- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
2. Materials and methods2.1. Vat te
2. Materials and methods
2.1. Vat textile dyes
Vat Dyes Cibanon red 2B-MD (C.I. 67000), Cibanon golden-yellow PK-MD (C.I.
5910) and Cibanon blue GFJ-MD (C.I. 69825) were provided free of cost by Ciba
Pakistan (Ltd.), Faisalabad. Indanthrene direct black RBS was procured from DyeStar
Pakistan (Ltd.), Faisalabad.
2.2. White rot fungi and preparation of inocula
The culture slants of Pleurotus ostreatus IBL-02, Phanerochaete chrysosporium
IBL-03, C. versicolor IBL-04, Ganoderma lucidum IBL-05 and Schizophyllum commune
IBL-06 were obtained from Industrial Biotechnology Laboratory, Department of
Chemistry and Biochemistry, University of Agriculture, Faisalabad. Inocula for all
cultures were prepared in labeled 500 ml Erlenmeyer flasks containing 100 ml of
Kirk’s basal nutrient medium (Tien and Kirk, 1988) supplemented with 1% glucose.
The flasks were adjusted at pH 4.5 withMNaOH/M HCl solutions and autoclaved for
15 min at 121 C (1.11 kg/cm3). After cooling to room temperature, the flasks was
inoculated with WRF spores from respective slant cultures and placed in rotary
shaker (120 rpm) at 30 C for 3 days to get a homogenous conidial suspension
(1 108 spores/ml).
2.3. Basal nutrient medium and preparation of dye solutions
Vat dyes solutions were prepared in slightly modified Kirk’s basal nutrient
medium (Tien and Kirk, 1988; Asgher et al., 2007). It was noted that vat dyes were
not soluble in aqueous Kirk’s medium. To get clear dye solutions, alkaline Kirk’s
medium was prepared in 0.01 M NaOH solution. However, the pH of the resultant
dyes solutions was highly basic (pH 9–11) and adjustment of pH 4.5 (pH for WRF)
with M HCl caused significant salt formation. To overcome this problem, the pH was
adjusted to 4.5 using M methyl-succinic acid solution. The use of methyl-succinic
acid caused only negligible salt formation.
2.4. Decolorization protocol and screening experiment
Four sets (15 flasks each) of triplicate decolorization flaks contained 0.01% of the
respective dye solutions prepared in alkaline Kirk’s medium. All the decolorization
flasks were maintained at pH 4.5 withMmethyl-succinic acid, sterilized (121 C) for
15 min in autoclave (Sanyo, Japan), and inoculated with 5 ml homogenous conidial
suspension of respective WRF strains in biological hood (Dalton, Japan). The
inoculated flasks were shaken for 10 days at 30 C in orbital shaker (Sanyo–Gallenkamp,
UK) except for P. chrysosporium that was incubated at 37 C (Asgher et al.,
2007). Samples withdrawn from triplicate flasks after every 48 h were used to determine
the percent dye decolorization. The most decolorized dye was selected for
optimization of decolorization process.
2.5. Optimization of decolorization parameters
To improve the decolorization efficiency of C. versicolor IBL-04 for maximally
decolorized dye Cibanon blue GFJ-MD, the effect of varying pH, temperature, addition
of varying carbon and nitrogen sources and, varying initial dye concentrations
was investigated. Classical method for process optimization was adopted. In each
experiment one factor was varied in triplicate keeping the previously optimized at
constant level.
2.5.1. Effect of initial pH
Triplicate decolorization flasks containing 0.01% dye solutions were adjusted at
varying pH (pH 3, 3.5, 4, 4.5 and 5) using methyl-succinic acid, sterilized, inoculated
with C. versicolor and shaken (120 rpm) at 30 C for 10 days (optimum time selected
in screening study).
2.5.2. Effect of incubation temperature
Triplicate decolorization flasks adjusted to pH 4.5 (optimum) were processed at
varying incubation temperatures viz.; 25, 30, 35, 40, 45 and 50 C for 10 days.
2.5.3. Effect of carbon supplements
To enhance the Cibanon blue GFJ-MD decolorization by C. versicolor glucose,
fructose, maltose, molasses and starch (1% w/v) were used as carbon and energy
supplements, and the flasks were processed under optimum pH and temperature
conditions for 10 days. In a subsequent experiment the effect of varying concentrations
(0.1–2% w/v) of the best carbon additive (starch) was monitored.
2.5.4. Effect of nitrogen additives
Ammonium sulphate, ammonium nitrate, ammonium dihydrogen phosphate,
peptone and urea (0.02% w/v) were used in the presence of 1.0% starch (optimum
carbon source) and the flasks were shaken for 3 days (optimum of previous experiment)
under optimum conditions of pH and temperature.
2.5.5. Effect of initial dye concentration
The screening and optimization experiments were run with 0.001% dye solution.
To investigate the tolerance of the fungus against the dye, the decolorization was
carried out with varying concentration solutions (0.001–0.02%) of Cibanon blue GFJMD.
2.5.6. Dye adsorption
For investigating the dye adsorption taking place on fungal mycelia, the flasks
contained only the dye solutions (0.001–0.02%) prepared in distilled water and no
Kirk’s basal medium or additional nutrients were added. The dye solutions were
adjusted to optimum pH, autoclaved, inoculated and incubated under optimum
conditions. The dye removal taking place in the flasks was considered as the dye
adsorbed on fungal mycelia as no growth and enzyme formation will take place in
the absence of growth medium and nutrients.
2.6. Determination of dye decolorization
To determine the degree of decolorization, absorbance measurements were
done using a UV/visible spectrophotometer (PG Instruments, UK) at lmax of respective
dyestuffs. Cibanon red 2B-MD, Cibanon golden-yellow PK-MD, Cibanon
blue GFJ-MD and Indanthrene direct black RBS had lmax values of 522, 467, 665 and
580 nm, respectively. Original dye solutions (0.001%) prepared in alkaline Kirk’s
medium were used as standards. The absorbance value of samples from decolorization
flasks was corrected by subtracting the value for respective blanks
(alkaline Kirk’s media). The corrected absorbance values were compared with
standards to calculate the percent dye decolorization.
2.7. Enzyme activity assays
To investigate the ligninases involved in decolorization mechanism, the contents
of the decolorization flasks at the end of each optimization experiment were filtered.
The filtrates (cell free extracts) were centrifuged and the carefully collected supernatants
were analyzed for the determination of enzyme activities. The activity of LiP
was monitored by following the oxidation of veratryl alcohol (4 mM) to veratraldehyde
at 30 C in 0.2 mM sodium acetate buffer (pH 3) in the presence of
0.1 mM H2O2 (Tien and Kirk, 1988). Blank contained 100 ml of distilled water instead
of enzyme aliquot. The absorbance of the sample and standard veratraldehyde was
read at 420 nm.
