Roughened microscope slides were di

Roughened microscope slides were dipped briefly into 1.5% hot (60oC) normal melting agarose (NMA) prepared in phosphate-buffered saline (PBS). The slides were dried overnight at room temperature and then stored at 4oC until used. Each slide was coated with 300 ml of 1.0% NMA in PBS, as soon as the agarose had boiled, and then covered with a coverslip and transferred to a humidified box at 4oC for a least 5 min (slides used until 24 h maintained good quality) to allow the agarose to solidify. Subsequently, blood (7-10 ml) mixed with 95 ml of 0.75% low melting point agarose (LMA) (Gibco BRL) at 37oC was spread on the slide using a coverslip and then allowed to solidify at 4oC in a moist box. After removal of the coverslip, the slides were immersed in freshly prepared cold (4oC) lysing solution (2.5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris; pH 10-10.5; 1% Triton X-100 and 10% DMSO added just before use) for at least 1 h and for up to four weeks.


All procedures up to the lysis were done in the field. Two slides per rodent were prepared. The slides were kept in lysing solution, packed and transported on ice to the laboratory. In addition, whole blood samples from rodents and humans were mixed with RPMI 1640 medium (1:10), and kept at 4oC during transport. This precaution allows the preparation of more slides in the laboratory if necessary.

The alkaline unwinding, electrophoresis and neutralization steps were performed as described by Hartmann and Speit (1995), with minor modifications. The slides were removed from the lysis solution and placed in the electrophoresis chamber, which was then filled with freshly made alkaline buffer (300 mM NaOH and 1 mM EDTA, pH 12.6). The cells were exposed to alkali for 30 min to allow for DNA unwinding and the expression of alkali-labile sites. Subsequently, the DNA was electrophoresed for 30 min at 300 mA and 25 V in an ice bath. All of the above steps (preparation of slides, lysis and electrophoresis) were conducted under red light or without direct light in order to prevent additional DNA damage. The main advantage of using weak alkali (pH 12.6) in the electrophoresis step was the possibility of maintaining the sensitivity of the alkali assay (pH > 13) in which the extended comet tails would be clearly distinguishable from the heads, and thus be easier to evaluate (Klaude et al., 1996).


In all cases, negative and positive controls were run using human blood. For the positive control, 200 ml of whole blood was incubated for 2 h at 37oC with 50 ml of methyl methanesulfonate (MMS; final concentrations of 8 x 10-5 M and 4 x 10-5 M). The two concentrations were used to demonstrate different levels of damage and to ascertain the assay sensitivity.

After electrophoresis, the slides were placed in a horizontal position and washed three times (5 min each) with 0.4 M Tris buffer, pH 7.5, to neutralize the excess alkali. Finally, 70 ml of ethidium bromide (2 mg/ml) was added to each slide, which was then covered with a coverslip, stored in a humidified box at 4oC and analyzed using a fluorescence microscope with a calibrated eyepiece. The slides maintained a good fluorescent image for at least four days.

