Human embryonic stem cells derived

Human embryonic stem cells derived from abnormal blastocyst donated by Marfan syndrome patient
Abstract
Human embryonic stem cell (hESC) line was derived from abnormal blastocyst donated by Marfan syndrome patient after preimpantation genetic diagnosis (PGD) treatment. DNA sequencing analysis confirmed that the hESC line carried the heterozygous deletion mutation, c.3536delA, of FBN1 gene. Characteristic tests proved that the hESC line presented typical markers of pluripotency and had the capability to form the three germ layers both in vitro and in vivo.

Resource table:

Name of Stem Cell construct chHES-419
Institution National Engineering and Research Center of Human Stem Cell
Person who created resource Xiaoying Zhou, Qi Ouyang
Contact person and email Qi Ouyang: [e-mail]
Date archived/stock date Oct 23, 2014
Origin Abnormal blastocyst from Marfan syndrome patient
Type of resource Human embryonic stem cells derived from PGD-analyzed abnormally blastocyst
Sub-type Cell line
Key transcription factors NANOG, OCT4, SOX2, KLF4, TERF1, THY1
Authentication Identity and purity of cell line confirmed (Fig. 1)
Link to related literature (direct URL links and full references) N/A
Information in public databases N/A
Full-size table
Table optionsView in workspaceDownload as CSV

1. Resource details
Human embryonic stem cell (hESC) line chHES-419 was derived from abnormal blastocyst donated by Marfan syndrome patient who underwent preimplantation genetic diagnosis (PGD) treatment. DNA sequencing analysis confirmed a heterozygous deletion mutation, c.3536delA, of FBN1 in the cells. The deletion caused a frameshift at amino acid 1179 (glutamine) resulting in early termination after 25 abnormal amino acid residues (Q1179Rfs*25), indicating the pathogenic effect of this mutation ( Fig. 1A). The result is consistent with the proband. The cells displayed pluripotent cell morphology ( Fig. 1B), expressed pluripotency related genes ( Fig. 1C) and were positive for a set of pluripotent markers OCT3/4, NANOG, TRA-1-60 and TRA-1-81 as well as alkaline phosphatase ( Fig. 1D). The cells had the capability to differentiate into the derivatives from all the three germ layers both in vitro ( Fig. 1E) and in vivo ( Fig. 1F). In addition, this line maintained the normal karyotype 46, XX during long-term culture ( Fig. 1G).

Fig. 1.
Characterization of chHES-419 cells. (A) A heterozygous mutation, c.3536delA, of FBN1 was identified in chHES-419 cells; (B) cells showed typical round shape colonies on the MEF feeder layer; (C) pluripotent genes expressed in chHES-419 cells, NANOG, OCT3/4, SOX2, TERF1, THY1 and KLF4 were detected by RT-PCR; (D) undifferentiated colonies were positive for the pluripotency markers of NANOG, OCT4, TRA-1-60, TRA-1-81 and AKP. Nuclei staining with DAPI was in the lower right corner. Scale bar = 100 μm; (E) derivatives from embryoid bodies of chHES-419 cells could differentiate into ectoderm (TUJ1), mesoderm (SMA) and endoderm (AFP) in vitro. Scale bar = 50 μm; (F) histological sections of teratomas formed by the chHES-419 hESC line contain tissues derived from three germ layers. Scale bar = 50 μm; (G) chHES-419 has a normal karyotype 46, XX.

Figure optionsDownload full-size imageDownload high-quality image (860 K)Download as PowerPoint slide
2. Materials and methods
2.1. hESC line derivation and cell culture
The ethical committee of Reproductive and Genetic Hospital of CITIC-Xiangya approved the study. A blastocyst with disease-causing mutation was donated by a Marfan syndrome patient with informed consent. The methodology used for hESC line derivation was performed as previously described (Lin et al., 2009). The inner cell mass was mechanically isolated and plated on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeders. The cells were cultured in ES medium containing DMEM/F12 supplemented with 15% knockout serum replacement, 2 mM nonessential amino acids, 2 mM L-glutamine, 0.1 mM β-mercaptoethanol and 4 ng/mL of basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) (all from Invitrogen). Once the embryo outgrowth was observed, it was transmitted onto fresh feeders and obtained the hESC-colony morphology during prolonged culture. hESC colonies were mechanically passaged every 7 days.

2.2. Genetic diagnosis.
Genomic DNA of the cells was extracted using QIAmp® DNA mini kit (QIAGEN). PCR was conducted using 50 μL PCR amplification reaction mixture which contained 1.5 μL of 100 ng genomic DNA, 1 μL of 1.0 μM of each primer (the forward primer: 5′-GCCAAAGTTGGAAGCTTATG-3′ and the reverse primer: 5′-TAACATAACATAACATAAAATAAAG-3′) and 25 μL of 2 × GreenMaster Mix (Promega). Cycling conditions were as follows: 95 °C for 1.5 min followed by 35 cycles of amplification (95 °C denaturation for 40 s, 56 °C annealing for 40 s, 72 °C elongation for 40 s) and a final extension at 72 °C for 5 min. The PCR products were determined by Sanger sequencing using a BigDye Terminator cycle sequencing kit v3.1 and an ABI 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

2.3. RT-PCR
Total RNA was extracted with TRIzol (Invitrogen) and complementary DNA (cDNA) was synthesized via using Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche). The RT-PCR reaction was carried out as follows: 95 °C for 2 min; 35 cycles of amplification (95 °C for 30 s, 54–64 °C for 30 s and 72 °C for 30 s) and a final extension at 72 °C for 5 min. PCR products were separated by electrophoresis on a 1.5% agarose gel, and images were taken on a UV transluminator. The primers were listed in Table 1.

Table 1.
List of primers used in RT-PCR.

Genes Primer sequence Temp. (°C) Product size (bp)
NANOG 5′-TGAACCTCAGCTACAAACAG-3′ 56 154
5′-TGGTGGTAGGAAGAGTAAAG-3′
OCT3/4 5′-AGCGAACCAGTATCGAGAAC-3′ 56 142
5′-TTACAGAACCACACTCGGAC-3′
SOX2 5′-AGCTACAGCATGATGCAGGA-3′ 56 126
5′-GGTCATGGAGTTGTACTGCA-3′
TERF1 5′-GCAACAGCGCAGAGGCTATTATT-3′ 58 159
5′-AGGGCTGATTCCAAGGGTGTAA-3′
THY1 5′-AGAATACCAGCAGTTCACCCATCC-3′ 58 273
5′-CCTCACACTTGACCAGTTTGTCTCTG-3′
KLF4 5′-GCCGCTCCATTACCAAGAGC-3′ 57 167
5′-GGTGTGCCTTGAGATGGGAA-3′
β-ACTIN 5′-TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3′ 58 194
5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′
Full-size table
Table optionsView in workspaceDownload as CSV
2.4. Immunocytochemistry and alkaline phosphatase staining
chHES-419 cells were fixed with 4% paraformaldehyde (PFA), then blocked with 10% donkey serum and incubated with primary antibodies overnight at 4 °C. For intracellular antigen, cells were permeabilized in 0.2% Triton-X 100 before blocking. The following primary antibodies were used: mouse anti-OCT4 (1:200, Santa Cruz Biotechnology), rabbit anti-NANOG (1:100, Abcam), mouse anti-TRA-1-60 (1:50, Millipore), mouse anti-TRA-1-81 (1:50, Millipore), mouse anti-β-tubulin (1:800, Sigma), mouse anti-AFP (1:500, Sigma), and mouse anti-SMA (1:100, Millipore). After rinsing to remove unbound antibodies, Localization of antigens was visualized by using Alexa Fluor® 488 donkey anti-mouse lgG (1:1000, Life Technologies) or Alexa Fluor® 488 donkey anti-rabbit lgG (1:1000, Life Technologies). Nuclei were counterstained with DAPI (1:1000, Sigma). In addition, alkaline phosphatase activity was detected with BCIP/NBT Kit (Invitrogen). Images were acquired in an epifluorescence microscopy (Nikon Eclipse TE2000-U).

2.5. In vitro and in vivo differentiation assay
For in vitro differentiation assay, hESCs were detached to grow as aggregates in suspension for 7 days in ES medium without bFGF, then transmitted onto Matrigel (BD) coated 4-well plates for another 14-day culture. The derivatives of embryoid bodies were processed for immunocytochemistry analysis.

For in vivo differentiation assay, 1 × 106 cells were injected into muscle of right hind limb of SCID mouse. After 10 weeks, teratoma was harvested and fixed with 4% paraformaldehyde. To identify the derivatives from three germ layers, hematoxylin and eosin (H&E) staining ( Fig. 1G) was carried out for the histological analysis.