MnP activity was determined by the method of Wariishi et al. (1992) in a reaction
mixture containing 0.1 ml of culture supernatant and 1.0 ml of 1 M MnSO4,
1.0 ml of 50 mM sodium malonate buffer (pH 4.5) in the presence of 0.5 ml of
0.1 mM H2O2. Manganese ions Mnþ3 form a complex with malonate which absorbs
at 270 nm (3270 11590 M 1 cm 1). The amount of enzyme required to cause a unit
increase in absorbance in 1 min/ml of the assay mixture was defined as one unit of
MnP activity.
Laccase was assayed by a slight modification of the method of Shin and Lee
(2000) following the oxidation of 2,20-azino-bis(3-ethyl-benzo-thiazoline-sulphonate)
(ABTS) at 420 nm (3420 36000 M 1 cm 1) in assay mixture containing 0.1 ml
enzyme filtrate and 1 ml of 0.3 mM ABTS in 1 ml of 50 mM sodium malonate buffer.
One unit laccase activity was defined as the amount of enzyme causing one unit
increase in absorbance per min per ml of the assay mixture.
2.1. Vat textile dyes
Vat Dyes Cibanon red 2B-MD (C.I. 67000), Cibanon golden-yellow PK-MD (C.I.
5910) and Cibanon blue GFJ-MD (C.I. 69825) were provided free of cost by Ciba
Pakistan (Ltd.), Faisalabad. Indanthrene direct black RBS was procured from DyeStar
Pakistan (Ltd.), Faisalabad.
2.2. White rot fungi and preparation of inocula
The culture slants of Pleurotus ostreatus IBL-02, Phanerochaete chrysosporium
IBL-03, C. versicolor IBL-04, Ganoderma lucidum IBL-05 and Schizophyllum commune
IBL-06 were obtained from Industrial Biotechnology Laboratory, Department of
Chemistry and Biochemistry, University of Agriculture, Faisalabad. Inocula for all
cultures were prepared in labeled 500 ml Erlenmeyer flasks containing 100 ml of
Kirk’s basal nutrient medium (Tien and Kirk, 1988) supplemented with 1% glucose.
The flasks were adjusted at pH 4.5 withMNaOH/M HCl solutions and autoclaved for
15 min at 121 C (1.11 kg/cm3). After cooling to room temperature, the flasks was
inoculated with WRF spores from respective slant cultures and placed in rotary
shaker (120 rpm) at 30 C for 3 days to get a homogenous conidial suspension
(1 108 spores/ml).
2.3. Basal nutrient medium and preparation of dye solutions
Vat dyes solutions were prepared in slightly modified Kirk’s basal nutrient
medium (Tien and Kirk, 1988; Asgher et al., 2007). It was noted that vat dyes were
not soluble in aqueous Kirk’s medium. To get clear dye solutions, alkaline Kirk’s
medium was prepared in 0.01 M NaOH solution. However, the pH of the resultant
dyes solutions was highly basic (pH 9–11) and adjustment of pH 4.5 (pH for WRF)
with M HCl caused significant salt formation. To overcome this problem, the pH was
adjusted to 4.5 using M methyl-succinic acid solution. The use of methyl-succinic
acid caused only negligible salt formation.
2.4. Decolorization protocol and screening experiment
Four sets (15 flasks each) of triplicate decolorization flaks contained 0.01% of the
respective dye solutions prepared in alkaline Kirk’s medium. All the decolorization
flasks were maintained at pH 4.5 withMmethyl-succinic acid, sterilized (121 C) for
15 min in autoclave (Sanyo, Japan), and inoculated with 5 ml homogenous conidial
suspension of respective WRF strains in biological hood (Dalton, Japan). The
inoculated flasks were shaken for 10 days at 30 C in orbital shaker (Sanyo–Gallenkamp,
UK) except for P. chrysosporium that was incubated at 37 C (Asgher et al.,
2007). Samples withdrawn from triplicate flasks after every 48 h were used to determine
the percent dye decolorization. The most decolorized dye was selected for
optimization of decolorization process.
2.5. Optimization of decolorization parameters
To improve the decolorization efficiency of C. versicolor IBL-04 for maximally
decolorized dye Cibanon blue GFJ-MD, the effect of varying pH, temperature, addition
of varying carbon and nitrogen sources and, varying initial dye concentrations
was investigated. Classical method for process optimization was adopted. In each
experiment one factor was varied in triplicate keeping the previously optimized at
constant level.
2.5.1. Effect of initial pH
Triplicate decolorization flasks containing 0.01% dye solutions were adjusted at
varying pH (pH 3, 3.5, 4, 4.5 and 5) using methyl-succinic acid, sterilized, inoculated
with C. versicolor and shaken (120 rpm) at 30 C for 10 days (optimum time selected
in screening study).
2.5.2. Effect of incubation temperature
Triplicate decolorization flasks adjusted to pH 4.5 (optimum) were processed at
varying incubation temperatures viz.; 25, 30, 35, 40, 45 and 50 C for 10 days.
2.5.3. Effect of carbon supplements
To enhance the Cibanon blue GFJ-MD decolorization by C. versicolor glucose,
fructose, maltose, molasses and starch (1% w/v) were used as carbon and energy
supplements, and the flasks were processed under optimum pH and temperature
conditions for 10 days. In a subsequent experiment the effect of varying concentrations
(0.1–2% w/v) of the best carbon additive (starch) was monitored.
2.5.4. Effect of nitrogen additives
Ammonium sulphate, ammonium nitrate, ammonium dihydrogen phosphate,
peptone and urea (0.02% w/v) were used in the presence of 1.0% starch (optimum
carbon source) and the flasks were shaken for 3 days (optimum of previous experiment)
under optimum conditions of pH and temperature.
2.5.5. Effect of initial dye concentration
The screening and optimization experiments were run with 0.001% dye solution.
To investigate the tolerance of the fungus against the dye, the decolorization was
carried out with varying concentration solutions (0.001–0.02%) of Cibanon blue GFJMD.
2.5.6. Dye adsorption
For investigating the dye adsorption taking place on fungal mycelia, the flasks
contained only the dye solutions (0.001–0.02%) prepared in distilled water and no
Kirk’s basal medium or additional nutrients were added. The dye solutions were
adjusted to optimum pH, autoclaved, inoculated and incubated under optimum
conditions. The dye removal taking place in the flasks was considered as the dye
adsorbed on fungal mycelia as no growth and enzyme formation will take place in
the absence of growth medium and nutrients.
