BioMed Research International1. Int

BioMed Research International
1. Introduction
Epigenetic systems are crucial for normal embryonic development
via the transcriptional regulation of tissue and
cell-type-dependent gene expression. Epigenetic marks,
such as DNA methylation and histone modification, cause
dynamic changes in heterochromatic and euchromatic
regions depending on the cellular conditions and cell type
[1–4]. During the differentiation process, demethylation and
the de novo methylation of DNA occur at gene loci to form
tissue-dependent and differentially methylated regions (TDMRs)
in the mammalian genome [5–8]. Epigenetic systems
have dual aspects of plasticity and stability depending on
the cellular environment and cell fate decisions, respectively.
Therefore, the long-lasting effects of low concentrations of
chemicals on abnormal phenotypes might be attributable to
epigenetic alterations; chemicals that disturb the epigenetic
status are termed epimutagens.
Various types of chemicals, including endocrine disruptors,
dioxins, heavy metals, and tobacco, and their metabolites
have been detected in the fetal environment [9–11]. We
previously performed epimutagen screening using mouse
embryonic stem cells (mESCs). Of the 25 environmental
chemicals detected in human blood samples, five chemicals
(diethyl phosphate (DEP), mercury (Hg), cotinine, selenium
(Se), and octachlorodipropyl ether (S-421)) disturbed epigenetic
systems at relatively low concentrations (0.1–100 ppb)
[12].We also demonstrated that dimethyl sulfoxide (DMSO),
which was previously used as a cryopreservant for fertilized
eggs, altered the DNA methylation status in both gene areas
and repetitive sequences during the differentiation of mESCs
into embryoid bodies (EBs) [13].
Different mammalian species display different sensitivities
to chemicals [14, 15]; therefore, the epimutagenic effects of
chemicals need to be assessed using a human model system.
Here, we aimed to establish a screening system for epimutagens
using human induced pluripotent stem cells (hiPSCs),
an in vitro model for early human embryos, to examine the
individual and combined effects of environmental chemicals
on the epigenetic status of human embryos/fetuses.
2. Materials and Methods
2.1. Culture of hiPSCs and Exposure to Chemicals. Human
iPSCs (201B7) that have been established at Dr. Yamanaka’s
laboratory [16] were obtained from RIKEN BioResource
Center (Tsukuba, Japan). The hiPSC line was cultured on
SNL feeder cells with Primate ES Cell Medium (ReproCELL,
Yokohama, Japan), supplemented with 5 ng/mL bFGF (Wako,
Osaka, Japan). hiPSC colonies were detached and separated
into small clumps using a reagent containing 20% knockout
serum replacement (KSR; Invitrogen, Rockville, MD,
USA), 0.25% trypsin (Invitrogen), 1mg/mL collagenase IV
(Wako), and 1mM CaCl2 (Wako). To induce the formation
of EBs, small clumps of hiPSCs were transferred to bacterial
Petri dishes in Primate ES Cell Medium without bFGF
after the removal of feeder cells. For neural differentiation,
small clumps of hiPSCs were plated on a PA6 feeder layer
in Glasgow minimum essential medium containing 10%
KSR, 100mM nonessential amino acids, and 100mM 2-
mercaptoethanol (all from Invitrogen). PA6 was obtained
from RIKEN BioResource Center.
The hiPSCs were cultured with the indicated chemicals
at concentrations equivalent to serum levels (1x) or 10-fold
higher (10x) (Table 1). The serum levels (1x) were determined
based on the concentrations of cord blood samples and/or
pregnant mothers’ serum using liquid chromatography-mass
spectrometry (LC/MS), gas chromatography-mass spectrometry
(GC/MS), or inductively coupled plasma-mass spectrometry
(ICP/MS), as described in a previous study [12].
The chemicals were added as described previously [12], and
the final concentrations of solventswere 0.007%hydrochloric
acid (HCl) for tin (Sn), 0.0025% nitric acid (HNO3) for Se,
cadmium (Cd), Hg, and lead (Pb), or 0.1% ethanol (EtOH)
for the other 15 chemicals and trichostatin A (TSA) (Sigma-
Aldrich, Tokyo, Japan). The chemicals were divided into
groups as follows: group A (pesticides), group B (tobacco),
group C (perfluorinated compounds (PFCs)), group D
(heavy metals), and group E (phthalate) (Table 1). The mixture
of chemicals in group D (heavymetals) dissolved in HCl
and HNO3 was added to culture medium, and the final concentrations
of the solvents in culture medium were 0.007%
and 0.0025%, respectively. As to the other chemical mixtures
(groups A, B, C, and E), the final concentration of the solvent
was 0.1% EtOH.The mixture of the five epimutagens, DEP,
Hg, cotinine, Se, and S-421, dissolved in HNO3 and EtOH
was added to culture medium, and the final concentrations
in culture medium were 0.0025% and 0.1%, respectively.