Images of 50 randomly selected cells (25 cells from each of two replicate slides) were analyzed from each animal. Comet tail lengths (nuclear region + tail) were measured in arbitrary units. One unit was approximately 5 mm at 200X magnification. The fluorescence microscope was equipped with a BP546/12-nm excitation filter and a 590-nm barrier filter. Cells were also scored visually into five classes, according to tail size (from undamaged-0, to maximally damaged-4) (Figure 1) and a value was assigned to each comet according to its class. The final overall rating for the slide, DNA damage score, between 0 (completely undamaged) and 200 (maximum damage), was obtained by summation (Collins et al., 1995, 1997). Apoptotic cells were observed (Figure 1F) but not evaluated, since they represented dead cells (Olive et al., 1993; Speit and Hartmann, 1996).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ภาพนิ่งกล้องจุลทรรศน์ roughened ถูกสอดสั้น ๆ เป็น 1.5% ร้อน (60oC) ปกติละลาย agarose (NMA) เตรียมใน buffered ฟอสเฟตน้ำเกลือ (PBS) ภาพนิ่งที่แห้งข้ามคืนที่อุณหภูมิห้อง และเก็บที่ 4oC จนกว่าจะใช้แล้ว แต่ละภาพนิ่งถูกเคลือบ ด้วย 300 ml ของ 1.0% NMA ใน PBS ทันที agarose มี ต้ม แล้วมี coverslip การ และโอนย้ายไปยังกล่อง humidified ที่ 4oC ในอย่างน้อย 5 นาที (ใช้จนกว่า 24 h รักษาคุณภาพภาพนิ่ง) ให้ agarose จะแข็ง ต่อมา เลือด (7-10 ml) ผสมกับ 95 ml ของ agarose จุดหลอมเหลวต่ำ 0.75% (LMA) (Gibco BRL) ที่ 37oC ที่แพร่กระจายบนภาพนิ่งที่ใช้เป็น coverslip และสามารถเข้าที่ 4oC ในกล่องชุ่มชื่น หลังจากเอาออก coverslip ภาพนิ่งถูกสัมผัสลิ้มเย็น (4oC) lysing โซลูชั่น (2.5 M NaCl, EDTA 100 มม. 10 มม.ตรี pH 10-10.5; 1% ไตรตั้น X 100 และ 10% DMSO เพิ่มก่อนใช้) น้อย 1 h และถึงสี่สัปดาห์ขั้นตอนทั้งหมดถึงการ lysis ได้ทำในฟิลด์ ภาพนิ่งสองภาพต่อหนูเตรียมไว้ ภาพนิ่งที่ถูกเก็บไว้ใน lysing โซลูชั่น บรรจุ และขนส่งบนน้ำแข็งเพื่อห้องปฏิบัติการ นอกจากนี้ ตัวอย่างเลือดทั้งหมดจากงานและมนุษย์ผสมกับ RPMI 1640 ปานกลาง (1:10), และเก็บที่ 4oC ในระหว่างขนส่ง ระวังนี้ได้เตรียมภาพนิ่งเพิ่มเติมในห้องปฏิบัติการถ้าจำเป็น Electrophoresis unwinding อัลคาไลน์และขั้นตอนปฏิกิริยาสะเทินได้ทำตามที่อธิบายไว้ โดย Hartmann และ Speit (1995), มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ภาพนิ่งถูกเอาออกจากโซลูชัน lysis และวางไว้ในห้อง electrophoresis ซึ่งถูกแล้วเติมคัดสรรด่างบัฟเฟอร์ (300 mM 1 mM และ NaOH EDTA, pH 12.6) เซลล์ได้สัมผัสกับด่างใน 30 นาทีเพื่อให้ผ่อนคลายดีเอ็นเอและค่าของไซต์ด่าง labile ในเวลาต่อมา ดีเอ็นเอถูก electrophoresed สำหรับ 30 นาที 300 mA และ 25 V ในห้องน้ำเป็นน้ำแข็ง ขั้นตอนข้างต้น (เตรียมภาพนิ่ง lysis และ electrophoresis) ทั้งหมดได้ดำเนินการภาย ใต้แสงสีแดง หรือไม่ มีแสงโดยตรงเพื่อป้องกันความเสียหายของดีเอ็นเอเพิ่มเติม ประโยชน์หลักของการใช้ด่างอ่อน (pH 12.6) ในขั้นตอนการ electrophoresis มีความเป็นไปได้ของความไวของการด่างวิเคราะห์ (pH > 13) ที่หางดาวหางขยายจะเป็นชัดเจนแตกต่างจากหัว และดังนั้น การประเมิน (Klaude et al., 1996)ในทุกกรณี ควบคุมค่าบวก และค่าลบถูกเรียกใช้โดยใช้เลือดมนุษย์ ตัวบวก 200 มล.ของเลือดทั้งหมดถูก incubated สำหรับ h 2 ที่ 37oC มี 50 ml ของ methyl methanesulfonate (MMS ความเข้มข้นสุดท้าย 8 x 10-5 M และ 4 x 10-5 M) ความเข้มข้นที่สองถูกใช้ เพื่อแสดงให้เห็นถึงระดับของความเสียหาย และตรวจความไวในการทดสอบ หลังจาก electrophoresis ภาพนิ่งที่ถูกวางในตำแหน่งแนวนอน และล้างสามครั้ง (5 นาทีละ) ด้วย 0.4 M ทริสเรทติ้งบัฟเฟอร์ pH 7.5 การด่างส่วนเกิน ในที่สุด 70 ml ของโบรไมด์ ethidium (2 mg/ml) ถูกเพิ่มเข้าไปแต่ละภาพนิ่ง ซึ่งถูกปกคลุม ด้วย coverslip เก็บไว้ในกล่อง humidified ที่ 4oC และวิเคราะห์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ fluorescence ด้วยเลนส์ calibrated แล้ว ภาพนิ่งรักษารูปเรืองแสงดีน้อยสี่วัน รูปภาพของเซลล์ที่เลือกโดยการสุ่ม 50 (25 เซลล์จากสไลด์สอง replicate) ได้วิเคราะห์จากสัตว์แต่ละ ดาวหางหางยาว (ภูมิภาคนิวเคลียร์ + หาง) ถูกวัดในหน่วยที่กำหนด หนึ่งหน่วยมีอัตราส่วน X 200 ประมาณ 5 มม. กล้องจุลทรรศน์ fluorescence ได้พร้อมตัวในการกระตุ้น BP546/12-nm และตัวอุปสรรค 590 nm นอกจากนี้ยังมีคะแนนเห็นเป็นห้าชั้น เซลล์ตามหางขนาด (ไม่เสียหาย-0, maximally เสียหาย 4) (รูปที่ 1) และค่ากำหนดให้กับแต่ละดาวหางตามสิ่ง สุดท้ายที่จัดอันดับโดยรวม สำหรับภาพนิ่ง ดีเอ็นเอเสียหายคะแนน 0 (สมบูรณ์ไม่เสียหาย) และ 200 (สูงสุดเสียหาย), ได้รับ โดยรวม (คอลลินส์และ al., 1995, 1997) สังเกต (รูป 1F) แต่ไม่มี