Methanol has been a widely used cry

Methanol has been a widely used cryoprotectant in the cryopreservation of embryos and oocytes and other reproductive tissues. However, success of most of cryopreservation protocols is usually measured by either physical appearance of cell or survival rate. It has previously been reported that chilling alters the pattern of sox gene expression in zebrafish embryos [8]. Similarly, the effect of cryoprotectant use at the molecular level is still unknown. In the present study, the effect of chilling in the presence of cryoprotectant methanol on gene and subsequent protein expression was investigated.

Cryoprotectants usually protect cells from chilling and freezing injury by dehydrating cells and lowering the freezing point [35]. The use of cryoprotectants in low temperature storage has been proven to be essential in protecting cells from chilling injury [49]. However, most cryoprotectants are toxic especially when used at high concentrations [45]. The toxicity of cryoprotectants to cells is also dependent on their type, exposure temperature and exposure time period [40]. Cryoprotectants can cause cellular injury by osmotic trauma [34] and can be toxic to the cells. Cryoprotectant toxicity studies are now common practice prior to their use in cell cryopreservation. However there is very limited information on how cryoprotectants function at the molecular level and if they have a significant effect on gene or protein expression following cryopreservation. Understanding of the impact of cryoprotectants at the molecular level is important especially for reproductive materials such as embryos, oocytes, ovarian tissues. Any changes at the molecular level could have a lethal effect on subsequent development. Any alteration during these early stages could be replicated leading to long term genetic defects. Studies in mouse and rat embryos have shown that methanol (MeOH) is toxic [22] and even lethal when used at high concentrations (12–16 mg/mL) [2]. Methanol is a widely used cryoprotectant in fish embryo cryopreservation. Methanol has been found to protect cells during cryopreservation in zebrafish oocytes and embryos [43] and [49] and common carp embryos [1]. It has been found that methanol was effective in zebrafish embryo cryopreservation because it has low toxicity compare to other most commonly used cryoprotectants [49] and also due to its ability to pass through the embryo membrane rapidly [17]. Similar studies in medaka also demonstrated higher embryo survival rates after chilling in the presence of MeOH [45] than chilling in ethylene glycol (EG), propylene glycol (PG), DMSO and glycerol. However, it has also been shown that methanol exposure is associated with visual impairment or blindness, affecting the optic nerve and