2.6. Determination of dye decolorization
To determine the degree of decolorization, absorbance measurements were
done using a UV/visible spectrophotometer (PG Instruments, UK) at lmax of respective
dyestuffs. Cibanon red 2B-MD, Cibanon golden-yellow PK-MD, Cibanon
blue GFJ-MD and Indanthrene direct black RBS had lmax values of 522, 467, 665 and
580 nm, respectively. Original dye solutions (0.001%) prepared in alkaline Kirk’s
medium were used as standards. The absorbance value of samples from decolorization
flasks was corrected by subtracting the value for respective blanks
(alkaline Kirk’s media). The corrected absorbance values were compared with
standards to calculate the percent dye decolorization.
2.7. Enzyme activity assays
To investigate the ligninases involved in decolorization mechanism, the contents
of the decolorization flasks at the end of each optimization experiment were filtered.
The filtrates (cell free extracts) were centrifuged and the carefully collected supernatants
were analyzed for the determination of enzyme activities. The activity of LiP
was monitored by following the oxidation of veratryl alcohol (4 mM) to veratraldehyde
at 30 C in 0.2 mM sodium acetate buffer (pH 3) in the presence of
0.1 mM H2O2 (Tien and Kirk, 1988). Blank contained 100 ml of distilled water instead
of enzyme aliquot. The absorbance of the sample and standard veratraldehyde was
read at 420 nm.
MnP activity was determined by the method of Wariishi et al. (1992) in a reaction
mixture containing 0.1 ml of culture supernatant and 1.0 ml of 1 M MnSO4,
1.0 ml of 50 mM sodium malonate buffer (pH 4.5) in the presence of 0.5 ml of
0.1 mM H2O2. Manganese ions Mnþ3 form a complex with malonate which absorbs
at 270 nm (3270 11590 M 1 cm 1). The amount of enzyme required to cause a unit
increase in absorbance in 1 min/ml of the assay mixture was defined as one unit of
MnP activity.
Laccase was assayed by a slight modification of the method of Shin and Lee
(2000) following the oxidation of 2,20-azino-bis(3-ethyl-benzo-thiazoline-sulphonate)
(ABTS) at 420 nm (3420 36000 M 1 cm 1) in assay mixture containing 0.1 ml
enzyme filtrate and 1 ml of 0.3 mM ABTS in 1 ml of 50 mM sodium malonate buffer.
One unit laccase activity was defined as the amount of enzyme causing one unit
increase in absorbance per min per ml of the assay mixture.
0/5000
2. วัสดุและวิธีการ2.1. vat สีย้อมสิ่งทอสีแดง Cibanon สี Vat 2B-MD (ซีไอกรุ๊ป 67000), Cibanon ทองเหลืองคือ MD (ซีไอกรุ๊ป5910) Cibanon สีน้ำเงิน GFJ-MD (ซีไอกรุ๊ป 69825) ได้และเสียค่าใช้จ่ายโดย Cibaปากีสถาน (จำกัด), ไฟซาลาบาด Indanthrene RBS สีดำตรงค้นหาจาก DyeStarปากีสถาน (จำกัด), ไฟซาลาบาด2.2. สีขาวเชื้อรา rot และเตรียม inoculaวัฒนธรรมการเอียงของเห็ดนาง ostreatus IBL-02, Phanerochaete chrysosporiumIBL 03, C. versicolor IBL-04 ผสม lucidum IBL-05 และ Schizophyllum communeIBL 06 ได้รับจากการปฏิบัติอุตสาหกรรมเทคโนโลยีชีวภาพ ภาควิชาเคมีและชีวเคมี มหาวิทยาลัยเกษตร ไฟซาลาบาด Inocula ทั้งหมดวัฒนธรรมได้เตรียมไว้ในป้าย 500 ml ประกอบด้วย 100 ml ของน้ำ Erlenmeyerโบสถ์ของโรคธาตุอาหารปานกลาง (เทียนและโบสถ์ 1988) เสริม ด้วยกลูโคส 1%น้ำถูกปรับปรุงที่แก้ไขปัญหา pH 4.5 withMNaOH/M HCl และ autoclaved สำหรับ15 นาทีที่ 121 C (1.11 kg/cm3) หลังจากทำความเย็นอุณหภูมิห้อง น้ำมีinoculated กับเพาะเฟิร์น WRF เอียงตามวัฒนธรรมและโรตารี่ในเชคเกอร์ (120 รอบต่อนาที) ที่ C 30 วัน 3 จะระงับ conidial ให้(1 ml 108 เพาะเฟิร์น)2.3. โรคธาตุอาหารปานกลางและเตรียมย้อมโซลูชั่นโซลูชั่นสี vat ถูกเตรียมในโบสถ์เล็กน้อยแก้ไขโรคอาหารปานกลาง (เทียนและโบสถ์ 1988 Asgher et al., 2007) มันถูกบันทึก vat สีได้ไม่ละลายน้ำได้ในโบสถ์อควี จะได้รับโซลูชั่นย้อมล้าง โบสถ์ด่างของสื่อเตรียมไว้ในโซลูชัน 0.01 M NaOH อย่างไรก็ตาม pH resultantโซลูชั่นของสีมีสูง basic (pH 9-11) และการปรับปรุง pH 4.5 (pH สำหรับ WRF)กับ M HCl เกิดก่อตัวเกลือที่สำคัญ ที่จะเอาชนะปัญหานี้ pHปรับใช้โซลูชันกรด methyl succinic ม. 4.5 ใช้ methyl succinicกรดเกิดเฉพาะระยะเกลือก่อ2.4 การบำบัดโพรโทคอลและตรวจทดลองชุด 4 (15 น้ำละ) ของ flaks triplicate บำบัดมีอยู่ 0.01% ของโซลูชั่นย้อมตามลำดับที่เตรียมไว้ในโบสถ์ด่างปานกลาง บำบัดทั้งหมดน้ำได้รับการรักษาที่ค่า pH 4.5 withMmethyl-กรด sterilized (121 C)15 นาทีในด้วย (Sanyo ญี่ปุ่น), และ inoculated ด้วย 5 ml ให้ conidialระงับการ WRF สายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องในฮูดชีวภาพ (ดาลตัน ญี่ปุ่น) ที่น้ำ inoculated ถูกเขย่า 10 วันที่ 30 C ในเชคเกอร์ของวงโคจร (ซันโย – Gallenkampสหราชอาณาจักร) ยกเว้น chrysosporium P. ที่ถูก incubated ที่ 37 C (Asgher et al.,2007) ตัวอย่างถอนจากน้ำ triplicate หลัง h ทุก 48 ถูกใช้เพื่อกำหนดเปอร์เซ็นต์สีบำบัด เลือกสำหรับย้อม decolorized มากที่สุดเพิ่มประสิทธิภาพของกระบวนการบำบัด2.5 การปรับพารามิเตอร์บำบัดการปรับปรุงประสิทธิภาพการบำบัดของ C. versicolor IBL-04 สำหรับ maximallyสีย้อม decolorized Cibanon บลู GFJ MD ผลเพิ่ม อุณหภูมิ pH แตกต่างกันความแตกต่างกันแหล่งคาร์บอนและไนโตรเจน ย้อมเริ่มต้นความเข้มข้นแตกต่างกันตรวจสอบได้ วิธีคลาสสิกสำหรับกระบวนการปรับให้เหมาะสมถูกนำมาใช้ ในแต่ละปัจจัยหนึ่งของการทดลองแตกต่างกันใน triplicate เพิ่มประสิทธิภาพก่อนหน้านี้รักษาที่ระดับคง2.5.1. ผลของ pH เริ่มต้นTriplicate บำบัดน้ำที่ประกอบด้วยโซลูชั่นย้อม 0.01% ถูกปรับปรุงที่แตกต่างกัน pH (pH 3, 3.5, 4, 4.5 และ 5) ใช้ methyl-กรด sterilized, inoculatedมี C. versicolor และหวั่นไหว (120 รอบต่อนาที) ที่ 30 C 10 วัน (สูงสุดเวลาเลือกในการคัดกรองการศึกษา)2.5.2. ผลของอุณหภูมิการบ่มTriplicate บำบัดน้ำปรับ pH 4.5 (สูงสุด) ถูกประมวลผลที่แตกต่างกันอุณหภูมิบ่ม viz.; 25, 30, 35, 40, 45 และ 50 C 10 วัน2.5.3. ผลของการเสริมคาร์บอนเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการบำบัด Cibanon บลู GFJ MD โดย C. กลูโคส versicolorฟรักโทส maltose กากน้ำตาล และแป้ง (1% w/v) ใช้เป็นพลังงานและคาร์บอนอาหารเสริม และน้ำถูกประมวลผลภายใต้อุณหภูมิและ pH ที่เหมาะสมเงื่อนไขสำหรับ 10 วัน ในภายหลังการทดลองผลของความเข้มข้นแตกต่างกัน(0.1-2% w/v) ของคาร์บอนสุด การบวก (แป้ง) ถูกตรวจสอบ2.5.4. ผลของสารไนโตรเจนซัลเฟตแอมโมเนีย แอมโมเนีย แอมโมเนียไฮโดรเจน ฟอสเฟตpeptone และยูเรีย (0.02% w/v) ใช้ในต่อหน้าของแป้ง 1.0% (สูงสุดแหล่งคาร์บอน) และน้ำถูกเขย่า 3 วัน (เหมาะสมทดลองก่อนหน้านี้)ภายใต้เงื่อนไขที่เหมาะสมของ pH และอุณหภูมิ2.5.5. ผลของความเข้มข้นเริ่มต้นย้อมทดลองคัดกรองและปรับให้เหมาะสมถูกเรียกใช้ ด้วยโซลูชั่นย้อม 0.001%การตรวจสอบค่าเผื่อของเชื้อรากับการย้อม การบำบัดได้มีออก ด้วยโซลูชั่นที่ความเข้มข้นแตกต่างกัน (0.001 – 0.02%) ของ Cibanon ฟ้า GFJMD2.5.6 การดูดซับสีย้อมสำหรับการตรวจสอบการดูดซับสีย้อมที่ใช้กับเชื้อรา mycelia การนำประกอบด้วยเฉพาะในโซลูชั่นย้อม (0.001 – 0.02%) เตรียมในน้ำกลั่นและไม่โบสถ์ของโรคปานกลาง หรือเติมสารอาหารเพิ่มขึ้น โซลูชั่นย้อมได้ปรับค่า pH ที่เหมาะสม autoclaved, inoculated และ incubated ภายใต้เหมาะสมเงื่อนไขการ การกำจัดสีย้อมที่มีสถานที่ในการนำถูกถือว่าเป็นการย้อมadsorbed mycelia เชื้อราก่อตัวไม่เจริญเติบโตและเอนไซม์จะเกิดขึ้นในการขาดงานของอาหารเลี้ยงเชื้อและสารอาหาร2.6 การกำหนดการบำบัดสีย้อมเพื่อกำหนดระดับของการบำบัด การวัด absorbance ได้ทำได้โดยใช้การมอง เห็น/UV เครื่องทดสอบกรดด่าง (เครื่อง PG สหราชอาณาจักร) ที่ lmax ของแต่ละสีย้อม Cibanon แดงที่ 2B-MD, Cibanon ทองเหลือง PK-MD, CibanonGFJ MD สีน้ำเงินและ Indanthrene ตรงที่ RBS สีดำมีค่า lmax 522, 467, 665 และ580 nm ตามลำดับ เดิมย้อมโซลูชั่น (0.001%) เตรียมไว้ในโบสถ์ด่างสื่อที่ใช้เป็นมาตรฐาน ค่า absorbance ของตัวอย่างจากการบำบัดน้ำถูกแก้ไข โดยการลบค่าในช่องที่เกี่ยวข้อง(โบสถ์ด่างสื่อ) ค่า absorbance ที่แก้ไขถูกเปรียบเทียบกับมาตรฐานในการคำนวณเปอร์เซ็นต์สีบำบัด2.7. เอนไซม์กิจกรรม assaysการตรวจสอบ ligninases ที่เกี่ยวข้องกับกลไกการบำบัด เนื้อหาได้กรองน้ำที่สิ้นสุดของแต่ละการทดลองเพิ่มประสิทธิภาพของการบำบัดFiltrates (ฟรีสารสกัดจากเซลล์) ถูก centrifuged และ supernatants รวบรวมอย่างระมัดระวังมีวิเคราะห์สำหรับการกำหนดกิจกรรมของเอนไซม์ การ LiPถูกตรวจสอบ โดยการเกิดออกซิเดชันของแอลกอฮอล์ veratryl (4 mM) เพื่อ veratraldehydeที่ 30 C ในบัฟเฟอร์ acetate โซเดียม 0.2 mM (pH 3) หน้าH2O2 0.1 มม. (เทียนและโบสถ์ 1988) ว่างอยู่ 100 ml ของน้ำกลั่นแทนของเอนไซม์ส่วนลงตัว มี absorbance ของตัวอย่างและมาตรฐาน veratraldehydeอ่านที่ 420 nmกิจกรรม MnP ถูกตามวิธีของ Wariishi et al. (1992) ในปฏิกิริยาที่ส่วนผสมประกอบด้วย 0.1 ml ของ supernatant และ 1.0 ml 1 M MnSO41.0 ml บัฟเฟอร์ malonate โซเดียม 50 มม. (pH 4.5) ในต่อหน้าของ 0.5 ml ของ0.1 มม. H2O2 แมงกานีสประจุ Mnþ3 แบบฟอร์มซับซ้อนกับ malonate ซึ่งดูดซับที่ 270 nm (3270 11590 M 1 ซม. 1) จำนวนของเอนไซม์ที่จำเป็นในการทำให้หน่วยเพิ่ม absorbance ใน 1 นาที/มล.ของส่วนผสมการวิเคราะห์ถูกกำหนดเป็นหนึ่งหน่วยกิจกรรม MnPLaccase ได้ assayed โดยการปรับเปลี่ยนเล็กน้อยวิธีการของชินและลีต่อการเกิดออกซิเดชันของ 2,20-azino-bis(3-ethyl-benzo-thiazoline-sulphonate) (2000)(รเรียน) ที่ 420 nm (3420 36000 M 1 ซม. 1) วิเคราะห์ส่วนผสมที่ประกอบด้วย 0.1 มล.enzyme filtrate and 1 ml of 0.3 mM ABTS in 1 ml of 50 mM sodium malonate buffer.One unit laccase activity was defined as the amount of enzyme causing one unitincrease in absorbance per min per ml of the assay mixture.
