPak ระบบ EZ (Becton ดิกคินสัน) และสายพันธุ์บริสุทธิ์สองเท่าอาณานิคมเดียวและเก็บไว้ที่80 องศาเซลเซียสใน 40% (v / v) กลีเซอรอลในไมโคร 96 หลุมจาน. สายพันธุ์ที่ถูกระบุโดยลำดับของยีน 16S rRNA ผ่านปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์ใช้16Sf (50 -GAGAGTTTGATYCTGGC TCAG) และ 16Sr (50 -GAAGGAGGTGWTCCARCCGCA) ไพรเมอร์เป็นก่อนหน้านี้อธิบาย(Whitehead และ Cotta, 2001) ผลิตภัณฑ์ผล(ประมาณ 1.6 KBP) ถูกนำมาทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ 5 บริสุทธิ์ PCR นายกรัฐมนตรีชุดและลำดับขั้นตอนโดยวิธีมาตรฐานโดยใช้ไพรเมอร์ไปข้างหน้า. ลำดับที่ได้มาเทียบกับลำดับในฐานข้อมูล GenBank ใช้กล่าวหา (Altschul et al., 1997) ที่ศูนย์แห่งชาติสำหรับข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพ (http: //. blast.ncbi.nlm.nih.gov/) 2.2 จุลินทรีย์ก่อจุลินทรีย์ก่อถูกวัดโดยใช้แผ่นไมโครอย่างรวดเร็วการทดสอบตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้(รวย et al., 2011) แยกเก็บไว้ใน 96 หลุมแผ่นไมโครถูกจำลองแบบลงบนแผ่น Omnitray กับนาง (เทอร์โมวิทยาศาสตร์โรเชสเตอร์, นิวยอร์ก) โดยใช้การฆ่าเชื้อฝาจำลอง96 ขา (Nunc, เดนมาร์ก, สไตรีนออกซิไดซ์). แผ่น Omnitray ถูกบ่มเป็นเวลา 48 ชั่วโมงภายใต้เงื่อนไขที่ไม่ใช้ออกซิเจนที่ 37 องศาเซลเซียสและอาณานิคมถูกย้ายไป Omnitray สดจานและปลูกเพิ่มอีก48 ชั่วโมง 96 ดีต้นแบบไมโครแผ่น(Nunc) ถูกจัดทำขึ้นมี 150 LL ของนางในแต่ละดี จานหลักได้รับเชื้อด้วยอาณานิคมจากOmnitray ใช้ฝาจำลองและแผ่นที่ถูกบ่มเป็นเวลา48 ชั่วโมงภายใต้เงื่อนไขการใช้ออกซิเจนที่ 37 องศาเซลเซียส 48 ชั่วโมงหลังจากที่เซลล์ถูกตื่นเต้นและมีฝาปิดใหม่ที่ถูกจุ่มลงไปในเซลล์และย้ายไปที่ใหม่แผ่นซึ่งได้รับการบ่มเป็นเวลา 48 ชั่วโมงซึ่งสอดคล้องกับแบบคงที่ขั้นตอนสิ่งที่แนบมาของไบโอฟิล์มเครื่องปฏิกรณ์แบบเดิม ฝาถูกถ่ายโอนไปยังแผ่นสด (จุดเวลาศูนย์) และต่อมาได้โอนทุก48 ชั่วโมงจนกว่าจะถึงจุดสิ้นสุดของการทดสอบที่ 144 ชั่วโมง การวิเคราะห์ของการสร้างไบโอฟิล์มได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้(รวย et al., 2011) หมุดฝาซ้ำถูกย้อมด้วยสีคริสตัล 0.1% วิธีการแก้ปัญหาสีม่วงเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้องและ destained กับเอทานอล 95% ปริมาณของการย้อมสีม่วงคริสตัลที่เป็นตัวแทนของการเจริญเติบโตของไบโอฟิล์มได้รับการวัดที่ 600 นาโนเมตรโดยใช้ SpectraMax M5 ไมโครอ่านแผ่น (โมเลกุลอุปกรณ์ซันนีเวล, แคลิฟอร์เนีย). 