2.2. Immunohistochemistry. Human iPSCs and differentiating
cells were fixed in 4% paraformaldehyde for 10min.
After permeabilization with 0.2% Triton X-100 for 5min,
samples were blocked using blocking buffer (5% bovine
serum albumin, 0.1% Tween-20 in PBS) for 30min. The
samples were incubated with either anti-heterochromatin
protein 1

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

BioMed วิจัยนานาชาติ1. บทนำระบบ epigenetic มีความสำคัญสำหรับการพัฒนาตัวอ่อนที่ปกติผ่านระเบียบ transcriptional ของเนื้อเยื่อ และเซลล์ชนิดขึ้นอยู่กับการปรับปรุงยีน เครื่องหมาย epigeneticปรับและแก้ไขฮิสโตน ทำให้เปลี่ยนแปลงแบบไดนามิกใน heterochromatic และ euchromaticภูมิภาคสภาพเซลล์และชนิดของเซลล์[1-4] ในระหว่างกระบวนการสร้างความแตกต่าง demethylation และปรับ novo de ของดีเอ็นเอเกิดขึ้นที่ยีน loci ฟอร์มขึ้นอยู่ กับเนื้อเยื่อ และ differentially methylated ภูมิภาค (TDMRs)ในจีโนม mammalian [5-8] ระบบ epigeneticมีสองด้าน plasticity และความมั่นคงขึ้นอยู่กับชะตากรรมจากเซลล์และสภาพแวดล้อมที่โทรศัพท์มือถือการตัดสินใจ ตามลำดับดังนั้น ผลกระทบยาวนานของความเข้มข้นต่ำสุดของสารเคมีในฟีปกติอาจรวมเปลี่ยนแปลง epigenetic สารเคมีที่รบกวนการ epigeneticสถานะเรียกว่า epimutagensชนิดต่าง ๆ ของสารเคมี รวมทั้งต่อมไร้ท่อ disruptorsdioxins โลหะหนัก และยาสูบ และ metabolites ของพวกเขาพบในสภาพแวดล้อมในครรภ์ [9-11] เราก่อนหน้านี้ทำ epimutagen คัดกรองโดยใช้เมาส์(mESCs) เซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อน 25 สิ่งแวดล้อมสารเคมีที่ตรวจพบในตัวอย่างเลือดมนุษย์ เคมี 5(diethyl ฟอสเฟต (DEP), ปรอท (Hg), cotinine เกลือ(Se), และ octachlorodipropyl อีเทอร์ (S-421)) รบกวน epigeneticระบบที่ความเข้มข้นค่อนข้างต่ำ (0.1-100 ppb)[12] เราแสดงที่ dimethyl sulfoxide (DMSO),ซึ่งก่อนหน้านี้ถูกใช้เป็น cryopreservant สำหรับปฏิสนธิไข่ การเปลี่ยนแปลงสถานะการปรับ DNA ในยีนทั้งสองและลำดับซ้ำในระหว่างการสร้างความแตกต่างของ mESCsเป็น embryoid ร่างกาย (EBs) [13]สายพันธุ์ต่าง ๆ mammalian แสดงรัฐแตกต่างกันการเคมี [14, 15]; ดังนั้น epimutagenic ผลสารเคมีจำเป็นต้องได้รับการประเมินโดยใช้ระบบจำลองมนุษย์ที่นี่ เรามีวัตถุประสงค์เพื่อสร้างระบบคัดกรองสำหรับ epimutagensใช้ pluripotent มนุษย์เหนี่ยวนำให้เซลล์ต้นกำเนิด (hiPSCs),แบบจำลองเครื่องมือสำหรับช่วงโคลนมนุษย์ การตรวจสอบการแต่ละคน และรวมผลกระทบของสารเคมีสิ่งแวดล้อมในสถานะ epigenetic fetuses มนุษย์โคลน2. วัสดุและวิธีการ2.1. วัฒนธรรม hiPSCs และสัมผัสกับสารเคมี มนุษย์iPSCs (201B7) ที่ก่อตั้งขึ้นที่ดร.