Pulsed HDX was conducted under “exc

Pulsed HDX was conducted under “exchange-in” conditions
using a three-syringe, two-stage continuous-flow setup. The details
of the device have been described in our previous publication [29].
For HDX of free CAII, syringe 1 contains 25 M CAII and 10 M
bradykinin in 10 mM NH4HCO3 at pH 7.8. Syringe 2 contains 10 mM
NH4HCO3 in D2O at pHread 7.8. The pH of the deuterated buffer
was adjusted with deuterated ammonium hydroxide. The flow
rates of the two syringes were 2 and 8 L/min, respectively. After
the first mixing step, the solution goes into a 57 cm long capillary
with an i.d. of 150 m. This corresponds to an average HDX
time of 60 s. At the second mixing tee, the labeled protein is mixed
with the outflow (20 L/min) from syringe 3, which contained
10% MeOH/MeOD (1/4) and 90% H2O/D2O (1/4) with 0.4% formic
acid. The deuterium content in the quenching solution was kept
the same as in the labeling solution to ensure that the level of
side chain deuteration is constant throughout all of the mixing
sequences, which ensures that the number of acquired deuteriums
on both amides and side chains can be calibrated to 100%
D2O during data analysis, using the same deuteration percentage
of bradykinin. Note that the use of methanol here instead of acetonitrile
[29] enhances the electrospray signal substantially. The
final solution, after the second mixing tee, flows directly into the
mass spectrometer through a 9 cm long ESI capillary (i.d. 100 m).
The residence time of the labeled protein under quench conditions
was 1.4 s. This short quenching time results in an amide
back-exchange level less of than 1% [4]. From the HDX point of
view, the quenching step in the top-down approach is unnecessary.
However, the enhanced denaturation of the tertiary noncovalent
structure and the protonation of proteins under acidic conditions
facilitates the subsequent ECD fragmentation, thereby significantly
increasing the spatial resolution of the HDX-MS measurements. In
the drug-binding experiments, syringe 1 contained both CAII and
FSM, at a concentration of 25 M each. The HDX experiments were
carried out using the same online mixing setup described above,
except that the labeling time was shortened to 10 s. This labeling
time produced the largest difference between the drug-free and the
drug-bound states.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

HDX พัลถูกดำเนินการภายใต้เงื่อนไข "อัตราแลกเปลี่ยนใน"ใช้ตั้งค่ากระแสต่อเนื่องสามเข็ม สอง รายละเอียดอุปกรณ์ได้ถูกอธิบายไว้ในสิ่งพิมพ์ของเราก่อนหน้านี้ [29]สำหรับ HDX CAII ฟรี เข็ม 1 ประกอบด้วย 25 M CAII และ 10 Mbradykinin ใน 10 มม. NH4HCO3 pH 7.8 เข็มที่ 2 ประกอบด้วย 10 มม.NH4HCO3 ใน D2O ที่ pHread 7.8 PH ของบัฟเฟอร์ deuteratedถูกปรับปรุง ด้วยไฮดรอกไซด์แอมโมเนีย deuterated ขั้นตอนการราคาของเข็มฉีดยาสองได้ 8 L/min และ 2 ตามลำดับ หลังจากขั้นตอนแรกผสม การแก้ปัญหาไปเป็นซม. 57 เส้นเลือดฝอยยาวด้วยการเป็นประชาชนของ 150 m นี้สอดคล้องกับ HDX เป็นเฉลี่ยเวลา 60 s ที่สองทีผสม ผสมโปรตีนป้ายกับกระแส (20 L/min) จากเข็มที่ 3 ที่อยู่10% ทา นอ/MeOD (1/4) 90% และ H2O/D2O (1/4) 0.4% formicกรด มีเก็บเนื้อหาดิวเทอเรียมในโซลูชัน quenchingเดียวกับการแก้ปัญหาการติดฉลากเพื่อให้แน่ใจว่าระดับของdeuteration โซ่ข้างจะคงที่ตลอดทั้งหมดของการผสมลำดับ ซึ่งมั่นใจได้ของ deuteriums ที่ได้รับamides และด้าน โซ่สามารถถูกปรับเทียบเป็น 100%D2O ระหว่างการวิเคราะห์ข้อมูล โดยใช้เปอร์เซ็นต์เดียวกัน deuterationของ bradykinin การ โปรดทราบว่า การใช้เมทานอลที่นี่แทน acetonitrile[29] ช่วยเพิ่มสัญญาณวิธีพ่นละอองไฟฟ้ามากขึ้น ที่สุดท้ายโซลูชั่น หลังจากผสมทีสอง ไหลลงสเปกโตรมิเตอร์โดยรวมผ่านการ 9 ซมยาว ESI แรง (ประชาชน 100 เมตร)เวลาอาศัยโปรตีนป้ายใต้ดับเงื่อนไขมี 1.4 s นี้สั้นชุบด้วย amide มีผลเวลาหลังแลกเปลี่ยนระดับน้อยกว่า 1% [4] จากจุด HDXดู ขั้นตอนวิธีแบบบนลงล่าง quenching มีความจำเป็นอย่างไรก็ตาม denaturation ขั้นสูงของตติย noncovalentโครงสร้างและ protonation ของโปรตีนสภาวะกรดช่วยการกระจายตัวของเบาะแสภายหลัง บ๊อกซ์เพิ่มความละเอียดพื้นที่วัด HDX MS ในทดลองยาผูก เข็ม 1 มีอยู่ทั้ง CAII และแบ่งเป็นสองพวก ที่ความเข้มข้น 25 เมตร ได้ทดลอง HDXดำเนินการโดยใช้การออนไลน์ผสมตั้งค่าข้างยกเว้นว่าเวลาติดฉลากถูกตัดให้สั้นลง 10 s การติดฉลากนี้เวลาผลิตความแตกต่างที่ใหญ่ที่สุดระหว่างยาฟรีและอเมริกายาขอบ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Pulsed HDX ได้ดำเนินการภายใต้ "การแลกเปลี่ยนใน"
เงื่อนไขการใช้เข็มฉีดยาสาม, สองขั้นตอนการติดตั้งแบบไหลต่อเนื่อง โดยมีรายละเอียดของอุปกรณ์ที่ได้รับการอธิบายในสิ่งพิมพ์ของเราก่อนหน้า [29]. สำหรับ HDX ฟรี CAII เข็ม 1 มี 25? M CAII และ 10 M bradykinin 10 มิลลิ NH4HCO3 ที่ pH 7.8 เข็มที่ 2 มี 10 มิลลิNH4HCO3 ใน D2O ที่ pHread 7.8 ค่าพีเอชของบัฟเฟอร์ deuterated ปรับกับไฮดรอกไซแอมโมเนียม deuterated การไหลอัตราของทั้งสองเข็มฉีดยา 2 และ 8 ลิตร / นาทีตามลำดับ หลังจากขั้นตอนการผสมครั้งแรก, การแก้ปัญหาที่จะเข้าสู่ 57 ซม. ยาวเส้นเลือดฝอยมีid ของ 150 เมตร ซึ่งสอดคล้องกับ HDX เฉลี่ยเวลา 60 วินาที ที่ทีผสมสองโปรตีนที่มีข้อความมีการผสมกับการไหลออก (20 ลิตร / นาที) จากเข็มฉีดยา 3 ซึ่งมี 10% เมธานอล / MeOD (1/4) และ 90% H2O / D2O (1/4) 0.4 ฟอร์มิ% กรด เนื้อหาไฮโดรเจนในการแก้ปัญหาดับก็ยังคงเป็นเช่นเดียวกับในการแก้ปัญหาการติดฉลากเพื่อให้แน่ใจว่าระดับของdeuteration โซ่ข้างเป็นค่าคงที่ตลอดเวลาของการผสมลำดับซึ่งทำให้มั่นใจได้ว่าจำนวนของdeuteriums ที่ได้มาอยู่กับเอไมด์และเครือข่ายด้านสามารถการสอบเทียบถึง 100% D2O ในระหว่างการวิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ร้อยละ deuteration เดียวกันของbradykinin โปรดทราบว่าการใช้เมทานอลที่นี่แทน acetonitrile [29] ช่วยเพิ่มสัญญาณ electrospray อย่างมีนัยสำคัญ ทางออกสุดท้ายหลังจากทีผสมสองไหลโดยตรงในสเปกโตรมิเตอร์มวลผ่าน 9 เซนติเมตรยาวฝอย ESI (ID 100 ม.) เวลาที่อยู่อาศัยของโปรตีนที่มีข้อความภายใต้เงื่อนไขดับ1.4 s นี้ดับสั้นผลเวลาใน amide ระดับกลับแลกเปลี่ยนน้อยกว่า 1% ได้ [4] จากจุด HDX ของมุมมองขั้นตอนดับในวิธีการจากบนลงล่างไม่จำเป็น. อย่างไรก็ตามการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่เพิ่มขึ้นของ noncovalent ตติยโครงสร้างและโปรตอนของโปรตีนภายใต้เงื่อนไขที่เป็นกรดอำนวยความสะดวกในการกระจายตัวของECD ต่อมาจึงมีนัยสำคัญเพิ่มความละเอียดเชิงพื้นที่ของวัด HDX-MS ในการทดลองยาเสพติดที่มีผลผูกพัน, เข็มฉีดยา 1 มีทั้ง CAII และเอฟเอส, ที่ความเข้มข้น 25? M แต่ละ การทดลอง HDX ถูกดำเนินการโดยใช้การตั้งค่าการผสมออนไลน์เดียวกันอธิบายไว้ข้างต้นยกเว้นว่าเวลาการติดฉลากที่ถูกลงไป10 วินาที การติดฉลากนี้เวลาผลิตที่ใหญ่ที่สุดความแตกต่างระหว่างยาเสพติดฟรีและรัฐยาเสพติดที่ถูกผูกไว้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

พัล HDX ดำเนินการภายใต้ " ตรา " เงื่อนไข
ใช้สามเข็ม ต่อเนื่องแบบสองขั้นตอนการติดตั้ง รายละเอียด
ของอุปกรณ์ได้ถูกอธิบายไว้ในก่อนหน้านี้ของเราสิ่งพิมพ์ [ 29 ] .