2.6. Karyotyping analysis
chHES-419 cells were cultured in mTeSR™1(STEMCELL) for 3–5 days, then treated with 0.1 μg/mL of KaryoMAX® Colcemid™ solution (Life Technologies) for 3 h and dissociated with Accutase (Millipore) into single cells for standard G-banding karyotype analysis.

2.6.1. Verification and Authentication.
Karyotyping and sequencing analysis were performed at Reproductive & Genetic Hospital of CITIC-Xiangya. Twenty metaphase cells were observed and all had a normal karyotype of 46, XX. After locus specific PCR, Sanger sequencing analysis confirmed a heterozygous deletion mutation, c.3536delA, of FBN1 in chHES-419 cells that is consistent with that of the proband.

Acknowledgments
This work was supported by grants from the National Basic Research Program of China (973 program 2011CB964901 and 2012CB944901), the National Natural Science Foundation of China (81222007 and 31101053) and Central South University innovation project of research (2014zzts290). We thank the genetic laboratory and IVF team of the Reproductive & Genetic Hospital of CITIC-Xiangya for their assistance.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สเต็มเซลล์ตัวอ่อนมนุษย์ที่สืบทอดมาจากอดีตความผิดปกติที่บริจาค โดยผู้ป่วยกลุ่มอาการ Marfanบทคัดย่อมนุษย์ตัวอ่อนเซลล์ต้นกำเนิด (hESC) บรรทัดที่มาจากอดีตความผิดปกติที่บริจาค โดยผู้ป่วยกลุ่มอาการ Marfan หลังการรักษาการวินิจฉัยทางพันธุกรรม (PGD) preimpantation การวิเคราะห์ลำดับดีเอ็นเอยืนยันว่า บรรทัด hESC ดำเนินการลบ heterozygous กลายพันธุ์ c.3536delA ของยีน FBN1 ลักษณะการทดสอบพิสูจน์ว่า บรรทัด hESC แสดงเครื่องหมายทั่วไปของ pluripotency และมีความสามารถในการจัดชั้นของจมูกสามทั้งในหลอดทดลอง และในสัตว์ทดลองตารางทรัพยากร:ชื่อของเซลล์ต้นกำเนิดสร้าง chHES 419 สถาบันวิศวกรรมแห่งชาติและศูนย์วิจัยของเซลล์ต้นกำเนิดมนุษย์ บุคคลที่สร้างทรัพยากร Xiaoying โจว Ouyang ชี่ ติดต่อ และอีเมล์ Ouyang ชี่: [e-mail] วันเก็บถาวร/หุ้นวัน 23 oct, 2014 อดีตที่ผิดปกติมาจากผู้ป่วยกลุ่มอาการ Marfan ชนิดของทรัพยากรมนุษย์ตัวอ่อนสเต็มเซลล์มาวิเคราะห์ PGD อย่างผิดปกติอดีต ชนิดย่อยเซลล์รายการ ปัจจัยสำคัญ transcription NANOG, OCT4, SOX2, KLF4, TERF1, THY1 ตรวจสอบตัวตนและความบริสุทธิ์ของเซลล์เส้นยืนยัน (Fig. 1) เชื่อมโยงเกี่ยวข้องวรรณกรรม (การเชื่อมโยง URL โดยตรงและข้อมูลอ้างอิงเต็ม) n/a ข้อมูลในฐานข้อมูลสาธารณะ n/a ตารางขนาดเต็มตาราง optionsView ใน workspaceDownload เป็น CSV1. รายละเอียดทรัพยากรมนุษย์ตัวอ่อนเซลล์ต้นกำเนิด (hESC) บรรทัด chHES-419 รับมาจากอดีตความผิดปกติที่บริจาค โดยผู้ป่วยกลุ่มอาการ Marfan ซึ่งรับการรักษาวินิจฉัยพันธุกรรม preimplantation (PGD) การวิเคราะห์ลำดับดีเอ็นเอยืนยันการลบ heterozygous กลายพันธุ์ c.3536delA ของ FBN1 ในเซลล์ การลบเกิด frameshift ที่กรดอะมิโน 1179 (glutamine) ในช่วงสิ้นสุดหลังจากการตกค้างของกรดอะมิโนผิดปกติ 25 (Q1179Rfs * 25), แสดงผล pathogenic นี้กลายพันธุ์ (Fig. 1A) ผลได้สอดคล้องกับที่ proband เซลล์แสดง pluripotent เซลล์สัณฐานวิทยา (Fig. 1B), แสดง pluripotency ที่เกี่ยวข้องกับยีน (Fig. 1C) และได้ปรับการตั้งค่าของเครื่องหมาย pluripotent OCT3/4, NANOG ตรา-1-60 และตรา-1-81 เป็นอัลคาไลน์ฟอสฟาเตส (Fig. 1D) เซลล์ที่มีความสามารถในการแยกแยะเป็นอนุพันธ์จากทั้งหมดสามจมูกชั้นทั้ง ในหลอด (Fig. 1E) และ vivo (Fig. 1F) นอกจากนี้ บรรทัดนี้รักษาแบบปกติ karyotype 46, XX ระหว่างวัฒนธรรมระยะยาว (Fig. 1G)Fig. 1 คุณสมบัติของเซลล์ chHES 419 (A) แบบ heterozygous กลายพันธุ์ c.3536delA ของ FBN1 ระบุในเซลล์ chHES 419 (ข) แสดงให้เห็นโดยทั่วไปเซลล์กลมทรงอาณานิคมบนชั้นป้อน MEF (ค) pluripotent ยีนในเซลล์ chHES-419, NANOG, OCT3/4, SOX2, TERF1, THY1 และ KLF4 พบ โดย RT-PCR (D) undifferentiated อาณานิคมได้ค่าบวกสำหรับเครื่องหมาย