การแปล กรุณารอสักครู่..
2. วัสดุและวิธีการ2. Materials and methods
2.1 2.1. Vat textile dyes
Vat Dyes Cibanon red 2B-MD (C.I. 67000), Cibanon golden-yellow PK-MD (C.I.
5910) and Cibanon blue GFJ-MD (C.I. 69825) were provided free of cost by Ciba
Pakistan (Ltd.), Faisalabad. Indanthrene direct black RBS was procured from DyeStar
Pakistan (Ltd.), Faisalabad.
2.2. White rot fungi and preparation of inocula
The culture slants of Pleurotus ostreatus IBL-02, Phanerochaete chrysosporium
IBL-03, C. versicolor IBL-04, Ganoderma lucidum IBL-05 and Schizophyllum commune
IBL-06 were obtained from Industrial Biotechnology Laboratory, Department of
Chemistry and Biochemistry, University of Agriculture, Faisalabad. Inocula for all
cultures were prepared in labeled 500 ml Erlenmeyer flasks containing 100 ml of
Kirk’s basal nutrient medium (Tien and Kirk, 1988) supplemented with 1% glucose.
The flasks were adjusted at pH 4.5 withMNaOH/M HCl solutions and autoclaved for
15 min at 121 C (1.11 kg/cm3). After cooling to room temperature, the flasks was
inoculated with WRF spores from respective slant cultures and placed in rotary
shaker (120 rpm) at 30 C for 3 days to get a homogenous conidial suspension
(1 108 spores/ml).
2.3. Basal nutrient medium and preparation of dye solutions
Vat dyes solutions were prepared in slightly modified Kirk’s basal nutrient
medium (Tien and Kirk, 1988; Asgher et al., 2007). It was noted that vat dyes were
not soluble in aqueous Kirk’s medium. To get clear dye solutions, alkaline Kirk’s
medium was prepared in 0.01 M NaOH solution. However, the pH of the resultant
dyes solutions was highly basic (pH 9–11) and adjustment of pH 4.5 (pH for WRF)
with M HCl caused significant salt formation. To overcome this problem, the pH was
adjusted to 4.5 using M methyl-succinic acid solution. The use of methyl-succinic
acid caused only negligible salt formation.
2.4. Decolorization protocol and screening experiment
Four sets (15 flasks each) of triplicate decolorization flaks contained 0.01% of the
respective dye solutions prepared in alkaline Kirk’s medium. All the decolorization
flasks were maintained at pH 4.5 withMmethyl-succinic acid, sterilized (121 C) for
15 min in autoclave (Sanyo, Japan), and inoculated with 5 ml homogenous conidial
suspension of respective WRF strains in biological hood (Dalton, Japan). The
inoculated flasks were shaken for 10 days at 30 C in orbital shaker (Sanyo–Gallenkamp,
UK) except for P. chrysosporium that was incubated at 37 C (Asgher et al.,
2007). Samples withdrawn from triplicate flasks after every 48 h were used to determine
the percent dye decolorization. The most decolorized dye was selected for
optimization of decolorization process.
2.5. Optimization of decolorization parameters
To improve the decolorization efficiency of C. versicolor IBL-04 for maximally
decolorized dye Cibanon blue GFJ-MD, the effect of varying pH, temperature, addition
of varying carbon and nitrogen sources and, varying initial dye concentrations
was investigated. Classical method for process optimization was adopted. In each
experiment one factor was varied in triplicate keeping the previously optimized at
constant level.
2.5.1. Effect of initial pH
Triplicate decolorization flasks containing 0.01% dye solutions were adjusted at
varying pH (pH 3, 3.5, 4, 4.5 and 5) using methyl-succinic acid, sterilized, inoculated
with C. versicolor and shaken (120 rpm) at 30 C for 10 days (optimum time selected
in screening study).
2.5.2. Effect of incubation temperature
Triplicate decolorization flasks adjusted to pH 4.5 (optimum) were processed at
varying incubation temperatures viz.; 25, 30, 35, 40, 45 and 50 C for 10 days.
2.5.3. Effect of carbon supplements
To enhance the Cibanon blue GFJ-MD decolorization by C. versicolor glucose,
fructose, maltose, molasses and starch (1% w/v) were used as carbon and energy
supplements, and the flasks were processed under optimum pH and temperature
conditions for 10 days. In a subsequent experiment the effect of varying concentrations
(0.1–2% w/v) of the best carbon additive (starch) was monitored.
2.5.4. Effect of nitrogen additives
Ammonium sulphate, ammonium nitrate, ammonium dihydrogen phosphate,
peptone and urea (0.02% w/v) were used in the presence of 1.0% starch (optimum
carbon source) and the flasks were shaken for 3 days (optimum of previous experiment)
under optimum conditions of pH and temperature.
2.5.5. Effect of initial dye concentration
The screening and optimization experiments were run with 0.001% dye solution.
To investigate the tolerance of the fungus against the dye, the decolorization was
carried out with varying concentration solutions (0.001–0.02%) of Cibanon blue GFJMD.
2.5.6. Dye adsorption
For investigating the dye adsorption taking place on fungal mycelia, the flasks
contained only the dye solutions (0.001–0.02%) prepared in distilled water and no
Kirk’s basal medium or additional nutrients were added. The dye solutions were
adjusted to optimum pH, autoclaved, inoculated and incubated under optimum
conditions. The dye removal taking place in the flasks was considered as the dye
adsorbed on fungal mycelia as no growth and enzyme formation will take place in
the absence of growth medium and nutrients.
2.6. Determination of dye decolorization
To determine the degree of decolorization, absorbance measurements were
done using a UV/visible spectrophotometer (PG Instruments, UK) at lmax of respective
dyestuffs. Cibanon red 2B-MD, Cibanon golden-yellow PK-MD, Cibanon
blue GFJ-MD and Indanthrene direct black RBS had lmax values of 522, 467, 665 and
580 nm, respectively. Original dye solutions (0.001%) prepared in alkaline Kirk’s
medium were used as standards. The absorbance value of samples from decolorization
flasks was corrected by subtracting the value for respective blanks
(alkaline Kirk’s media). The corrected absorbance values were compared with
standards to calculate the percent dye decolorization.
