Cloning and Purification of Mm2279,

Cloning and Purification of Mm2279, Spn3210, Moth1224,
Avi5431, Tvn0515 Caur1903, and Cthe1199. The genes for
Mm2279, Spn3210, Moth1224, Avi5431, and Tvn0515 were cloned
into a pET-30a expression vector with C-terminal 6x His-tags.
Caur1903 was cloned into pET-42a with an N-terminal GST tag.
Cthe1199 was cloned as a tagless construct into pET-30a. E. coli BL-21
(DE3) cells were transformed with the recombinant plasmids and
plated onto LB-agarose containing 50 μg/mL kanamycin. One L
cultures (LB broth, kanamycin 50 μg/mL) were inoculated from the
resulting colonies and grown at 37 °C until the optical density at 600
nm reached 0.6. Protein expression was induced with 1 mM IPTG,
and the cultures were incubated for 20 h at 25 °C while shaking. The
cultures were centrifuged at 7000 rpm for 15 min, and the cell pellets
were disrupted by sonication in 35 mL of running buffer and PMSF.
DNA was precipitated by protamine sulfate. Proteins with a 6x His-tag
were loaded onto a 5 mL HisTrap column (GE Healthcare, U.S.A.)
with running buffer (20 mM HEPES, 250 mM NaCl, 250 mM
NH4SO4, 20 mM imidazole, pH 7.5) and eluted with a linear gradient
of elution buffer (20 mM HEPES, 250 mM NaCl, 250 mM NH4SO4,
500 mM imidazole, pH 7.5).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

โคลนและ Purification Mm2279, Spn3210, Moth1224,
Avi5431, Tvn0515 Caur1903 และ Cthe1199 ยีนสำหรับ
Mm2279, Spn3210, Moth1224, Avi5431 และ Tvn0515 ถูกโคลน
เป็นเวกเตอร์นิพจน์ 30a สัตว์เลี้ยงกับเทอร์มินัล C 6 x เขา-แท็ก.
Caur1903 ถูกโคลนในสัตว์เลี้ยง-42a ด้วยแท็ก GST N-เทอร์มินัลมีการ
Cthe1199 ถูกโคลนเป็นโครงสร้าง tagless เป็นสัตว์เลี้ยง-30a E. coli BL-21
เซลล์ (DE3) แตกต่าง recombinant plasmids และ
ชุบไปปอนด์ agarose ประกอบด้วยกานามัยซิน 50 μg/mL L หนึ่ง
วัฒนธรรม (ซุปปอนด์ กานามัยซิน 50 μg/mL) มี inoculated จาก
อาณานิคมที่เกิด และเติบโตที่ 37 ° C จนกระทั่งความหนาแน่นออปติคัลที่ 600
nm ถึง 0.6 นิพจน์โปรตีนถูกทำให้เกิดกับ 1 มม. IPTG,
และวัฒนธรรมถูก incubated สำหรับ h 20 ที่ 25 ° C ในขณะที่สั่น ใน
วัฒนธรรมถูก centrifuged ที่ 7000 รอบต่อนาที 15 นาที และขี้เซลล์
อยู่ระหว่างสองวัน โดย sonication ใน 35 มิลลิลิตรของ buffer และ PMSF
มีการตกตะกอนดีเอ็นเอ โดยซัลเฟต protamine โปรตีนกับ 6 x พระแท็ก
ถูกโหลดลงในคอลัมน์ HisTrap 5 mL (GE แพทย์ สหรัฐอเมริกา)
มีการเรียกใช้ buffer (20 มม. HEPES, NaCl, 250 มม. 250 มม
NH4SO4 อิมิดาโซล 20 มม. pH 7.5) และ eluted กับไล่เส้น
ของ elution buffer (HEPES, NaCl, 250 มม. NH4SO4, 250 มม. 20 มม.
อิมิดาโซล 500 มม. pH 7.5)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