pluripotency NANOG, OCT4 ตรา-1-60 ตรา-1-81 และ AKP ย้อมสี ด้วย DAPI แอลฟาอยู่มุมขวาล่าง แถบมาตราส่วน = 100 μm (E) อนุพันธ์จากศพ embryoid chHES 419 เซลล์อาจแตกต่างไปเอ็กโทเดิร์ม (TUJ1), mesoderm (SMA) และเอนโดเดิร์ม (AFP) ใน แถบมาตราส่วน = 50 μm (F) ส่วนสรีรวิทยาของ teratomas ที่เกิดขึ้นจากรายการ chHES 419 hESC ประกอบด้วยเนื้อเยื่อที่ได้จากจมูกสามชั้น แถบมาตราส่วน = 50 μm (G) chHES-419 ได้เป็นปกติ karyotype 46, XXรูป optionsDownload imageDownload ขนาดเต็มคุณภาพภาพ (860 K) ดาวน์โหลดเป็นภาพนิ่ง PowerPoint2. วัสดุและวิธีการ2.1. hESC บรรทัดมาและเซลล์วัฒนธรรมคณะกรรมการจริยธรรมของการสืบพันธุ์และพันธุกรรมโรงพยาบาลโรงแรมซีติค-Xiangya อนุมัติการศึกษา อดีตกับโรคที่ทำให้เกิดการกลายพันธุ์ที่บริจาค โดยผู้ป่วยกลุ่มอาการ Marfan กับแจ้งความยินยอม วิธีใช้สำหรับ hESC บรรทัดมาถูกทำเป็นอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Lin et al., 2009) เซลล์ภายในมวลกลไกแยกต่างหาก และชุบบนเมาส์ feeders fibroblast ตัวอ่อน (MEF) เซลล์มีอ่างใน ES ประกอบด้วย DMEM/F12 เสริมแทนซีรั่มชนะน็อกโดยเทคนิค 15% กรดอะมิโนไม่จำเป็น 2 มม. 2 มม. L glutamine, 0.1 mM β-mercaptoethanol และ 4 ng/mL ของ Fibroblast เจริญเติบโตปัจจัยพื้นฐาน (bFGF) (ทั้งหมดจาก Invitrogen) เมื่อตัวอ่อนไปได้สังเกต จะถูกส่งไป feeders สด และรับสัณฐานวิทยาของโคโลนี hESC ระหว่างวัฒนธรรมนาน hESC อาณานิคมถูกกลไก passaged ทุกวัน2.2. พันธุกรรมวินิจฉัยGenomic DNA ของเซลล์ถูกสกัดโดยใช้ดีเอ็นเอ® QIAmp ชุดมินิ (QIAGEN) วิธี PCR โดยใช้ 50 μL PCR ขยายปฏิกิริยาผสมซึ่งมีอยู่ μL 1.5 ของ 100 ng genomic DNA, μL 1 ของ μM 1.0 แต่ละพื้น (พื้นไปข้างหน้า: 5′-GCCAAAGTTGGAAGCTTATG-3′ และรองพื้นกลับ: 5′-TAACATAACATAACATAAAATAAAG-3′) และ μL ของ 2 ×ผสม GreenMaster (Promega) 25 สภาพขี่ได้ดังนี้: 95 ° C สำหรับ 1.5 นาทีตามรอบ 35 ของขยาย (denaturation 95 ° C สำหรับ 40 s, 56 ° C การอบเหนียวสำหรับ s, 72 ° C elongation สำหรับ 40 40 s) และนามสกุลเป็นขั้นสุดท้ายที่ 72 ° C สำหรับ 5 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกกำหนด โดยลำดับเบสใช้ตัวเทอร์มิเนเตอร์ BigDye วงจรลำดับชุด v3.1 และการลักชัวรี่ 3130XL พันธุกรรมวิเคราะห์ (Biosystems ใช้) Sanger2.3. RT-PCRมีสกัดอาร์เอ็นเอรวมกับ TRIzol (Invitrogen) และดีเอ็นเอเพิ่มเติม (cDNA) ถูกสังเคราะห์ผ่านใช้ cDNA สแตรนด์แรก Transcriptor ชุดสังเคราะห์ (Roche) ปฏิกิริยา RT-PCR ได้ดำเนินการดังนี้: 95 ° C สำหรับ 2 นาที รอบ 35 ของขยาย (95 ° C สำหรับ 30 s, 54-64 ° C s และ 72 ° C สำหรับ 30 30 s) ต่อท้ายที่ 72 ° C 5 นาทีผลิตภัณฑ์ PCR ถูกคั่น ด้วย electrophoresis ในวุ้น 1.5% agarose และภาพที่ถ่ายบน UV transluminator ไพรเมอร์ที่ถูกแสดงในตารางที่ 1ตารางที่ 1 รายการของไพรเมอร์ที่ใช้ RT-PCRรองพื้นของยีนลำดับชั่วคราว (° C) ขนาดสินค้า (bp) NANOG 5′-TGAACCTCAGCTACAAACAG-3′ 56 154 5′-TGGTGGTAGGAAGAGTAAAG-3′ OCT3/4 5′-AGCGAACCAGTATCGAGAAC-3′ 56 142 5′-TTACAGAACCACACTCGGAC-3′ SOX2 5′-AGCTACAGCATGATGCAGGA-3′ 56 126 5′-GGTCATGGAGTTGTACTGCA-3′ TERF1 5′-GCAACAGCGCAGAGGCTATTATT-3′ 58 159 5′-AGGGCTGATTCCAAGGGTGTAA-3′ THY1 5′-AGAATACCAGCAGTTCACCCATCC-3′ 58 273 5′-CCTCACACTTGACCAGTTTGTCTCTG-3′ KLF4 5′-GCCGCTCCATTACCAAGAGC-3′ 57 167 5′-GGTGTGCCTTGAGATGGGAA-3′ β-ACTIN 5′-TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3′ 58 194 5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′ Full-size tableTable optionsView in workspaceDownload as CSV2.4. Immunocytochemistry and alkaline phosphatase stainingchHES-419 cells were fixed with 4% paraformaldehyde (PFA), then blocked with 10% donkey serum and incubated with primary antibodies overnight at 4 °C. For intracellular antigen, cells were permeabilized in 0.2% Triton-X 100 before blocking. The following primary antibodies were