2.7. Enzyme activity assays
To investigate the ligninases involved in decolorization mechanism, the contents
of the decolorization flasks at the end of each optimization experiment were filtered.
The filtrates (cell free extracts) were centrifuged and the carefully collected supernatants
were analyzed for the determination of enzyme activities. The activity of LiP
was monitored by following the oxidation of veratryl alcohol (4 mM) to veratraldehyde
at 30 C in 0.2 mM sodium acetate buffer (pH 3) in the presence of
0.1 mM H2O2 (Tien and Kirk, 1988). Blank contained 100 ml of distilled water instead
of enzyme aliquot. The absorbance of the sample and standard veratraldehyde was
read at 420 nm.
MnP activity was determined by the method of Wariishi et al. (1992) in a reaction
mixture containing 0.1 ml of culture supernatant and 1.0 ml of 1 M MnSO4,
1.0 ml of 50 mM sodium malonate buffer (pH 4.5) in the presence of 0.5 ml of
0.1 mM H2O2. Manganese ions Mnþ3 form a complex with malonate which absorbs
at 270 nm (3270 11590 M 1 cm 1). The amount of enzyme required to cause a unit
increase in absorbance in 1 min/ml of the assay mixture was defined as one unit of
MnP activity.
Laccase was assayed by a slight modification of the method of Shin and Lee
(2000) following the oxidation of 2,20-azino-bis(3-ethyl-benzo-thiazoline-sulphonate)
(ABTS) at 420 nm (3420 36000 M 1 cm 1) in assay mixture containing 0.1 ml
enzyme filtrate and 1 ml of 0.3 mM ABTS in 1 ml of 50 mM sodium malonate buffer.
One unit laccase activity was defined as the amount of enzyme causing one unit
increase in absorbance per min per ml of the assay mixture.
2.1 2.1. Vat textile dyes
Vat Dyes Cibanon red 2B-MD (C.I. 67000), Cibanon golden-yellow PK-MD (C.I.
5910) and Cibanon blue GFJ-MD (C.I. 69825) were provided free of cost by Ciba
Pakistan (Ltd.), Faisalabad. Indanthrene direct black RBS was procured from DyeStar
Pakistan (Ltd.), Faisalabad.
2.2. White rot fungi and preparation of inocula
The culture slants of Pleurotus ostreatus IBL-02, Phanerochaete chrysosporium
IBL-03, C. versicolor IBL-04, Ganoderma lucidum IBL-05 and Schizophyllum commune
IBL-06 were obtained from Industrial Biotechnology Laboratory, Department of
Chemistry and Biochemistry, University of Agriculture, Faisalabad. Inocula for all
cultures were prepared in labeled 500 ml Erlenmeyer flasks containing 100 ml of
Kirk’s basal nutrient medium (Tien and Kirk, 1988) supplemented with 1% glucose.
The flasks were adjusted at pH 4.5 withMNaOH/M HCl solutions and autoclaved for
15 min at 121 C (1.11 kg/cm3). After cooling to room temperature, the flasks was
inoculated with WRF spores from respective slant cultures and placed in rotary
shaker (120 rpm) at 30 C for 3 days to get a homogenous conidial suspension
(1 108 spores/ml).
2.3. Basal nutrient medium and preparation of dye solutions
Vat dyes solutions were prepared in slightly modified Kirk’s basal nutrient
medium (Tien and Kirk, 1988; Asgher et al., 2007). It was noted that vat dyes were
not soluble in aqueous Kirk’s medium. To get clear dye solutions, alkaline Kirk’s
medium was prepared in 0.01 M NaOH solution. However, the pH of the resultant
dyes solutions was highly basic (pH 9–11) and adjustment of pH 4.5 (pH for WRF)
with M HCl caused significant salt formation. To overcome this problem, the pH was
adjusted to 4.5 using M methyl-succinic acid solution. The use of methyl-succinic
acid caused only negligible salt formation.
2.4. Decolorization protocol and screening experiment
Four sets (15 flasks each) of triplicate decolorization flaks contained 0.01% of the
respective dye solutions prepared in alkaline Kirk’s medium. All the decolorization
flasks were maintained at pH 4.5 withMmethyl-succinic acid, sterilized (121 C) for
15 min in autoclave (Sanyo, Japan), and inoculated with 5 ml homogenous conidial
suspension of respective WRF strains in biological hood (Dalton, Japan). The
inoculated flasks were shaken for 10 days at 30 C in orbital shaker (Sanyo–Gallenkamp,
UK) except for P. chrysosporium that was incubated at 37 C (Asgher et al.,
2007). Samples withdrawn from triplicate flasks after every 48 h were used to determine
the percent dye decolorization. The most decolorized dye was selected for
optimization of decolorization process.
2.5. Optimization of decolorization parameters
To improve the decolorization efficiency of C. versicolor IBL-04 for maximally
decolorized dye Cibanon blue GFJ-MD, the effect of varying pH, temperature, addition
of varying carbon and nitrogen sources and, varying initial dye concentrations
was investigated. Classical method for process optimization was adopted. In each
experiment one factor was varied in triplicate keeping the previously optimized at
constant level.
2.5.1. Effect of initial pH
Triplicate decolorization flasks containing 0.01% dye solutions were adjusted at
varying pH (pH 3, 3.5, 4, 4.5 and 5) using methyl-succinic acid, sterilized, inoculated
with C. versicolor and shaken (120 rpm) at 30 C for 10 days (optimum time selected
in screening study).
2.5.2. Effect of incubation temperature
Triplicate decolorization flasks adjusted to pH 4.5 (optimum) were processed at
varying incubation temperatures viz.; 25, 30, 35, 40, 45 and 50 C for 10 days.
2.5.3. Effect of carbon supplements
To enhance the Cibanon blue GFJ-MD decolorization by C. versicolor glucose,
fructose, maltose, molasses and starch (1% w/v) were used as carbon and energy
supplements, and the flasks were processed under optimum pH and temperature
conditions for 10 days. In a subsequent experiment the effect of varying concentrations
(0.1–2% w/v) of the best carbon additive (starch) was monitored.
2.5.4. Effect of nitrogen additives
Ammonium sulphate, ammonium nitrate, ammonium dihydrogen phosphate,
peptone and urea (0.02% w/v) were used in the presence of 1.0% starch (optimum
carbon source) and the flasks were shaken for 3 days (optimum of previous experiment)
under optimum conditions of pH and temperature.