2.3 ยับยั้งการผลิตเอทานอลปนเปื้อนเชื้อเพลิงชีวภาพถูก assayed การยับยั้งของเอทานอลการหมักบดข้าวโพดโดยใช้แบบจำลองระบบ(บิชอฟ et al., 2009) แยกหายจากแผ่นไมโคร 96 หลุมได้รับการปลูกแบบไม่ใช้อากาศเป็นเวลาสองวันในสื่อMRS ที่เป็นของแข็งแล้วโอนเข้ามาเป็นรายบุคคลผ่านการฆ่าเชื้อ15 มิลลิลิตรหลอดที่มี 5 มิลลิลิตรกลางMRS ของเหลวและบ่มโดยไม่ต้องเขย่าเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่37 ของซี Preinocula Saccharomyces cerevisiae สายพันธุ์ NRRL Y-2034 ได้รับการปลูกใน 300 มิลลิลิตรขวด Erlenmeyer กับเปปโตนยีสต์ 75 มิลลิลิตร(YP) สื่อเสริมด้วย 5% (w / v) เดกซ์โทรสที่ 32 C และ200 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ยีสต์และแบคทีเรียที่ถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 4000g 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 นาทีและ resuspended ในฟอสเฟตน้ำเกลือบัฟเฟอร์ไปยังOD600 80 และ 8 สำหรับยีสต์และแบคทีเรียตามลำดับ. บดข้าวโพดเหลวที่ได้รับจากการค้าแห้งบดโรงงานเอทานอลและเก็บไว้ใน 4 aliquots L ที่ 20 ซีรุ่นหมักอยู่ในวัฒนธรรมที่ซ้ำกัน40 มิลลิลิตรในขวด 50 มล, มีบดข้าวโพด (ของแข็ง 33%) เสริมด้วย 0.12% (w / v) แอมโมเนียมซัลเฟตและ 0.05% (v / v) glucoamylase (Optidex L-400, Genencor อินเตอร์เนชั่นแนลอิงค์โรเชสเตอร์, นิวยอร์ก) วัฒนธรรมที่ได้รับเชื้อด้วย 0.5 มิลลิลิตรของยีสต์เจือจางและ preinocula แบคทีเรียเทียบเท่ากับความเข้มข้นสุดท้ายของ6 107 เซลล์ยีสต์ / มิลลิลิตรและ1 107 เซลล์แบคทีเรีย / มิลลิลิตร น้ำเกลือปราศจากเชื้อ (0.5 มิลลิลิตร) ทำหน้าที่เป็นเชิงลบการควบคุมในสถานที่ของความท้าทายของเชื้อแบคทีเรีย แยก BR0315-1 Lactobacillus fermentum ถูกใช้เป็นความท้าทายที่ควบคุมบวกสำหรับ'ติด' 'หมักในแต่ละชุด (บิชอฟ et al., 2009). Flasks ถูกปกคลุมด้วยยางอุดระบายและบ่มที่32 องศาเซลเซียสและ 100 รอบต่อนาที 72 ชม. สำหรับการวิเคราะห์วัฒนธรรมได้รับการชี้แจงจากการหมุนเหวี่ยงและsupernatants ถูกเจือจาง 10 เท่าด้วย ddH2O เอทานอลกลูโคสกรดแลคติกและกรดอะซิติกได้รับการพิจารณาโดยมีประสิทธิภาพสูงของเหลวchromatography ใช้ 300 มิลลิเมตร Aminex HPX คอลัมน์ 87H (ห้องปฏิบัติการ Bio-Rad, Inc ดาว CA) บน HP 1100 ชุดระบบHPLC อุปกรณ์ที่มีดัชนีหักเห เครื่องตรวจจับ (Agilent Technologies, ซานตาคลารา, แคลิฟอร์เนีย) ตัวอย่าง (10 LL) ถูกฉีดลงบนคอลัมน์ที่65 ชะซีและมีขั้นตอนที่ 5 มิลลิ H2SO4 มือถือที่0.6 มิลลิลิตร / นาที. 3 และการอภิปรายผล3.1 การเกิดและการกระจายของสารปนเปื้อนกระบวนการเอทานอลแห้งบดเกี่ยวข้องกับการกัดเหลวsaccharification หมักและการกลั่น (Kelsall และลียง, 1999. Kwiatkowski et al, 2006) ข้าวโพดตรวจสอบเป็นค้อนแป้งและสารละลายน้ำที่เตรียมไว้สำหรับเจ็ทการปรุงอาหารและการรักษาที่มีอะไมเลส(เหลว) ผลิตภัณฑ์ที่เป็นบดข้าวโพดซึ่งจะเย็นและรับการรักษาต่อไปด้วยการแปลง glucoamylase oligosaccharides กลูโคส (saccharification) ข้าวโพด Saccharified เงินที่จะบดกระแสเหลวรวมกันที่อาจจะนำมาผสมกับเจาะตลับกุญแจ (stillage บางจากการกลั่น) ก่อนที่จะโอนไปยังถังหมัก ยีสต์จะแพร่กระจายในถังแยกต่างหากก่อนที่จะถูกเพิ่มลงไปในถังหมัก ในการศึกษาปัจจุบันแปดจุดแยกตัวอย่างในช่วงสองปีที่ผ่านมา (รูปที่ 1).. มันควรจะตั้งข้อสังเกตว่าโรงงานผลิตได้รับการพิจารณา'' สุขภาพ '' ในช่วงระยะเวลาการสุ่มตัวอย่างทั้งหมดและว่าไม่มีการติดหมักที่เกิดขึ้นตัวอย่างจากถังสารละลาย (1) ถังบด (2) และก่อน (3) และหลัง (4) เบียร์เย็น / บดอย่างต่อเนื่องแสดงให้เห็นน้อยกว่า100 สารปนเปื้อนที่ทำงาน / มิลลิลิตร (ขีด จำกัด ของการตรวจสอบในเรื่องนี้วิธีการ) ตัวอย่างเหลวรวมกัน (5) ได้รับการอย่างต่อเนื่องปนเปื้อนด้วย> 106 แบคทีเรียทำงานได้ / มิลลิลิตร (รูป. 2A) ตั้งแต่ตัวอย่างก่อนที่จะมีกระแสเหลวรวมแสดงให้เห็นระดับต่ำของการปนเปื้อนก็เป็นไปได้ว่าสารปนเปื้อนมาจากเจาะตลับกุญแจจะเป็นตัวอย่างเหลวรวม นอกจากนี้ยังเป็นไปไม่ได้ที่การประปาเกี่ยวข้องกับเหลวรวมกระแสจะปนเปื้อนเรื้อรังอาจมีแบคทีเรียชีวภาพภาพยนตร์ ถังขยายพันธุ์ยีสต์ที่ได้รับการปนเปื้อนอย่างต่อเนื่องในช่วงเวลาที่มี> 104 แบคทีเรียทำงานได้ / มิลลิลิตร (รูป. 2A) ที่อาจเกิดขึ้นแหล่งที่มาของการปนเปื้อนที่จุดนี้ ได้แก่ inocula ยีสต์และประปา เนื้อหาของกระแสเหลวรวมกันและถังขยายพันธุ์ยีสต์จะถูกโอนไปยังถังหมัก. ไม่น่าแปลกใจแล้วตัวอย่างที่เก็บได้ในช่วงต้นของการหมัก(<8 ชั่วโมง) นอกจากนี้ยังได้รับการปนเปื้อนอย่างต่อเนื่องในช่วงประมาณ105 -109 แบคทีเรียทำงานได้ / มิลลิลิตร ที่น่าสนใจ แต่ตัวอย่างที่เก็บได้ในช่วงปลายหมัก(> 50 ชั่วโมง) อยู่ไกลตัวแปรมากขึ้นในแง่ของการปนเปื้อนตั้งแต่> 108 <102 แบคทีเรียทำงานได้ / mL. ระดับต่ำสุดของการปนเปื้อนในตัวอย่างหมักปลายอาจจะนำมาใช้โดยการแข่งขันกับยีสต์สารอาหารหรือโดยการยับยั้งโดยเอทานอลที่สะสม แม้ว่าการผลิตสิ่งอำนวยความสะดวกที่ถูกปิดสำหรับการทำความสะอาดห้าครั้งในช่วงระยะเวลาการสุ่มตัวอย่าง(รูป. 2A) เหตุการณ์เหล่านี้ไม่ได้มีความสัมพันธ์อย่างต่อเนื่องกับการเปลี่ยนแปลงในระดับของสารปนเปื้อน ผลการศึกษานี้แสดงให้เห็นเรื้อรังการปนเปื้อนถาวรที่สามารถทนต่อการทำความสะอาดอาจจะเกี่ยวข้องกับไบโอฟิล์มแบคทีเรียบิดพลิ้ว