retina of rats at concentrations 20% w/v of 4 g/kg followed by 2 g/kg [12]. Methanol has also been demonstrated to be neurotoxic where its exposure leads to severe central nervous system (CNS) defects in mice at gastrulation periods [7] and in drosophila embryos at 8–11 embryonic stages [26]. Rico et al. showed that methanol also alters ecto-nucleotidases and acetylcholinesterase enzymes (important for neuromodulation in brain) in zebrafish brains [36]. Therefore it is important that the effect of methanol is better understood when used as a cryoprotectant.

The present study investigated the effect of chilling on sox gene and protein expression in the presence of methanol. Sox genes (sox2, sox3 and sox19a) are important genes in the development of nervous systems in zebrafish embryos and any changes can lead to serious abnormalities [13]. Inhibition of sox gene expression in vertebrate embryos results in premature differentiation of neural precursors and their overexpression results in inhibition of neurogenesis [4], [5], [15], [19] and [32]. However, study on gene expression (mRNA level) does not provide information on protein translation as the efficacy of translation can also be affected by post transcription modulation of regulatory genes [25]. It has been demonstrated that small non-protein-coding RNAs (small nucleolar RNA, micro RNAs, short interfering RNAs, small double stranded RNA) also regulate gene expression, including translation in developmental processes [25]. Therefore, following gene expression studies, subsequent protein expression studies were also carried out to understand the effect of MeOH at the molecular level during cryoprotectant exposure and chilling. For these study, embryos were chilled for up to 24 h to find out optimum chilling storage period (commonly used transportation period) using MeOH as cryoprotectant. It is also further necessary to test optimum concentration which not only improve survival rate but also does not change anything at genetic level, especially neurological genes and proteins i.e. sox, due to their neurotoxic tendency. Once this condition has been optimised, further cryopreservation protocol would be developed by addition of sugars without compromising genetic integrity.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เมทานอลแล้ว cryoprotectant ใช้กันอย่างแพร่หลายใน cryopreservation โคลนแช่สารละลาย และเนื้อเยื่อการสืบพันธุ์อื่น ๆ อย่างไรก็ตาม ความสำเร็จของโปรโตคอล cryopreservation มักจะวัด โดยทั้งรูปลักษณ์ของเซลล์หรืออยู่รอด มีก่อนหน้านี้รายงานว่า หนาวเปลี่ยนแปลงรูปแบบของท่านยีนในปลาม้าลายโคลน [8] ในทำนองเดียวกัน ผลใช้ cryoprotectant ในระดับโมเลกุลคือยังไม่รู้จัก ในปัจจุบันศึกษา ผลของการถือในต่อหน้าของเมทานอล cryoprotectant ยีนและโปรตีนต่อนิพจน์ถูกสอบสวนCryoprotectants ปกป้องเซลล์จากหนาว และแช่แข็งบาดเจ็บ โดยการขจัดน้ำออกไปเซลล์ และลดจุดเยือกแข็ง [35] มักจะ การใช้ cryoprotectants ในการเก็บที่อุณหภูมิต่ำได้รับการพิสูจน์เป็นสิ่งจำเป็นในการปกป้องเซลล์จากสะท้าน [49] อย่างไรก็ตาม cryoprotectants ส่วนใหญ่มีพิษโดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อใช้ที่ความเข้มข้นสูง [45] ความเป็นพิษของ cryoprotectants ไปยังเซลล์ได้ยังขึ้นอยู่กับชนิดของพวกเขา สัมผัสอุณหภูมิ และแสงเวลา [40] Cryoprotectants สามารถทำให้เกิดบาดเจ็บที่มือถือ โดยการออสโมติกบาดเจ็บ [34] และอาจเป็นพิษกับเซลล์ การศึกษาความเป็นพิษ cryoprotectant ก็ฝึกทั่วไปก่อนที่จะใช้ในเซลล์ cryopreservation อย่างไรก็ตาม มีข้อมูลที่จำกัดมากว่า cryoprotectants ทำงานในระดับโมเลกุลและถ้าพวกเขามีผลสำคัญในยีนหรือโปรตีนนิพจน์ต่อไปนี้ cryopreservation เข้าใจผลกระทบของ cryoprotectants ในระดับโมเลกุลเป็นสิ่งสำคัญโดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับสืบพันธุ์วัสดุเช่นโคลน แช่สารละลาย เนื้อเยื่อรังไข่ เปลี่ยนแปลงในระดับโมเลกุลได้ผลพัฒนาต่อมาเป็นยุทธภัณฑ์ แก้ไขใด ๆ ระหว่างขั้นต้นเหล่านี้สามารถถูกจำลองไประยะยาวข้อบกพร่องทางพันธุกรรม ศึกษาในโคลนเมาส์และหนูได้แสดงให้เห็นว่าเมทานอ) เป็นพิษ [22] และยุทธภัณฑ์แม้เมื่อใช้ที่ความเข้มข้นสูง (12-16 mg/mL) [2] เมทานอลเป็น cryoprotectant ใช้กันอย่างแพร่หลายในปลาตัวอ่อน cryopreservation เมทานอลได้พบเค้าในช่วง cryopreservation แช่สารละลายของปลาม้าลาย และโคลน [43] และ [49] และทั่วไปเหน็บโคลน [1] จะพบเมทานอลที่มีประสิทธิภาพในปลาม้าลาย cryopreservation อ่อนเนื่องจากมีความเป็นพิษต่ำเปรียบเทียบ กับ cryoprotectants อื่น ๆ ใช้บ่อยที่สุด [49] และเนื่อง จากความสามารถในการผ่านเยื่ออ่อนอย่างรวดเร็ว [17] ศึกษาคล้ายใน medaka แสดงอัตรารอดอ่อนสูงหลังหนาวกว่าหนาวในเอทิลีน glycol (EG), โพรพิลีน glycol (PG), DMSO และกลีเซอรในต่อหน้าของทานอ [45] อย่างไรก็ตาม มันได้ถูกแสดงว่าเมทานอลแสงเกี่ยวข้องกับผลที่มองเห็นหรือตาบอด มีผลต่อประสาทตาและจอตาของหนูที่ความเข้มข้น 20% w/v ของ 4 g/kg ตาม 2 กรัม/กก. [12] รวมทั้งได้สาธิตเมทานอลถูกต้อง neurotoxic ที่สัมผัสที่นำไปสู่ระบบประสาทส่วนกลางอย่างรุนแรง (CNS) ข้อบกพร่องในหนู ที่ระยะ gastrulation [7] และ ในโคลนแมลงในระยะตัวอ่อน 8 – 11 [26] เปอร์โตริโกและ al. พบเมทานอลที่ยังเปลี่ยนแปลง ecto nucleotidases เอนไซม์ acetylcholinesterase ที่ (สำคัญสำหรับ neuromodulation ในสมอง) ในสมองปลาม้าลาย [36] และ ดังนั้น จึงเป็นว่า ผลของเมทานอลจะดีกว่าเข้าใจเมื่อใช้เป็น cryoprotectant เป็นสำคัญThe present study investigated the effect of chilling on sox gene and protein expression in the presence of methanol. Sox genes (sox2, sox3 and sox19a) are important genes in the development of nervous systems in zebrafish embryos and any changes can lead to serious abnormalities [13]. Inhibition of sox gene expression in vertebrate embryos results in premature differentiation of neural precursors and their overexpression results in inhibition of neurogenesis [4], [5], [15], [19] and [32]. However, study on gene expression (mRNA level) does not provide information on protein