ประเมิน เนื่องจากพวกเขาแสดงเซลล์ตาย (มะกอก et al., 1993 เซลล์ Apoptotic Speit ก Hartmann, 1996)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สไลด์กล้องจุลทรรศน์หยาบถูกจุ่มลงในช่วงสั้น ๆ 1.5% ร้อน (60oC) agarose ละลายปกติ (NMA) จัดทำขึ้นน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (พีบีเอส) สไลด์แห้งค้างคืนที่อุณหภูมิห้องและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสจากนั้นจนกว่าจะใช้ แต่ละภาพนิ่งถูกเคลือบด้วย 300 มล. 1.0% NMA ในพีบีเอสทันทีที่ agarose ได้ต้มและปกคลุมแล้วด้วย coverslip และโอนไปยังกล่องความชื้นที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสสำหรับน้อย 5 นาที (สไลด์นำมาใช้จน 24 ชั่วโมงการบำรุงรักษาที่มีคุณภาพดี ) เพื่อให้ agarose เพื่อเสริมความแข็งแกร่ง ต่อจากนั้นในเลือด (7-10 มล.) ผสมกับ 95 มิลลิลิตร 0.75% จุดหลอมเหลวต่ำ agarose (LMA) (Gibco BRL) ที่ 37oC กระจายบนสไลด์ใช้ coverslip และได้รับอนุญาตแล้วจะแข็งที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสในกล่องชื้น หลังจากที่การกำจัดของ coverslip ที่ภาพนิ่งที่ถูกแช่อยู่ในที่ปรุงสดใหม่เย็น (อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส) การแก้ปัญหา lysing (2.5 ล้าน NaCl 100 mM EDTA, 10 มิลลิทริส; pH 10-10.5 1% Triton X-100 และ 10% DMSO เพิ่มก่อน ใช้) อย่างน้อย 1 ชั่วโมงและถึงสี่สัปดาห์. ขั้นตอนทั้งหมดถึงสลายได้ทำในสนาม สองภาพนิ่งต่อหนูได้จัดทำ สไลด์ถูกเก็บไว้ในการแก้ปัญหา lysing บรรจุและการขนส่งบนน้ำแข็งไปยังห้องปฏิบัติการ นอกจากนี้กลุ่มตัวอย่างเลือดจากหนูและมนุษย์ได้รับการผสมกับ RPMI 1640 กลาง (01:10) และเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสในระหว่างการขนส่ง ข้อควรระวังนี้จะช่วยให้การเตรียมความพร้อมของภาพนิ่งในห้องปฏิบัติการเพิ่มเติมถ้าจำเป็น. ประมาณการหนี้สินด่าง electrophoresis และขั้นตอนการวางตัวเป็นกลางได้ดำเนินการตามที่อธิบายอาร์ตมันน์และ Speit (1995) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ภาพนิ่งที่ถูกถอดออกจากสารละลายสลายและวางไว้ในห้องอิเล็กซึ่งก็เต็มไปแล้วกับอัลคาไลน์บัฟเฟอร์ทำสดใหม่ (NaOH 300 มิลลิ 1 มิลลิ EDTA, ค่า pH 12.6) เซลล์ที่ได้สัมผัสกับด่างเป็นเวลา 30 นาทีเพื่อให้สามารถคลี่คลายดีเอ็นเอและการแสดงออกของเว็บไซต์ด่าง labile ต่อมาดีเอ็นเอถูก electrophoresed เป็นเวลา 30 นาทีที่ 300 มิลลิแอมป์และ 25 V ในอ่างน้ำแข็ง ทุกขั้นตอนข้างต้น (การจัดทำสไลด์สลายและอิเลค) ได้รับการดำเนินการภายใต้แสงสีแดงหรือไม่มีแสงโดยตรงเพื่อป้องกันการเสียหายของดีเอ็นเอเพิ่มเติม ประโยชน์หลักของการใช้ด่างที่อ่อนแอ (pH 12.6) ในขั้นตอนที่ข่าวคราวความเป็นไปได้ของการรักษาความไวของการทดสอบอัลคาไลที่ (pH> 13) ซึ่งในหางของดาวหางขยายจะเห็นได้ชัดว่าแตกต่างจากหัวและทำให้ง่ายต่อการ ประเมิน (Klaude et al., 1996). ในทุกกรณีการควบคุมเชิงลบและบวกวิ่งโดยใช้เลือดของมนุษย์ สำหรับการควบคุมบวก 200 มล. ของเลือดทั้งหมดถูกบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 37oC 50 มล. ของเมธิล methanesulfonate (MMS; ความเข้มข้นสุดท้ายของ 8 x 10-5 M และ 4 x 10-5 M) ทั้งสองมีความเข้มข้นถูกนำมาใช้เพื่อแสดงให้เห็นถึงระดับที่แตกต่างของความเสียหายและเพื่อยืนยันความไวของการทดสอบได้. หลังจากที่อิภาพนิ่งที่ถูกวางไว้ในตำแหน่งแนวนอนและล้างสามครั้ง (5 นาทีในแต่ละ) กับ 0.4 บัฟเฟอร์ M Tris ค่า pH 7.5 ที่จะแก้ ด่างส่วนเกิน สุดท้าย 70 มิลลิลิตร ethidium bromide (2 mg / ml) ถูกบันทึกอยู่ในแต่ละภาพนิ่งซึ่งถูกปกคลุมด้วย coverslip ที่เก็บไว้ในกล่องความชื้นที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสและวิเคราะห์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงที่มีการสอบเทียบช่องมองภาพ สไลด์รักษาภาพเรืองแสงที่ดีอย่างน้อยสี่วัน. ภาพ 50 เซลล์สุ่มเลือก (25 เซลล์จากแต่ละสองซ้ำภาพนิ่ง) วิเคราะห์จากสัตว์แต่ละ ความยาวหางของดาวหาง (ภูมิภาคนิวเคลียร์ + หาง) เป็นวัดในหน่วยโดยพลการ หน่วยหนึ่งประมาณ 5 มิลลิเมตรที่กำลังขยาย 200X กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงที่ได้รับการติดตั้ง BP546 / 12 นาโนเมตรและกระตุ้นกรองกรองอุปสรรค 590 นาโนเมตร เซลล์ที่ถูกยิงยังมองเห็นเป็นห้าชั้นเรียนตามขนาดหาง (จาก 0 ไม่เสียหายที่จะเกิดความเสียหายที่สุด-4) (รูปที่ 1) และความคุ้มค่าได้รับมอบหมายให้ดาวหางแต่ละคนตามระดับ คะแนนรวมสุดท้ายสำหรับภาพนิ่งคะแนนเสียหายของดีเอ็นเอระหว่าง 0 (ไม่เสียหายสมบูรณ์) และ 200 (ความเสียหายสูงสุด) ได้มาจากผลรวม (คอลลิน, et al., 1995, 1997) เซลล์ apoptotic ถูกตั้งข้อสังเกต (รูป 1F) แต่ไม่ได้รับการประเมินเนื่องจากพวกเขาเป็นตัวแทนของเซลล์ที่ตายแล้ว (มะกอก et al, 1993;. Speit และอาร์ตมันน์, 1996)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