2.5.5. Effect of initial dye concentration
The screening and optimization experiments were run with 0.001% dye solution.
To investigate the tolerance of the fungus against the dye, the decolorization was
carried out with varying concentration solutions (0.001–0.02%) of Cibanon blue GFJMD.
2.5.6. Dye adsorption
For investigating the dye adsorption taking place on fungal mycelia, the flasks
contained only the dye solutions (0.001–0.02%) prepared in distilled water and no
Kirk’s basal medium or additional nutrients were added. The dye solutions were
adjusted to optimum pH, autoclaved, inoculated and incubated under optimum
conditions. The dye removal taking place in the flasks was considered as the dye
adsorbed on fungal mycelia as no growth and enzyme formation will take place in
the absence of growth medium and nutrients.
2.6. Determination of dye decolorization
To determine the degree of decolorization, absorbance measurements were
done using a UV/visible spectrophotometer (PG Instruments, UK) at lmax of respective
dyestuffs. Cibanon red 2B-MD, Cibanon golden-yellow PK-MD, Cibanon
blue GFJ-MD and Indanthrene direct black RBS had lmax values of 522, 467, 665 and
580 nm, respectively. Original dye solutions (0.001%) prepared in alkaline Kirk’s
medium were used as standards. The absorbance value of samples from decolorization
flasks was corrected by subtracting the value for respective blanks
(alkaline Kirk’s media). The corrected absorbance values were compared with
standards to calculate the percent dye decolorization.
2.7. Enzyme activity assays
To investigate the ligninases involved in decolorization mechanism, the contents
of the decolorization flasks at the end of each optimization experiment were filtered.
The filtrates (cell free extracts) were centrifuged and the carefully collected supernatants
were analyzed for the determination of enzyme activities. The activity of LiP
was monitored by following the oxidation of veratryl alcohol (4 mM) to veratraldehyde
at 30 C in 0.2 mM sodium acetate buffer (pH 3) in the presence of
0.1 mM H2O2 (Tien and Kirk, 1988). Blank contained 100 ml of distilled water instead
of enzyme aliquot. The absorbance of the sample and standard veratraldehyde was
read at 420 nm.
MnP activity was determined by the method of Wariishi et al. (1992) in a reaction
mixture containing 0.1 ml of culture supernatant and 1.0 ml of 1 M MnSO4,
1.0 ml of 50 mM sodium malonate buffer (pH 4.5) in the presence of 0.5 ml of
0.1 mM H2O2. Manganese ions Mnþ3 form a complex with malonate which absorbs
at 270 nm (3270 11590 M 1 cm 1). The amount of enzyme required to cause a unit
increase in absorbance in 1 min/ml of the assay mixture was defined as one unit of
MnP activity.
Laccase was assayed by a slight modification of the method of Shin and Lee
(2000) following the oxidation of 2,20-azino-bis(3-ethyl-benzo-thiazoline-sulphonate)
(ABTS) at 420 nm (3420 36000 M 1 cm 1) in assay mixture containing 0.1 ml
enzyme filtrate and 1 ml of 0.3 mM ABTS in 1 ml of 50 mM sodium malonate buffer.
One unit laccase activity was defined as the amount of enzyme causing one unit
increase in absorbance per min per ml of the assay mixture.
การแปล กรุณารอสักครู่..
2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . ภาษีมูลค่าเพิ่มการย้อมสีสิ่งทอ
สี vat cibanon สีแดง 2b-md ( สาย 67 , 000 ) , cibanon สีเหลืองทอง pk-md ( สาย
5910 ) และ cibanon สีฟ้า gfj-md ( สาย 69825 ) จะได้รับฟรีของค่าใช้จ่ายโดย Ciba
ปากีสถาน ( จำกัด ) , Faisalabad . indanthrene ตรงสีดำนี้คือ procured จาก dyestar
ปากีสถาน ( จำกัด ) , Faisalabad .
2.2 . เชื้อราเน่าสีขาวและการเตรียม inocula
วัฒนธรรมของ slants Pleurotus ostreatus ibl-02 phanerochaete , chrysosporium
ibl-03 C ibl-04 , โรค , ibl-05 เห็ดหลินจือ และเห็ดแครง
ibl-06 ได้จากห้องปฏิบัติการเทคโนโลยีชีวภาพอุตสาหกรรม ภาควิชา
เคมีและชีวเคมี มหาวิทยาลัยเกษตร , Faisalabad . inocula ทั้งหมด
วัฒนธรรมเตรียมในป้าย 500 มล. ขวดบรรจุ 100 ml
เออร์เลนเมเยอร์เคิร์กแรกเริ่มสารอาหารปานกลาง ( เทียน และเคิร์ก , 1988 ) ที่เติมกลูโคส 1%
ขวดทำการปรับ pH 4.5 withmnaoh / M HCl โซลูชั่นและสังเคราะห์สำหรับ
ที่ 121 องศาเซลเซียส 15 นาที ( 1.11 kg ลิตร ) หลังจากเย็นอุณหภูมิห้อง ขวดที่ใส่อยู่
wrf สปอร์จากวัฒนธรรม ลาดที่เกี่ยวข้องและวางไว้ในโรตารี
เครื่องปั่น ( 120 รอบต่อนาทีที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 3 วัน เพื่อให้ได้
ระงับจากเนื้อเดียว1 108 สปอร์ / มล ) .
2.3 การเตรียมสื่อและแรกเริ่มของธาตุอาหารโซลูชั่น
ย้อมสี vat โซลูชั่นเตรียมในการแก้ไขเล็กน้อยเคิร์กแรกเริ่มสารอาหารปานกลาง ( เทียน และเคิร์ก
, 1988 ; asgher et al . , 2007 ) มันเป็นข้อสังเกตว่าสี vat และไม่ละลายในน้ำ
เคิร์ก ) ที่จะได้รับโซลูชั่นสีชัดเจน ด่างเคิร์ก
) เตรียมใน 0.01 M โซเดียมไฮดรอกไซด์ อย่างไรก็ตามpH ของ resultant
สีโซลูชั่นมีพื้นฐาน ( พีเอช 9 – 11 ) และปรับ pH ( pH สำหรับ wrf )
M HCl ที่เกิดกับชั้นเกลือที่สำคัญ ที่จะเอาชนะปัญหานี้ , pH 4.5 M
ปรับใช้เมทิลน้ำตาลแก้ การใช้กรดซัคซิเมทิลที่เกิดขึ้นเพียงเล็กน้อยเกลือหิน
.