translation as the efficacy of translation can also be affected by post transcription modulation of regulatory genes [25]. It has been demonstrated that small non-protein-coding RNAs (small nucleolar RNA, micro RNAs, short interfering RNAs, small double stranded RNA) also regulate gene expression, including translation in developmental processes [25]. Therefore, following gene expression studies, subsequent protein expression studies were also carried out to understand the effect of MeOH at the molecular level during cryoprotectant exposure and chilling. For these study, embryos were chilled for up to 24 h to find out optimum chilling storage period (commonly used transportation period) using MeOH as cryoprotectant. It is also further necessary to test optimum concentration which not only improve survival rate but also does not change anything at genetic level, especially neurological genes and proteins i.e. sox, due to their neurotoxic tendency. Once this condition has been optimised, further cryopreservation protocol would be developed by addition of sugars without compromising genetic integrity.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เมทานอลได้รับการ cryoprotectant ใช้กันอย่างแพร่หลายในการเก็บรักษาตัวอ่อนและเซลล์ไข่และเนื้อเยื่อสืบพันธุ์อื่น ๆ แต่ประสบความสำเร็จมากที่สุดของโปรโตคอลเก็บรักษามักจะวัดโดยทั้งลักษณะทางกายภาพของมือถือหรืออัตราการรอดตาย มันได้รับก่อนหน้านี้มีรายงานว่า alters หนาวรูปแบบของการแสดงออกของยีนในตัวอ่อน sox zebrafish เมื่อ [8] ในทำนองเดียวกันผลของการใช้ cryoprotectant ในระดับโมเลกุลยังคงไม่เป็นที่รู้จัก ในการศึกษาปัจจุบันผลกระทบของความหนาวเหน็บในการปรากฏตัวของเมทานอลใน cryoprotectant ของยีนและการแสดงออกของโปรตีนต่อมาได้รับการตรวจสอบ. cryoprotectants มักจะปกป้องเซลล์จากการบาดเจ็บหนาวและแช่แข็งโดยเซลล์เหือดแห้งและลดจุดเยือกแข็ง [35] ใช้ cryoprotectants ในการจัดเก็บที่อุณหภูมิต่ำได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นสิ่งสำคัญในการปกป้องเซลล์จากการบาดเจ็บหนาวเหน็บ [49] อย่างไรก็ตาม cryoprotectants ส่วนใหญ่มีความเป็นพิษโดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อใช้ที่ความเข้มข้นสูง [45] ความเป็นพิษของ cryoprotectants ไปยังเซลล์นอกจากนี้ยังขึ้นอยู่กับประเภทของพวกเขาอุณหภูมิการเปิดรับและระยะเวลาการเปิดรับแสง [40] cryoprotectants สามารถทำให้เกิดการบาดเจ็บจากการบาดเจ็บโทรศัพท์มือถือออสโมติก [34] และสามารถเป็นพิษต่อเซลล์ ศึกษาความเป็นพิษ cryoprotectant อยู่ในขณะนี้การปฏิบัติร่วมกันก่อนที่จะใช้ในการเก็บรักษาเซลล์ แต่มีข้อมูลที่ จำกัด มากในการฟังก์ชั่น cryoprotectants ในระดับโมเลกุลและถ้าพวกเขามีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญในการถ่ายทอดทางพันธุกรรมหรือการแสดงออกของโปรตีนเก็บรักษาต่อไป ความเข้าใจในผลกระทบของ cryoprotectants ในระดับโมเลกุลที่มีความสำคัญโดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับวัสดุสืบพันธุ์เช่นตัวอ่อนไข่เนื้อเยื่อรังไข่ การเปลี่ยนแปลงใด ๆ ในระดับโมเลกุลอาจมีผลร้ายแรงต่อการพัฒนาต่อมา การเปลี่ยนแปลงใด ๆ ในระยะแรกเหล่านี้อาจจะนำไปสู่การจำลองแบบยาวข้อบกพร่องทางพันธุกรรมระยะ การศึกษาในตัวอ่อนของหนูเมาส์และแสดงให้เห็นว่าเมทานอล (เมธานอล) เป็นพิษ [22] และตายแม้เมื่อใช้ที่ความเข้มข้นสูง (12-16 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร) [2] เมทานอลเป็น cryoprotectant ใช้กันอย่างแพร่หลายในการเก็บรักษาตัวอ่อนปลา เมทานอลได้รับพบว่าปกป้องเซลล์ในระหว่างการเก็บรักษาในเซลล์ไข่และตัวอ่อน zebrafish [43] และ [49] และตัวอ่อนปลาคาร์พร่วมกัน [1] จะได้รับพบว่าเมทานอลมีประสิทธิภาพในการเก็บรักษาตัวอ่อน zebrafish เพราะมีความเป็นพิษต่ำเมื่อเทียบกับคนอื่น ๆ cryoprotectants ใช้กันมากที่สุด [49] และยังเกิดจากความสามารถในการผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ตัวอ่อนอย่างรวดเร็ว [17] การศึกษาที่คล้ายกันใน Medaka ยังแสดงให้เห็นถึงอัตราการรอดตายของตัวอ่อนที่สูงขึ้นหลังจากที่หนาวเหน็บในการปรากฏตัวของเมธานอล [45] กว่าหนาวในเอทิลีนไกลคอล (EG) โพรพิลีนไกลคอล (PG) และกลีเซอรอล DMSO แต่ก็ยังได้รับการแสดงให้เห็นว่าการเปิดรับเมทานอลที่มีความเกี่ยวข้องกับความบกพร่องทางสายตาหรือตาบอดที่มีผลต่อเส้นประสาทตาและจอตาของหนูที่ความเข้มข้น 20% w / v 4 กรัม / กิโลกรัมตามด้วย 2 กรัม / กิโลกรัม [12] เมทานอลยังได้รับการแสดงให้เห็นว่าจะเป็นอัมพาตที่เสี่ยงจะนำไปสู่ระบบประสาทอย่างรุนแรงส่วนกลาง (CNS) ข้อบกพร่องในหนูในช่วงเวลา gastrulation [7] และตัวอ่อนแมลงหวี่ที่ 8-11 ขั้นตอนตัวอ่อน [26] et al, เปอร์โตริโก แสดงให้เห็นว่าเมทานอลยังเปลี่ยนแปลง ecto-nucleotidases และเอนไซม์สาร (ที่สำคัญสำหรับ neuromodulation ในสมอง) ในสมอง zebrafish [36] ดังนั้นจึงเป็นสิ่งสำคัญที่ผลกระทบของเมทานอลเป็นที่เข้าใจกันดีขึ้นเมื่อใช้เป็น cryoprotectant ได้. การศึกษาในปัจจุบันการตรวจสอบผลกระทบของหนาวเหน็บ sox ยีนและการแสดงออกของโปรตีนในการปรากฏตัวของเมทานอล ยีนดซอกซ์ (sox2 sox3 และ sox19a) เป็นยีนที่สำคัญในการพัฒนาของระบบประสาทในตัวอ่อน zebrafish และการเปลี่ยนแปลงใด ๆ ที่สามารถนำไปสู่ความผิดปกติอย่างรุนแรง [13] การยับยั้งการแสดงออกของยีน sox ในผลการเลี้ยงลูกด้วยนมตัวอ่อนก่อนวัยอันควรในความแตกต่างของสารตั้งต้นประสาทและผลแสดงออกของพวกเขาในการยับยั้งการ neurogenesis [4] [5] [15] [19] และ [32] อย่างไรก็ตามการศึกษาการแสดงออกของยีน (ระดับ mRNA) ไม่ได้ให้ข้อมูลเกี่ยวกับการแปลโปรตีนเช่นการรับรู้ความสามารถของการแปลนอกจากนี้ยังสามารถรับผลกระทบจากการปรับโพสต์ถอดความของยีนกฎระเบียบ [25] มันได้รับการแสดงให้เห็นว่า RNAs ที่ไม่ได้เข้ารหัสโปรตีนขนาดเล็ก (อาร์เอ็นเอคลีโอขนาดเล็ก RNAs ไมโครสั้นรบกวน RNAs, ควั่นคู่ขนาดเล็กอาร์เอ็นเอ) นอกจากนี้ยังควบคุมการแสดงออกของยีนรวมทั้งการแปลในกระบวนการพัฒนา [25] ดังนั้นต่อไปนี้การศึกษาการแสดงออกของยีนการศึกษาการแสดงออกของโปรตีนต่อมาได้รับการดำเนินการยังออกจะเข้าใจผลกระทบของเมธานอลในระดับโมเลกุลในระหว่างการเปิดรับ cryoprotectant และหนาวเหน็บ สำหรับการศึกษาเหล่านี้ตัวอ่อนถูกแช่เย็นได้นานถึง 24 ชั่วโมงเพื่อหาระยะเวลาการเก็บหนาวที่เหมาะสม (ปกติจะใช้ระยะเวลาในการขนส่ง) โดยใช้เมธานอลเป็น cryoprotectant