roughened สไลด์กล้องจุลทรรศน์ถูกจุ่มลงสั้นลง 1.5 % ร้อน ( 60oc ) ( ละลายปกติ ( ที่เตรียมไว้ในฟอสเฟตบัฟเฟอร์นเ มเอ ) เกลือ ( PBS ) ภาพนิ่งแห้งค้างคืนที่อุณหภูมิห้อง แล้วเก็บไว้ที่ 4oc จนใช้ แต่ละภาพนิ่งถูกเคลือบด้วย 300 มิลลิลิตร นเ มเอ 1.0% ใน PBS ทันทีที่โรสได้ต้มและจากนั้นปกคลุมด้วยปิดสไลด์และโอนไปยังกล่องที่ 4oc humidified ประมาณ 5 นาที ( สไลด์ที่ใช้จนถึง 24 ชั่วโมง รักษาคุณภาพที่ดี ) เพื่อให้โรสแข็ง . ต่อมาเลือด ( 7-10 ml ผสมกับ 95 ml 0.75 % ต่ำจุดหลอมเหลว ( ( LMA ) ( gibco BRL ) ที่ 37oc ถูกกระจายบนสไลด์ที่ใช้ปิดสไลด์ แล้วอนุญาตให้แข็งที่ 4oc ในกล่องกันชื้นหลังจากเอาของปิดสไลด์ , สไลด์ถูกแช่อยู่ในเตรียมสด เย็น ( 4oc ) ต่อโซลูชั่น ( NaCl , 2.5 M 100 mM EDTA 10 มม. นอกจากนี้ 10-10.5 ; พีเอช ; 1% Triton X-100 และ 10% DMSO เพิ่มก่อนใช้ ) อย่างน้อย 1 ชั่วโมงและได้ถึงสี่สัปดาห์