used: mouse anti-OCT4 (1:200, Santa Cruz Biotechnology), rabbit anti-NANOG (1:100, Abcam), mouse anti-TRA-1-60 (1:50, Millipore), mouse anti-TRA-1-81 (1:50, Millipore), mouse anti-β-tubulin (1:800, Sigma), mouse anti-AFP (1:500, Sigma), and mouse anti-SMA (1:100, Millipore). After rinsing to remove unbound antibodies, Localization of antigens was visualized by using Alexa Fluor® 488 donkey anti-mouse lgG (1:1000, Life Technologies) or Alexa Fluor® 488 donkey anti-rabbit lgG (1:1000, Life Technologies). Nuclei were counterstained with DAPI (1:1000, Sigma). In addition, alkaline phosphatase activity was detected with BCIP/NBT Kit (Invitrogen). Images were acquired in an epifluorescence microscopy (Nikon Eclipse TE2000-U).2.5. In vitro and in vivo differentiation assayFor in vitro differentiation assay, hESCs were detached to grow as aggregates in suspension for 7 days in ES medium without bFGF, then transmitted onto Matrigel (BD) coated 4-well plates for another 14-day culture. The derivatives of embryoid bodies were processed for immunocytochemistry analysis.For in vivo differentiation assay, 1 × 106 cells were injected into muscle of right hind limb of SCID mouse. After 10 weeks, teratoma was harvested and fixed with 4% paraformaldehyde. To identify the derivatives from three germ layers, hematoxylin and eosin (H&E) staining ( Fig. 1G) was carried out for the histological analysis.2.6. Karyotyping analysischHES-419 cells were cultured in mTeSR™1(STEMCELL) for 3–5 days, then treated with 0.1 μg/mL of KaryoMAX® Colcemid™ solution (Life Technologies) for 3 h and dissociated with Accutase (Millipore) into single cells for standard G-banding karyotype analysis.2.6.1. Verification and Authentication.Karyotyping and sequencing analysis were performed at Reproductive & Genetic Hospital of CITIC-Xiangya. Twenty metaphase cells were observed and all had a normal karyotype of 46, XX. After locus specific PCR, Sanger sequencing analysis confirmed a heterozygous deletion mutation, c.3536delA, of FBN1 in chHES-419 cells that is consistent with that of the proband.AcknowledgmentsThis work was supported by grants from the National Basic Research Program of China (973 program 2011CB964901 and 2012CB944901), the National Natural Science Foundation of China (81222007 and 31101053) and Central South University innovation project of research (2014zzts290). We thank the genetic laboratory and IVF team of the Reproductive & Genetic Hospital of CITIC-Xiangya for their assistance.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อนมนุษย์ที่ได้มาจากตัวอ่อนที่ผิดปกติบริจาคมาจากผู้ป่วยโรค Marfan Human embryonic stem cells derived from abnormal blastocyst donated by Marfan syndrome patient
บทคัดย่อมนุษย์เซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อน (hESC) สายที่ได้มาจากตัวอ่อนที่ผิดปกติบริจาคโดยผู้ป่วยโรค Marfan หลังจาก preimpantation วินิจฉัยทางพันธุกรรม (PGD) การรักษา Abstract
การวิเคราะห์ลำดับดีเอ็นเอยืนยันว่าสาย hESC ดำเนินการกลายพันธุ์ลบ heterozygous, c.3536delA ของยีน FBN1 Human embryonic stem cell (hESC) line was derived from abnormal blastocyst donated by Marfan syndrome patient after preimpantation genetic diagnosis (PGD) treatment. DNA sequencing analysis confirmed that the hESC line carried the heterozygous deletion mutation, c.3536delA, of FBN1 gene. Characteristic tests proved that the hESC line presented typical markers of pluripotency and had the capability to form the three germ layers both in vitro and in vivo.