นอกจากนี้ยังจำเป็นต่อไปในการทดสอบความเข้มข้นที่เหมาะสมซึ่งไม่เพียง แต่ช่วยเพิ่มอัตราการรอดตาย แต่ยังไม่ได้เปลี่ยนแปลงอะไรในระดับพันธุกรรมโดยเฉพาะอย่างยิ่งระบบประสาทยีนและโปรตีนเช่น sox เนื่องจากแนวโน้มอัมพาตของพวกเขา เมื่อสภาพนี้ได้รับการปรับปรุงโปรโตคอลเก็บรักษาต่อไปจะได้รับการพัฒนาโดยนอกเหนือจากน้ำตาลโดยไม่สูญเสียความสมบูรณ์ทางพันธุกรรม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เมทานอลได้ถูกใช้กันอย่างแพร่หลายน้ำยาในการเก็บรักษาไข่ตัวอ่อนและการสืบพันธุ์และเนื้อเยื่ออื่น ๆ อย่างไรก็ตาม ความสำเร็จของที่สุดของการเก็บรักษาโปรโตคอลมักจะวัดโดยให้ลักษณะทางกายภาพของเซลล์หรืออัตรา จะได้รับก่อนหน้านี้รายงานว่าหนาวจะเปลี่ยนแปลงรูปแบบของการแสดงออกของยีนในปลาม้าลายใส่ตัวอ่อน [ 8 ] ในทํานองเดียวกันผลของน้ำยาที่ใช้ในระดับโมเลกุล คือยังไม่ทราบ ในการศึกษาผลของอุณหภูมิในการปรากฏตัวของเมทานอลบนยีน และการแสดงออกของโปรตีนน้ำยาตามมาศึกษา

สารป้องกันโปรตีนเสียสภาพเนื่องจากมักจะปกป้องเซลล์จากการบาดเจ็บโดยหนาวเย็นและแช่แข็งแห้งเซลล์และลดจุดเยือกแข็ง [ 35 ]การใช้สารป้องกันโปรตีนเสียสภาพเนื่องจากในการเก็บรักษาที่อุณหภูมิต่ำ มีการพิสูจน์ว่าเป็นสิ่งจำเป็นในการปกป้องเซลล์จากการสะท้านหนาว [ 49 ] อย่างไรก็ตาม สารป้องกันโปรตีนเสียสภาพเนื่องจากมีความเป็นพิษมากที่สุดโดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อใช้ที่ความเข้มข้นสูง [ 45 ] ความเป็นพิษของสารป้องกันโปรตีนเสียสภาพเนื่องจากเซลล์ยังขึ้นอยู่กับชนิดของการเปิดรับแสง อุณหภูมิและระยะเวลา [ 40 ]สารป้องกันโปรตีนเสียสภาพเนื่องจากสามารถทำให้เซลล์การบาดเจ็บโดยการทำแผล [ 34 ] และสามารถเป็นพิษต่อเซลล์ การศึกษาความเป็นพิษของน้ำยาตอนนี้ทั่วไปปฏิบัติก่อนที่จะใช้พวกเขาในเซลล์เชื้อ อย่างไรก็ตาม มีข้อมูลว่าสารป้องกันโปรตีนเสียสภาพเนื่องจากฟังก์ชันที่ จำกัด มากในระดับโมเลกุลและถ้าพวกเขาจะมีผลต่อยีน หรือการแสดงออกของโปรตีนต่อเชื้อเข้าใจผลกระทบของสารป้องกันโปรตีนเสียสภาพเนื่องจากระดับโมเลกุลเป็นสำคัญโดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับวัสดุการสืบพันธุ์เช่นตัวอ่อนเซลล์เนื้อเยื่อรังไข่ การเปลี่ยนแปลงระดับโมเลกุลสามารถมีผลกระทบร้ายแรงต่อการพัฒนาต่อไป การเปลี่ยนแปลงใด ๆในระหว่างขั้นตอนแรกเหล่านี้อาจจะนำไปสู่ระยะยาวพันธุกรรมบกพร่องการศึกษาในหนูและหนูตัวพบว่าเมทานอล ( เมทิลแอลกอฮอล์ ) เป็นพิษ [ 22 ] และจะตายเมื่อใช้ที่ความเข้มข้นสูง ( 12 – 16 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร ) [ 2 ] เมทานอลเป็นอย่างกว้างขวางใช้ น้ำยาปลาเพาะเชื้อ เมทานอล ถูกพบระหว่างการเก็บรักษาปกป้องเซลล์ในเซลล์เพาะเลี้ยงปลาม้าลายและ [ 43 ] และ [ 49 ] และเลี้ยงปลาคาร์พทั่วไป [ 1 ]จะได้รับพบว่าเมทานอล ประสิทธิภาพในปลาม้าลายตัวอ่อนก่อน เพราะมันมีความเป็นพิษต่ำ เปรียบเทียบกับ อื่น ๆ ส่วนใหญ่นิยมใช้สารป้องกันโปรตีนเสียสภาพเนื่องจาก [ 49 ] และเนื่องจากความสามารถในการผ่านเยื่อตัวอ่อนอย่างรวดเร็ว [ 17 ]การศึกษาที่คล้ายกันในเมดากะยังแสดงให้เห็นถึงอัตราการรอดชีวิตสูงกว่าตัวอ่อนหลังจากที่หนาวในการแสดงตนของเมทิลแอลกอฮอล์ [ 45 ] กว่าหนาวในเอทิลีนไกลคอล ( เช่น ) , โพรพิลีนไกลคอล ( PG ) DMSO และกลีเซอรอล . แต่มันยังแสดงให้เห็นว่าสารเมทานอลจะเกี่ยวข้องกับการมองเห็นหรือตาบอด