2.3. Alcohol dehydrogenase activity

2.3. Alcohol dehydrogenase activity assays
Spectrophotometric measurements were performed at 340 nm
and at 25 C in a Shimadzu UV-1601 spectrophotometer. Sodium
pyrophosphate buffer, NAD+ and drug solutions were prewarmed
to 25 C. An aliquot of the S9 liver fraction was defrosted and kept
on ice during the experiments. The assays were performed in a final
volume of 1 ml in a 1 cm optical path quartz cuvette containing sodium
pyrophosphate buffer (22 mM), S9 liver fraction (143 lg total
protein), and NAD+ solution (7.5 mM). An auto-zero at 340 nm was
performed and the changes in absorbance registered during 4 min
(blank without substrate), corresponding to a steady increase in
the optical density due to a non-specificNADHformation. Then, ethanol
95% (final concentration 3.2% v/v; 550 mM) was rapidly added
and mixed, and the absorbance recorded each second for another
4 min. When xenobiotics were tested, the volume of pyrophosphate
buffer was reduced to keep the same final volume in the cuvette.
Alprazolam (1.0 mM), cimetidine (0.1  103 to 10.0 mM), flunitrazepam
(0.04 mM), tramadol (0.1  103 to 10.0 mM) and 4-MP
(0.01  103 to 1.0 mM) were added prior to the addition of NAD+
and substrate. Aproper control withDMSO(1% (v/v) final concentration)
was done to exclude the effect of this solvent.
ADH specific activity was calculated from the differences in
absorbance before and after the addition of ethanol during 4 min
(DA340/min, see Fig. 1). NADH concentration was calculated using
6.22 as the millimolar extinction coefficient of b-NADH at 340 nm,
and normalized to the protein used in the assay (mU/mg protein).
The known inhibitor of ethanol metabolism, 4-MP, was used as a positive
control.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3. แอลกอฮอล์ dehydrogenase กิจกรรม assaysดำเนินการประเมิน spectrophotometric ที่ 340 nmและ ที่ 25 C ในเครื่องทดสอบกรดด่าง UV-1601 ของ Shimadzu โซเดียมมี prewarmed pyrophosphate บัฟเฟอร์ และ + และยาโซลูชั่นการค. 25 เป็นส่วนลงตัวของ S9 defrosted และเก็บเศษตับบนน้ำแข็งในระหว่างการทดลอง Assays ได้ดำเนินการในสุดปริมาณ 1 ml ในควอตซ์ cuvette เส้นทางแสง 1 ซ.ม.ประกอบด้วยโซเดียมบัฟเฟอร์ pyrophosphate (22 mM), S9 ตับเศษ (143 lg ทั้งหมดโปรตีน), และและ + โซลูชั่น (7.5 mM) ศูนย์รถยนต์การที่ 340 nm มีดำเนินการ และจดทะเบียนเปลี่ยนแปลง absorbance ในช่วงนาทีที่ 4(ว่างไม่ มีพื้นผิว), ที่สอดคล้องกับการเพิ่มความมั่นคงความหนาแน่นออปติคอลเนื่องจากยังไม่ใช่-specificNADHformation เอทานอลแล้ว95% (ความเข้มข้นสุดท้าย 3.2% v/v; 550 mM) มีเพิ่มอย่างรวดเร็วและแบบ ผสม และ absorbance ที่บันทึกแต่ละวินาทีในอีก4 นาที เมื่อทดสอบ xenobiotics ปริมาณของ pyrophosphateบัฟเฟอร์ถูกลดลงเพื่อให้ปริมาณสุดท้ายเหมือนใน cuvetteAlprazolam (1.0 mM), ไซเมทิดีน (0.1 mM 10 3-10.0), flunitrazepam(0.04 mM), ทรามาดอล (0.1 mM 10 3-10.0) และ 4 MP(0.01 มม. 10 3-1.0) เพิ่มก่อนการเพิ่มและ +และพื้นผิว WithDMSO Aproper ควบคุม (1% (v/v) ความเข้มข้นสุดท้าย)ได้ทำการแยกผลของตัวทำละลายนี้คำนวณจากความแตกต่างในกิจกรรมอัซabsorbance ก่อน และ หลังการเพิ่มเอทานอลในนาทีที่ 4(DA340/min ดู Fig. 1) มีคำนวณโดยใช้ความเข้มข้นของ NADH6.22 เป็นสัมประสิทธิ์สูญพันธุ์ millimolar ของ b-NADH ที่ 340 nmและมาตรฐานการโปรตีนที่ใช้ในการทดสอบ (โปรตีนหมู่/มิลลิกรัม)ผลชื่อเสียงของเอทานอล เผาผลาญ 4 MP ถูกใช้เป็นตัวบวกควบคุม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 กิจกรรมการตรวจแอลกอฮอล์ dehydrogenase