Resource table:

Name of Stem Cell construct chHES-419
Institution National Engineering and Research Center of Human Stem Cell
Person who created resource Xiaoying Zhou, Qi Ouyang
Contact person and email Qi Ouyang: [e-mail]
Date archived/stock date Oct 23, 2014
Origin Abnormal blastocyst from Marfan syndrome patient
Type of resource Human embryonic stem cells derived from PGD-analyzed abnormally blastocyst
Sub-type Cell line
Key transcription factors NANOG, OCT4, SOX2, KLF4, TERF1, THY1
Authentication Identity and purity of cell line confirmed (Fig. 1)
Link to related literature (direct URL links and full references) N/A
Information in public databases N/A
Full-size table
Table optionsView in workspaceDownload as CSV

1. Resource details
Human embryonic stem cell (hESC) line chHES-419 was derived from abnormal blastocyst donated by Marfan syndrome patient who underwent preimplantation genetic diagnosis (PGD) treatment. DNA sequencing analysis confirmed a heterozygous deletion mutation, c.3536delA, of FBN1 in the cells. The deletion caused a frameshift at amino acid 1179 (glutamine) resulting in early termination after 25 abnormal amino acid residues (Q1179Rfs*25), indicating the pathogenic effect of this mutation ( Fig. 1A). The result is consistent with the proband. The cells displayed pluripotent cell morphology ( Fig. 1B), expressed pluripotency related genes ( Fig. 1C) and were positive for a set of pluripotent markers OCT3/4, NANOG, TRA-1-60 and TRA-1-81 as well as alkaline phosphatase ( Fig. 1D). The cells had the capability to differentiate into the derivatives from all the three germ layers both in vitro ( Fig. 1E) and in vivo ( Fig. 1F). In addition, this line maintained the normal karyotype 46, XX during long-term culture ( Fig. 1G).