ยามานากะห้องปฏิบัติการ [16] ได้รับมาจาก BioResource อาทิศูนย์ (อวกาศสึกุบะ ญี่ปุ่น) บรรทัด hiPSC เป็นอ่างบนเซลล์ที่ป้อน SNL มีประชาชนมอบ ES เซลล์กลาง (ReproCELLเสริม ด้วย bFGF 5 ng/mL (Wako โยโกฮามะ ญี่ปุ่น),โอซาก้า ญี่ปุ่น) บ้านเดี่ยว และแบ่งอาณานิคม hiPSCเป็นกระจุกเล็กใช้รีเอเจนต์ที่ประกอบด้วย 20% ชนะน็อกโดยเทคนิคเซรั่มแทน (KSR Invitrogen ร็อควิลล์ MDสหรัฐอเมริกา), 0.25% ทริปซิน (Invitrogen), IV collagenase 1 mg/mL(Wako), และ CaCl2 1 มม. (Wako) เพื่อก่อให้เกิดการก่อตัวของ EBs กระจุกเล็กของ hiPSCs ได้ถูกโอนย้ายไปที่แบคทีเรียจาน petri ในอันดับวานร ES เซลล์ โดย bFGFหลังจากลบเซลล์อัตโนมัติ การสร้างความแตกต่างที่ประสาทขนาดเล็กกระจุกของ hiPSCs ถูกชุบบนชั้นป้อน PA6ในกลาสโกว์ต่ำสุดจำเป็นประกอบด้วย 10%KSR กรดอะมิโนไม่จำเป็น 100 มม. และ 100 มม. 2-mercaptoethanol (ทั้งหมดจาก Invitrogen) PA6 กล่าวจากศูนย์ BioResource อาทิHiPSCs มีอ่าง ด้วยสารเคมีที่ระบุที่ความเข้มข้นเทียบเท่าระดับ serum (1 x) หรือ 10-foldสูงขึ้น (10 x) (ตารางที่ 1) มีกำหนดระดับ serum (1 x)ขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของสายเลือดตัวอย่าง และ/หรือตั้งครรภ์มารดา serum ใช้ chromatography มวลของเหลวspectrometry (LC/MS), spectrometry chromatography ก๊าซมวล(GC/MS), หรือท่านควบคู่ spectrometry มวลพลาสม่า(ICP/MS), ตามที่อธิบายไว้ในการศึกษาก่อนหน้านี้ [12]เพิ่มสารเคมีตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [12], และความเข้มข้นสุดท้ายของ solventswere 0.007%hydrochloricกรด (HCl) สำหรับดีบุก (Sn), 0.0025% กรดไนตริก (HNO3) สำหรับ Seแคดเมียม (Cd), Hg และลูกค้าเป้าหมาย (Pb), หรือ 0.1% เอทานอล (EtOH)สำหรับสารเคมี 15 และ trichostatin A (TSA) (ซิก-อื่น ๆAldrich โตเกียว ญี่ปุ่น) สารเคมีแบ่งออกได้กลุ่มเป็นดังนี้: กลุ่ม A (ยาฆ่าแมลง), กลุ่ม B (ยาสูบ),กลุ่ม C (perfluorinated สาร (PFCs)), กลุ่ม D(โลหะหนัก), และกลุ่ม E (พทาเลท) (ตารางที่ 1) ส่วนผสมสารเคมีในกลุ่ม D (heavymetals) ละลายใน HClและ HNO3 ได้เพิ่มสื่อวัฒนธรรม และความเข้มข้นสุดท้ายหรือสารทำละลายในวัฒนธรรมมี 0.007%และ 0.0025% ตามลำดับ เป็นน้ำยาผสมที่สารเคมีอื่น ๆ(กลุ่ม A, B, C และ E), ความเข้มข้นสุดท้ายของตัวทำละลายมี 0.1% EtOH.The ส่วนผสมของ epimutagens 5, DEPHg, cotinine, Se และ S-421 ละลายใน EtOH และ HNO3เพิ่มสื่อวัฒนธรรม และความเข้มข้นสุดท้ายในวัฒนธรรมได้ 0.0025% และ 0.1% ตามลำดับ2.2. Immunohistochemistry นั้น IPSCs มนุษย์และความแตกต่างเซลล์ที่ถาวรใน paraformaldehyde 4% สำหรับ 10 นาทีหลังจาก permeabilization 0.2% 100 X ไตรตั้นสำหรับ 5 นาทีตัวอย่างบล็อกใช้บัฟเฟอร์ (5% วัวบล็อกserum albumin, 0.1% Tween-20 ใน PBS) สำหรับ 30 นาทีตัวอย่างที่ incubated กับ heterochromatin ป้องกันอย่างใดอย่างหนึ่ง1