สำหรับเอกลักษณ์ของฟรีอะ เข็ม 1 มี 25  M เรียก 10  m
: ใน nh4hco3 10 มม. ที่ pH 7.8 . เข็มที่ 2 มี 10 mm
nh4hco3 ใน d2o ที่ phread 7.8 . พีเอชของ deuterated
บัฟเฟอร์มันปรับได้ด้วย deuterated แอมโมเนียมไฮดรอกไซด์ การไหล
อัตราสองเข็ม 2 และ 8  ลิตร / นาที ตามลำดับ หลังจาก
ครั้งแรกผสมขั้นตอนการแก้ปัญหาไปลงใน 57 ซม. ยาวฝอย
กับบัตรประชาชน ของ  150 เมตร ซึ่งตรงกับเวลา HDX
เฉลี่ย 60 วินาที ที่ 2 ผสมที , ป้ายโปรตีนผสม
กับการรั่วไหล ( 20  ลิตร / นาที ) จากเข็มฉีดยาที่บรรจุ
3% ปริมาณ / meod 10 ( 1 / 4 ) และ 90 % H2O / d2o ( 1 / 4 ) 0.4% มิค
กรด โดยเนื้อหาในการชุบสารละลาย Deuterium เก็บไว้
เช่นเดียวกับในการติดฉลากสารละลายเพื่อให้แน่ใจว่าระดับของ
deuteration โซ่ข้างจะคงที่ตลอดการ
ลำดับ ซึ่งยืนยันว่า จำนวนที่ได้รับทั้งในและ deuteriums
เอไมด์โซ่ข้างสามารถปรับ 100 %
d2o ในระหว่างการวิเคราะห์ข้อมูลใช้เหมือนกันค่า
deuteration ของ : . หมายเหตุ การใช้เมทานอลที่นี่แทนไน
[ 29 ] ช่วยเพิ่มสัญญาณวิธีพ่นละอองไฟฟ้าอย่างมาก
ทางออกสุดท้าย หลังที่สอง ผสมทีไหลตรงเข้า
แมสสเปกโทรมิเตอร์ผ่าน 9 ซม. ยาว ESI หลอดเลือดฝอย ( บัตร 100  M )
การอยู่อาศัยของโปรตีนภายใต้เงื่อนไขว่าดับ
เป็น 1.4 วินาทีในระยะสั้นนี้ดับเวลาในแบบเอไมด์
กลับตราระดับน้อยกว่า 1 % [ 4 ] จากจุดของมุมมอง HDX
, ดับขั้นตอนในวิธีการแบบบนลงล่าง ไม่จำเป็น .
แต่เพิ่ม ( ของโครงสร้าง noncovalent
ตติยภูมิและโปรตอนของกรดโปรตีนภายใต้เงื่อนไข
สะดวกของ บก. ปอศ. จึงมีนัย
ตามมาเพิ่มความละเอียดเชิงพื้นที่ของ hdx-ms การวัด ในการทดลองยา
1 ผูก , เข็มมีทั้งเรียกและ
ในที่ความเข้มข้น 25  M แต่ละ มีเอกลักษณ์การทดลอง
โดยใช้ออนไลน์เดียวกันผสมติดตั้งที่อธิบายไว้ข้างต้น
ยกเว้นว่าฉลากเวลาสั้น 10 วินาทีนี้ การติดฉลาก
เวลาผลิตที่ใหญ่ที่สุดแตกต่างระหว่างยา
ฟรียาจำกัดรัฐ