วัดสเปกได้ดำเนินการที่ 340
นาโนเมตรและ25 องศาเซลเซียสใน Shimadzu spectrophotometer UV-1601 โซเดียมบัฟเฟอร์ pyrophosphate, NAD + และการแก้ปัญหายาเสพติดที่ถูก prewarmed ถึง 25 องศาเซลเซียส aliquot ของส่วนตับ S9 ถูกละลายและเก็บไว้บนน้ำแข็งในระหว่างการทดลอง ตรวจได้ดำเนินการในขั้นสุดท้ายปริมาณ 1 มิลลิลิตรใน 1 ซมเส้นทาง cuvette ควอทซ์ออปติคอลที่มีโซเดียมบัฟเฟอร์pyrophosphate (22 มิลลิเมตร) ส่วนตับ S9 (143 แอลจีรวมโปรตีน) และวิธีการแก้ปัญหา NAD + (7.5 มิลลิเมตร) อัตโนมัติศูนย์ที่ 340 นาโนเมตรได้รับการดำเนินการและการเปลี่ยนแปลงในการดูดกลืนแสงที่ลงทะเบียนในช่วง4 นาที(ว่างเปล่าโดยไม่ต้องตั้งต้น) ที่สอดคล้องกับการเพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องในความหนาแน่นของแสงเกิดจากการที่ไม่specificNADHformation จากนั้นเอทานอล95% (ความเข้มข้นสุดท้าย 3.2% ปริมาตร / ปริมาตร; 550 มิลลิ) ถูกเพิ่มเข้ามาอย่างรวดเร็วและผสมและการดูดกลืนแสงที่บันทึกไว้ในแต่ละครั้งที่สองอีก4 นาที เมื่อ xenobiotics ถูกทดสอบปริมาณของ pyrophosphate บัฟเฟอร์ลดลงเพื่อให้เล่มสุดท้ายเดียวกันใน cuvette ได้. Alprazolam (1.0 มิลลิเมตร) cimetidine (0.1? 10? 3-10.0 มิลลิ) flunitrazepam (0.04 มิลลิเมตร) Tramadol (0.1? 10 3-10.0 มิลลิ) และ 4-MP (0.01? 10? 3-1.0 มิลลิเมตร) ถูกเพิ่มก่อนที่จะมีการเพิ่มของ NAD + และพื้นผิว Aproper ควบคุม withDMSO (1% (v / v) สุดท้ายเข้มข้น) ได้ดำเนินการที่จะไม่รวมผลกระทบของตัวทำละลายนี้. กิจกรรมดะห์ที่เฉพาะเจาะจงที่คำนวณได้จากความแตกต่างในการดูดกลืนแสงก่อนและหลังการเพิ่มของเอทานอลในช่วง 4 นาที (DA340 / นาทีให้ดู รูปที่ 1). ความเข้มข้นของ NADH ที่คำนวณโดยใช้6.22 เป็นค่าสัมประสิทธิ์การสูญเสีย millimolar ของ B-NADH ที่ 340 นาโนเมตรและปกติโปรตีนที่ใช้ในการทดสอบนี้(MU / มิลลิกรัมโปรตีน). ยับยั้งที่รู้จักกันของการเผาผลาญเอทานอล 4 สถูกใช้เป็น บวกการควบคุม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 แอลกอฮอล์ dehydrogenase กิจกรรมการวัด )
) มีการปฏิบัติที่ 340 nm
ที่ 25  C ใน Shimadzu uv-1601 วัสดุ โซเดียมไพโร
บัฟเฟอร์ , NAD และโซลูชั่นยา prewarmed
25  C เป็นส่วนลงตัวของ 3 ส่วนคือตับละลายและเก็บไว้
บนน้ำแข็งในระหว่างการทดลอง หรือมีการปฏิบัติในสุดท้าย
ปริมาตร 1 มิลลิลิตร ใน 1 เส้นทางแสงควอตซ์ที่มีโซเดียมไพโรคิวเวตต์
บัฟเฟอร์ซม. ( 22 มม. ) S9 ตับเศษส่วน ( 143 LG รวม
โปรตีน ) , และโซลูชั่น size 7.5 มม. ) รถยนต์ศูนย์ที่ 340 นาโนเมตรเท่ากับ
ดำเนินการและการเปลี่ยนแปลงในค่าลงทะเบียนในช่วง 4 นาที
( ว่างไม่มีฐานรอง ) ที่เพิ่มขึ้น
แสงความหนาแน่น เนื่องจากไม่ specificnadhformation . แล้วเอทานอล
95% ( สุดท้ายความเข้มข้น 3.2 % v / v ; 550 mm ) เพิ่มอย่างรวดเร็ว
และผสมและค่าบันทึกแต่ละที่สองอีก
4 นาทีเมื่อ xenobiotics ทดสอบปริมาณไพโร
บัฟเฟอร์การเก็บเสียงสุดท้ายเดียวกันในพิทยาพล .
อัลปราโซแลม ( มม. ) , ไซเมททิดีน ( 0.1  10  3 ถึง 10.0 มม. ) , ฟลูไนตราซีแพม
( 0.04 มม. ) , tramadol ( 0.1  10  3 ถึง 10.0 มม. ) และแบบ
( 0.01  10  3 ต่อ 10 mm ) เพิ่มก่อน นอกจาก NAD
กับพื้นผิว withdmso ควบคุม aproper ( 1% ( v / v ) ความเข้มข้นสุดท้าย )
ได้รวมผลของตัวทำละลายนี้ กิจกรรมที่เฉพาะเจาะจง
ADH คำนวณได้จากความแตกต่างของค่าก่อนและหลัง
2
( da340 เอทานอลในช่วง 4 นาที / นาที ดูรูปที่ 1 ) ความเข้มข้นของการคำนวณโดยใช้
622 เป็นพบว่าค่าสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ b-nadh ที่ 340 นาโนเมตร
และคะแนนทีปกติกับโปรตีนที่ใช้ในการทดสอบ ( โปรตีน MU / มก. ) .
รู้จักยับยั้งเซลล์เมแทบอลิซึม แบบ ถูกใช้เป็นตัวควบคุมบวก