Fig. 1.
Characterization of chHES-419 cells. (A) A heterozygous mutation, c.3536delA, of FBN1 was identified in chHES-419 cells; (B) cells showed typical round shape colonies on the MEF feeder layer; (C) pluripotent genes expressed in chHES-419 cells, NANOG, OCT3/4, SOX2, TERF1, THY1 and KLF4 were detected by RT-PCR; (D) undifferentiated colonies were positive for the pluripotency markers of NANOG, OCT4, TRA-1-60, TRA-1-81 and AKP. Nuclei staining with DAPI was in the lower right corner. Scale bar = 100 μm; (E) derivatives from embryoid bodies of chHES-419 cells could differentiate into ectoderm (TUJ1), mesoderm (SMA) and endoderm (AFP) in vitro. Scale bar = 50 μm; (F) histological sections of teratomas formed by the chHES-419 hESC line contain tissues derived from three germ layers. Scale bar = 50 μm; (G) chHES-419 has a normal karyotype 46, XX.

Figure optionsDownload full-size imageDownload high-quality image (860 K)Download as PowerPoint slide
2. Materials and methods
2.1. hESC line derivation and cell culture
The ethical committee of Reproductive and Genetic Hospital of CITIC-Xiangya approved the study. A blastocyst with disease-causing mutation was donated by a Marfan syndrome patient with informed consent. The methodology used for hESC line derivation was performed as previously described (Lin et al., 2009). The inner cell mass was mechanically isolated and plated on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeders. The cells were cultured in ES medium containing DMEM/F12 supplemented with 15% knockout serum replacement, 2 mM nonessential amino acids, 2 mM L-glutamine, 0.1 mM β-mercaptoethanol and 4 ng/mL of basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) (all from Invitrogen). Once the embryo outgrowth was observed, it was transmitted onto fresh feeders and obtained the hESC-colony morphology during prolonged culture. hESC colonies were mechanically passaged every 7 days.

2.2. Genetic diagnosis.
Genomic DNA of the cells was extracted using QIAmp® DNA mini kit (QIAGEN). PCR was conducted using 50 μL PCR amplification reaction mixture which contained 1.5 μL of 100 ng genomic DNA, 1 μL of 1.0 μM of each primer (the forward primer: 5′-GCCAAAGTTGGAAGCTTATG-3′ and the reverse primer: 5′-TAACATAACATAACATAAAATAAAG-3′) and 25 μL of 2 × GreenMaster Mix (Promega). Cycling conditions were as follows: 95 °C for 1.5 min followed by 35 cycles of amplification (95 °C denaturation for 40 s, 56 °C annealing for 40 s, 72 °C elongation for 40 s) and a final extension at 72 °C for 5 min. The PCR products were determined by Sanger sequencing using a BigDye Terminator cycle sequencing kit v3.1 and an ABI 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

2.3. RT-PCR
Total RNA was extracted with TRIzol (Invitrogen) and complementary DNA (cDNA) was synthesized via using Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche). The RT-PCR reaction was carried out as follows: 95 °C for 2 min; 35 cycles of amplification (95 °C for 30 s, 54–64 °C for 30 s and 72 °C for 30 s) and a final extension at 72 °C for 5 min. PCR products were separated by electrophoresis on a 1.5% agarose gel, and images were taken on a UV transluminator. The primers were listed in Table 1.

Table 1.
List of primers used in RT-PCR.

