2.6. Influenza A viruses for the em

2.6. Influenza A viruses for the empirical test and multiplex RT-PCR

For the empirical RT-PCR tests for the selected primer sets, the following 46 viral samples, which cover a wide range of periods and geographical regions, were prepared: 16 avian (H1–H16), 9 human, 8 swine, 9 equine, and 4 canine influenza viruses (for virus information, see Appendix Table 1). For the test, the 46 reference viruses were propagated in10-day-old embryo specific pathogen free (SPF) chicken eggs (VALO, Maryland, USA), and three days after, their allantoic fluid was harvested. RNA extraction was carried out manually from the allantoic fluids using an RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, California, USA) according to the manufacturer instructions.

The RT-PCR assays were performed with a commercial kit in a one-step protocol, AccuPower® RocketPlex RT-PCR PreMix (Bioneer Corp., South Korea). It was performed in a 20 μL volume, in which the reaction mixture contained 3–4 μL of RNAs, 3–4 μL of multiple primer mixturepairs(each 10 pmol/μL) and 12–14 μL of RNase-Free Water (Welgene, South Korea). Each RT-PCR was carried out in a Biometra T3000 thermal cycler (Biometra, Westburg, Netherlands). The reaction temperature and time for the reverse transcription phase was set at 50 °C for 30 min. Sequentially, PCR cycling protocols consisted of initial denaturing at 95 °C for 5 min; 30 cycles of denaturing at 95 °C for 30 s and annealing at 55 °C for 30 s, followed by an extension at 72 °C for 30 s; and a final extension step at 72 °C for 5 min. PCR products were run in a 1 ∼ 1.5% SeaKem LE agarose gel (Lonza, Rockland ME, USA) and stained with RedSafe™ Nucleic Acid Staining Solution (20,000x, iNtRon Biotechnology, Seongnam, South Korea) in 0.5X TAE buffer.

The diagnostic performance of the primers was evaluated with each primer pair and eight sets amplifying four segment combinations using the prepared viral samples. The specificity of the RT-PCR was evaluated by examining the amplified product sizes of the EIV genome segments (Table 1).