วิธีการ ขึ้นอยู่กับคุณภาพ ทำในนาม สองภาพนิ่งต่อหนูเตรียมไว้แล้ว ภาพนิ่งถูกต่อการแก้ปัญหาการบรรจุและขนส่งบนน้ำแข็งเพื่อปฏิบัติการ นอกจากนี้ ทั้งหนูและมนุษย์เลือดปนด้วย RPMI 1640 ขนาดกลาง ( 1 : 10 ) และเก็บไว้ที่ 4oc ในระหว่างการขนส่ง การป้องกันนี้ ให้เตรียมสไลด์ขึ้นในห้องปฏิบัติการ หากจำเป็น

ด่างเพื่อวิธีการ ขั้นตอนมีการปฏิบัติตามที่อธิบายไว้โดย Admin และ speit ( 1995 )มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ภาพนิ่งถูกถอดออกจากการสลายและโซลูชั่นอยู่ในตัวอย่างห้องที่ทำใหม่ๆ นั้น เต็มไป ด้วยด่าง ( NaOH บัฟเฟอร์ 300 มม. และ 1 mM EDTA pH 12.6 ) เซลล์มีการเปิดรับด่างประมาณ 30 นาที เพื่อให้ DNA ได้คลี่คลายและการแสดงออกของเว็บไซต์ที่ด่าง ต่อมาดีเอ็นเอ electrophoresed 30 นาทีมา 300 และ 25 V ในน้ำแข็ง อาบ ทุกขั้นตอนข้างต้น ( การเตรียมสไลด์ การสลายและ electrophoresis ) ได้ดำเนินการภายใต้แสงแดง หรือ ไม่มีแสงโดยตรง เพื่อป้องกันความเสียหายของดีเอ็นเอเพิ่มเติม ประโยชน์หลักของการใช้ด่างอ่อน ( pH 126 ) ในตัวอย่างขั้นตอนคือความเป็นไปได้ของการใช้ความอ่อนไหวของด่าง ( pH > 7 ) ซึ่งขยายดาวหางหางจะแตกต่างอย่างชัดเจนจากหัว และดังนั้นจึง ได้ง่ายขึ้นเพื่อประเมิน ( klaude et al . , 1996 )