โคลนและการทำให้บริสุทธิ์ของ Mm2279, Spn3210, Moth1224,
Avi5431, Tvn0515 Caur1903 และ Cthe1199 ยีนสำหรับ
Mm2279, Spn3210, Moth1224, Avi5431 และ Tvn0515 ถูกโคลน
เข้าไปในเวกเตอร์การแสดงออกของสัตว์เลี้ยงด้วย 30a 6x c-ขั้วแท็กของเขา
Caur1903 ถูกโคลนเข้าไปในสัตว์เลี้ยง 42A ด้วยแท็กภาษีมูลค่าเพิ่ม n-ขั้ว
Cthe1199 ถูกโคลนเป็น Tagless สร้างเป็นสัตว์เลี้ยงที่ 30a E. coli BL-21
(DE3) เซลล์ที่ถูกเปลี่ยนด้วยพลาสมิดสายผสมและ
ชุบลง LB-agarose มี 50 mg / ml KANAMYCIN หนึ่ง L
วัฒนธรรม (LB น้ำซุป KANAMYCIN 50 mg / ml) มีเชื้อจาก
โคโลนีที่เกิดและเติบโตที่ 37 ° C จนความหนาแน่นของแสงที่ 600
นาโนเมตรถึง 0.6 การแสดงออกของโปรตีนถูกชักนำด้วย 1 มิลลิ IPTG,
และวัฒนธรรมที่ถูกบ่มเป็นเวลา 20 ชั่วโมงที่ 25 ° C ในขณะที่สั่น
วัฒนธรรมถูกหมุนเหวี่ยงที่ 7000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 15 นาทีและเม็ดเซลล์
ถูกทำลายโดย sonication ใน 35 มิลลิลิตรทำงานบัฟเฟอร์และ PMSF
ดีเอ็นเอตกตะกอนโดย protamine ซัลเฟต โปรตีนที่มี 6x ของเขาแท็ก
ถูกโหลดลงคอลัมน์ 5 มิลลิลิตร HisTrap (GE Healthcare, สหรัฐอเมริกา)
กับการทำงานของบัฟเฟอร์ (20 มิลลิ hepes 250 มิลลิโซเดียมคลอไรด์, 250 มิลลิ
NH4SO4, 20 mM imidazole ค่า pH 7.5) และชะด้วยลาดเชิงเส้น
ของ buffer elution (20 มิลลิ hepes 250 มิลลิโซเดียมคลอไรด์, 250 มิลลิ NH4SO4,
500 มิลลิ imidazole ค่า pH 7.5)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การโคลนและการถ่ายทอดของปุริ mm2279 spn3210 moth1224 avi5431
, , , , caur1903 tvn0515 และ cthe1199 . ยีนสำหรับ
mm2279 spn3210 moth1224 avi5431 , , , , และ tvn0515 ถูกโคลน
เป็น pet-30a เวกเตอร์การแสดงออกด้วยซึ่งตั้งแท็กของเขา . . . . . .
caur1903 ถูกโคลนเข้า pet-42a กับป้ายภาษี GST กรดอะมิโน .
cthe1199 ถูกโคลนเป็น tagless สร้างลงใน E . coli bl-21
pet-30a .( DE3 ) เซลล์ถูกเปลี่ยนกับพลาสมิดพาหะและ
ชุบลงบนปอนด์ ( บรรจุ 50 μ g / ml ทั้งสอง 1 L
วัฒนธรรม ( LB broth น 50 μ g / ml ) เป็นเชื้อที่เกิดจาก
อาณานิคมและโตที่ 37 ° C ถึงความหนาแน่นของแสงที่ 600
nm ถึง 0.6 การแสดงออกของโปรตีนถูกกระตุ้นด้วยโปรตีน 1 มิลลิเมตร และ วัฒนธรรมที่ถูกบ่ม
ที่ 25 ° C เป็นเวลา 20 ชั่วโมงในขณะที่สั่น
วัฒนธรรมที่เป็นระดับที่ 7000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 15 นาที และเซลล์เม็ด
ถูกรบกวนจาก sonication 35 ml ใช้บูff ER และ PMSF .
ดีเอ็นเอตกตะกอนโดยโพรทามีน ซัลเฟต โปรตีนกับสองของเขาแท็ก
ถูกโหลดไปยัง 5 ml histrap คอลัมน์ ( GE Healthcare , USA )
ffวิ่งปู้เอ้อ ( 20 มิลฮีเปส , 250 มม. ขนาด 250 mm
nh4so4 อิมิดาโซล 20 มม. , pH 7.5 ) และตัวอย่างกับ
ลาดเชิงเส้นของ ( บูff ER ( 20 มิลฮีเปส , 250 มม. ขนาด 250 มม. nh4so4
, 500 มม. อิมิดาโซล พีเอช 7.5 )