Table 1.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.6. ไข้หวัดใหญ่ไวรัสที่ค่าทดสอบ และล็กซ์ RT-PCRสำหรับการทดสอบเชิงประจักษ์ของ RT-PCR รองพื้นเลือก ชุด ตัวอย่างต่อไปนี้ 46 ไวรัส ซึ่งครอบคลุมระยะเวลาและขอบเขตทางภูมิศาสตร์หลากหลาย มีเตรียม: 16 นก (H1 – ผม H16), 9 คน หมู 8, 9 ม้า และไวรัสไข้หวัดใหญ่สุนัข 4 (สำหรับข้อมูลไวรัส ดูภาคผนวกตารางที่ 1) สำหรับการทดสอบ การอ้างอิงที่ 46 ถูกไวรัสแพร่กระจาย in10 วันเก่าอ่อนเชื้อเฉพาะฟรี (SPF) ไข่ไก่ (VALO แมรี่แลนด์ สหรัฐอเมริกา), และวันที่สามหลัง ของเหลว allantoic ถูกเก็บเกี่ยว สกัด RNA ดำเนินการด้วยตนเองจากสาร allantoic ที่ใช้โดยใช้การ RNeasy มินิชุด (Qiagen, Valencia แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตThe RT-PCR assays were performed with a commercial kit in a one-step protocol, AccuPower® RocketPlex RT-PCR PreMix (Bioneer Corp., South Korea). It was performed in a 20 μL volume, in which the reaction mixture contained 3–4 μL of RNAs, 3–4 μL of multiple primer mixturepairs(each 10 pmol/μL) and 12–14 μL of RNase-Free Water (Welgene, South Korea). Each RT-PCR was carried out in a Biometra T3000 thermal cycler (Biometra, Westburg, Netherlands). The reaction temperature and time for the reverse transcription phase was set at 50 °C for 30 min. Sequentially, PCR cycling protocols consisted of initial denaturing at 95 °C for 5 min; 30 cycles of denaturing at 95 °C for 30 s and annealing at 55 °C for 30 s, followed by an extension at 72 °C for 30 s; and a final extension step at 72 °C for 5 min. PCR products were run in a 1 ∼ 1.5% SeaKem LE agarose gel (Lonza, Rockland ME, USA) and stained with RedSafe™ Nucleic Acid Staining Solution (20,000x, iNtRon Biotechnology, Seongnam, South Korea) in 0.5X TAE buffer.The diagnostic performance of the primers was evaluated with each primer pair and eight sets amplifying four segment combinations using the prepared viral samples. The specificity of the RT-PCR was evaluated by examining the amplified product sizes of the EIV genome segments (Table 1).Table 1.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.6 ไข้หวัดใหญ่ไวรัสสำหรับการทดสอบเชิงประจักษ์และ multiplex RT-PCR สำหรับการทดสอบเชิงประจักษ์ RT-PCR สำหรับชุดไพรเมอร์ที่เลือกต่อไปนี้ 46 ตัวอย่างเชื้อไวรัสซึ่งครอบคลุมหลากหลายของระยะเวลาและพื้นที่ทางภูมิศาสตร์ที่ถูกจัดทำขึ้น: 16 นก (H1- H16), 9 มนุษย์ 8 สุกรม้า 9 และ 4 ไวรัสไข้หวัดใหญ่สุนัข (สำหรับข้อมูลไวรัสดูที่ภาคผนวกตารางที่ 1) สำหรับการทดสอบไวรัสอ้างอิง 46 ถูกแพร่กระจาย IN10 วันเก่าตัวอ่อนเฉพาะเชื้อโรคฟรี (SPF) ไข่ไก่ (องอาจ, Maryland, USA) และสามวันหลังจากของเหลว allantoic ของพวกเขาได้รับการเก็บเกี่ยว การสกัดอาร์เอ็นเอได้ดำเนินการด้วยตนเองจากของเหลว allantoic ใช้ชุด RNeasy มินิ (Qiagen, วาเลนเซีย, California, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต. ตรวจ RT-PCR ได้ดำเนินการกับชุดในเชิงพาณิชย์ในโปรโตคอลขั้นตอนเดียว, AccuPower® RocketPlex RT-PCR พรีมิกซ์ (Bioneer คอร์ปเกาหลีใต้) มันได้รับการดำเนินการในปริมาณ 20 ไมโครลิตรซึ่งผสมปฏิกิริยาที่มีอยู่ 3-4 ไมโครลิตรของ RNAs 3-4 ไมโครลิตรของ mixturepairs ไพรเมอร์หลาย ๆ (ละ 10 pmol / ไมโครลิตร) และวันที่ 12-14 ไมโครลิตรของ RNase ฟรีน้ำ (Welgene, เกาหลีใต้). แต่ละ RT-PCR ได้ดำเนินการในการระบายความร้อน Cycler Biometra T3000 (Biometra, Westburg, เนเธอร์แลนด์) อุณหภูมิปฏิกิริยาและเวลาสำหรับขั้นตอนการถอดรหัสแบบย้อนกลับถูกกำหนดไว้ที่ 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที ลำดับ PCR โปรโตคอลการขี่จักรยานประกอบด้วยขั้นเปลี่ยนเริ่มต้นที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที; 30 รอบของ denaturing ที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีและการอบที่ 55 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีตามด้วยนามสกุลที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที; และขั้นตอนสุดท้ายส่วนขยายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ได้รับการทำงานใน 1 ~ 1.5% SeaKem LE agarose เจล (Lonza, ร็อกแลนด์ ME, USA) และย้อมด้วยสี RedSafe ™นิวคลีอิกกรดย้อมสีโซลูชัน (20,000x, intron เทคโนโลยีชีวภาพ, ซอง, เกาหลีใต้) ใน 0.5 เท่า TAE บัฟเฟอร์. ประสิทธิภาพการวินิจฉัยของไพรเมอร์ได้รับการประเมินกับแต่ละคู่ไพรเมอร์และแปดชุดขยายรวมกันสี่ส่วนโดยใช้ตัวอย่างไวรัสที่เตรียมไว้ ความจำเพาะของ RT-PCR ถูกประเมินโดยการตรวจสอบขนาดสินค้าขยายในกลุ่ม EIV จีโนม (ตารางที่ 1). ตารางที่ 1