ในทุกกรณี , ลบและบวกการควบคุมกำลังวิ่ง การใช้เลือดมนุษย์ สำหรับการควบคุมที่เป็นบวก200 มิลลิลิตรของเลือดทั้งหมดถูกบ่ม 2 H ที่ 37oc กับ 50 มิลลิลิตร เมทิล methanesulfonate ( MMS ; ความเข้มข้นสุดท้าย 8 x 10-5 เมตรและ 4 x 10-5 M ) สองความเข้มข้นที่ใช้เพื่อแสดงให้เห็นถึงระดับที่แตกต่างกันของความเสียหายและการวินิจฉัยการทดสอบความไว

หลังจากอิเล็กสไลด์อยู่ในแนวนอน และล้างสามครั้ง ( 5 นาทีแต่ละ ) กับ 0.4 M ทริสบัฟเฟอร์pH 7.5 เพื่อแก้ด่างส่วนเกิน ในที่สุด 70 มิลลิลิตรของทิเดียมโบรไมด์ ( 2 mg / ml ) ที่ถูกเพิ่มเข้าไปในแต่ละสไลด์ ซึ่งถูกปกคลุมด้วยปิดสไลด์ แล้วเก็บไว้ในกล่องที่ 4oc humidified และวิเคราะห์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงด้วยขนาดเลนส์ . ภาพนิ่งรักษาดี หลอดภาพอย่างน้อย 4 วัน

ภาพสุ่มเลือกเซลล์ ( 25 เซลล์จากแต่ละของทั้งสองสร้างสไลด์ ) วิเคราะห์ข้อมูลจากแต่ละสัตว์ ดาวหาง ( นิวเคลียร์ ) ความยาวหางหาง ) เป็นวัดในหน่วยโดยพลการ หนึ่งหน่วยประมาณ 5 มม. ที่ 200x ขยาย . กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงพร้อมกับ bp546 / 12 nm แผ่นกรองและ 590 nm กั้นกรองเซลล์ก็ยังได้มองเห็นเป็นห้าชั้น ตามขนาดของหาง ( จาก undamaged-0 , สูงสุด damaged-4 ) ( รูปที่ 1 ) และค่าจะถูกกำหนดให้แต่ละดาวหางตามรุ่น สุดท้ายรวมคะแนนสำหรับภาพนิ่ง คะแนนความเสียหายดีเอ็นเอ ระหว่าง 0 ( สมบูรณ์ไม่เสียหาย ) และ 200 ( ความเสียหายสูงสุด ) , ได้โดยการบวก ( คอลลินส์ et al . , 1995 , 1997 )เนื้อเยื่อที่พบตัวเลข ( ชั้น 1 ) แต่ไม่ใช้ เพราะพวกเขาเป็นตัวแทนเซลล์ตาย ( มะกอก et al . , 1993 ; speit และ Admin , 1996 )