Genes Primer sequence Temp. (°C) Product size (bp)
NANOG 5′-TGAACCTCAGCTACAAACAG-3′ 56 154
5′-TGGTGGTAGGAAGAGTAAAG-3′
OCT3/4 5′-AGCGAACCAGTATCGAGAAC-3′ 56 142
5′-TTACAGAACCACACTCGGAC-3′
SOX2 5′-AGCTACAGCATGATGCAGGA-3′ 56 126
5′-GGTCATGGAGTTGTACTGCA-3′
TERF1 5′-GCAACAGCGCAGAGGCTATTATT-3′ 58 159
5′-AGGGCTGATTCCAAGGGTGTAA-3′
THY1 5′-AGAATACCAGCAGTTCACCCATCC-3′ 58 273
5′-CCTCACACTTGACCAGTTTGTCTCTG-3′
KLF4 5′-GCCGCTCCATTACCAAGAGC-3′ 57 167
5′-GGTGTGCCTTGAGATGGGAA-3′
β-ACTIN 5′-TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3′ 58 194
5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′
Full-size table
Table optionsView in workspaceDownload as CSV
2.4. Immunocytochemistry and alkaline phosphatase staining
chHES-419 cells were fixed with 4% paraformaldehyde (PFA), then blocked with 10% donkey serum and incubated with primary antibodies overnight at 4 °C. For intracellular antigen, cells were permeabilized in 0.2% Triton-X 100 before blocking. The following primary antibodies were used: mouse anti-OCT4 (1:200, Santa Cruz Biotechnology), rabbit anti-NANOG (1:100, Abcam), mouse anti-TRA-1-60 (1:50, Millipore), mouse anti-TRA-1-81 (1:50, Millipore), mouse anti-β-tubulin (1:800, Sigma), mouse anti-AFP (1:500, Sigma), and mouse anti-SMA (1:100, Millipore). After rinsing to remove unbound antibodies, Localization of antigens was visualized by using Alexa Fluor® 488 donkey anti-mouse lgG (1:1000, Life Technologies) or Alexa Fluor® 488 donkey anti-rabbit lgG (1:1000, Life Technologies). Nuclei were counterstained with DAPI (1:1000, Sigma). In addition, alkaline phosphatase activity was detected with BCIP/NBT Kit (Invitrogen). Images were acquired in an epifluorescence microscopy (Nikon Eclipse TE2000-U).

2.5. In vitro and in vivo differentiation assay
For in vitro differentiation assay, hESCs were detached to grow as aggregates in suspension for 7 days in ES medium without bFGF, then transmitted onto Matrigel (BD) coated 4-well plates for another 14-day culture. The derivatives of embryoid bodies were processed for immunocytochemistry analysis.

For in vivo differentiation assay, 1 × 106 cells were injected into muscle of right hind limb of SCID mouse. After 10 weeks, teratoma was harvested and fixed with 4% paraformaldehyde. To identify the derivatives from three germ layers, hematoxylin and eosin (H&E) staining ( Fig. 1G) was carried out for the histological analysis.

2.6. Karyotyping analysis
chHES-419 cells were cultured in mTeSR™1(STEMCELL) for 3–5 days, then treated with 0.1 μg/mL of KaryoMAX® Colcemid™ solution (Life Technologies) for 3 h and dissociated with Accutase (Millipore) into single cells for standard G-banding karyotype analysis.

2.6.1. Verification and Authentication.
Karyotyping and sequencing analysis were performed at Reproductive & Genetic Hospital of CITIC-Xiangya. Twenty metaphase cells were observed and all had a normal karyotype of 46, XX. After locus specific PCR, Sanger sequencing analysis confirmed a heterozygous deletion mutation, c.3536delA, of FBN1 in chHES-419 cells that is consistent with that of the proband.

Acknowledgments
This work was supported by grants from the National Basic Research Program of China (973 program 2011CB964901 and 2012CB944901), the National Natural Science Foundation of China (81222007 and 31101053) and Central South University innovation project of research (2014zzts290). We thank the genetic laboratory and IVF team of the Reproductive & Genetic Hospital of CITIC-Xiangya for their assistance.

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

มนุษย์ตัวอ่อนเซลล์ต้นกำเนิดที่ได้มาจากตัวอ่อนผิดปกติ บริจาคโดยผู้ป่วยกลุ่มอาการมาร์แฟน

มนุษย์เซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนที่เป็นนามธรรม ( hesc ) สายที่ได้มาจากการบริจาค โดยตัวอ่อนของผู้ป่วยกลุ่มอาการมาร์แฟน preimpantation การวินิจฉัยโรคทางพันธุกรรม ( PGD ) การรักษา ดีเอ็นเอการวิเคราะห์ยืนยันว่า hesc สายนำการกลายพันธุ์ , การสร้าง c.3536dela ของยีน fbn1 .