2.4 . ขั้นตอนการคัดกรองการทดสอบ
4 ชุด ( 15 ขวดแต่ละ ) ของการทำสำเนาสามฉบับ flaks ที่มีอยู่ 0.01 % ของแต่ละสีไว้ในโซลูชั่น
เคิร์กเป็นด่างปานกลาง การ flasks ทั้งหมด
ถูกเก็บรักษาไว้ที่ pH 4.5 withmmethyl น้ำตาลฆ่าเชื้อ ( 121 องศาเซลเซียส 15 นาทีในหม้อฆ่าเชื้อ (
ซันโย ประเทศญี่ปุ่น และที่ใส่ 5 ml homogenous เดีย
ช่วงล่างของแต่ละ wrf สายพันธุ์ในเครื่องดูดควันทางชีวภาพ ( ดาลตันญี่ปุ่น )
หัวเชื้อขวดสั่นสะเทือน เป็นเวลา 10 วัน ที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสในเครื่องปั่นโคจร ( ซันโย ) gallenkamp
, UK ) ยกเว้นหน้า chrysosporium ที่บ่มที่อุณหภูมิ 37 ( asgher et al . ,
2007 ) ตัวอย่าง ถอนตัวจากการทำสำเนาสามฉบับขวดทุกครั้งหลังจาก 48 ชั่วโมงใช้เพื่อกำหนด
เปอร์เซ็นต์ย้อมสี . ที่สุดพลึงย้อมถูกเลือกสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพของกระบวนการ
.
2.5การเพิ่มประสิทธิภาพของพารามิเตอร์
ปรับปรุงประสิทธิภาพของการกำจัดโรค ibl-04 C สำหรับสูงสุด
พลึงย้อม cibanon gfj-md สีน้ำเงิน อุณหภูมิ ผลของการเปลี่ยนแปลง pH เพิ่ม
ของคาร์บอนและไนโตรเจนที่แตกต่างกันและสีที่มีความเข้มข้นเริ่มต้น
ถูกตรวจสอบ วิธีที่คลาสสิกสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพกระบวนการเป็นลูกบุญธรรม ในแต่ละ
การทดลองหนึ่งปัจจัยที่หลากหลายทั้งสามใบไว้ก่อนหน้านี้ที่ระดับคงที่ (
.
ดาวน์โหลด . ผลของพีเอชเริ่มต้นของอาหารที่มีโซลูชั่นการ
ทำสำเนาสามฉบับ 0.01% ย้อมถูกปรับ pH ( pH แตกต่างกัน
3 , 3.5 , 4 , 4.5 และ 5 ) การใช้เมทิลน้ำตาลฆ่าเชื้อเชื้อ C .
, โรคและสะเทือน ( 120 รอบต่อนาทีที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 วัน ( เวลาที่เหมาะสมในการตรวจเลือก
ศึกษา ) .
งานวาง . ผลของการบ่มที่อุณหภูมิ
ทำสำเนาสามฉบับการ flasks ปรับ pH 4.5 ( ที่เหมาะสม ) มีการประมวลผลที่แตกต่างกัน ได้แก่ อุณหภูมิการบ่ม
; 25 , 30 , 35 , 40 , 45 และ 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 วัน
2.5.3 . ผลของคาร์บอนเสริม
เพื่อเพิ่ม cibanon สีฟ้า gfj-md การกำจัดโรคโดย C .
โตส , มอลโตส , ตาล , ตาลและแป้ง ( 1% w / v ) ใช้เป็นคาร์บอนและพลังงาน
อาหารเสริมและอาหารถูกประมวลผลภายใต้พีเอชและอุณหภูมิอากาศ
เป็นเวลา 10 วัน ในต่อมาการทดลองผลของความเข้มข้นแตกต่างกัน
( 0.1 – 2 % w / v ) ที่สุดของคาร์บอนเพิ่ม ( แป้ง ) คือการตรวจสอบ .
2.5.4 . ผลของไนโตรเจน สารแอมโมเนียมไนเตรท
แอมโมเนียมซัลเฟต , แอมโมเนียมฟอสเฟต dihydrogen
extract , และยูเรีย ( 0.02 % w / v ) ที่ใช้ในการแสดงตนที่ 10 % แป้ง ( แหล่งคาร์บอนที่เหมาะสม
) และ flasks สั่นสะเทือนเป็นเวลา 3 วัน ( สูงสุดของการทดสอบก่อนหน้านี้ )
ภายใต้สภาวะที่เหมาะสมของ pH และอุณหภูมิ
สมบูรณ์ . ผลของความเข้มข้นเริ่มต้นของสีย้อม
คัดกรองและการเพิ่มประสิทธิภาพการทดลองใช้สารละลายสี 0.001 %
ศึกษาความอดทนของเชื้อรากับสี สีคือ
ดำเนินการกับค่าความเข้มข้นสารละลาย 0.01 - 0.02 % ) ของ cibanon สีฟ้า gfjmd .
2.5.6 . การดูดซับสีย้อม
เพื่อตรวจสอบการดูดซับสีเกิดขึ้นบนเส้นใยเชื้อรา , flasks
มีเพียงสี โซลูชั่น ( 0.001 – 0.02% ) ที่เตรียมไว้ในน้ำกลั่นและไม่มี
เคิร์กแรกเริ่มขนาดกลางหรือสารอาหารเพิ่ม . สีโซลูชั่น
ปรับพีเอชที่เหมาะสมสังเคราะห์ , ,บ่มเชื้อภายใต้สภาวะที่เหมาะสม
การกำจัดสีที่เกิดขึ้นในขวดเป็นย้อมเส้นใยเชื้อรา
ดูดซับบนเป็นไม่มีการเจริญเติบโตและเอนไซม์ การพัฒนาจะเกิดขึ้นในการขาดงานของการเจริญเติบโตปานกลาง
และสารอาหาร 2.6 การกำหนดสีและการกำหนดระดับของการ
วัดการดูดกลืนแสงคือการใช้ UV Spectrophotometer ( สหราชอาณาจักร / มองเห็นเครื่องมือ , PG ) Lmax สีย้อมนั้น
cibanon 2b-md cibanon สีแดง , สีเหลืองทอง pk-md cibanon
, สีฟ้าและสีดำ gfj-md indanthrene ตรงนี้ได้ค่า Lmax ของทั้งหมด 665 และ
522 , 580 นาโนเมตร โซลูชั่นสีเดิม ( 0.001 % ) เตรียมจัดเคิร์ก
สื่อที่ถูกใช้เป็นมาตรฐานนคุณค่าของตัวอย่างจากการได้รับการแก้ไขโดยการลบ
ขวดค่าสำหรับแต่ละช่องว่าง
( ด่าง เคิร์ก สื่อ ) แก้ไขค่าค่าเทียบกับมาตรฐานในการคำนวณเปอร์เซ็นต์สี
2.7 สี . . เอนไซม์
ศึกษา ligninases มีส่วนร่วมในกลไกการเนื้อหา
,ในการกำจัดจุลินทรีย์ในตอนท้ายของแต่ละเพิ่มประสิทธิภาพการทดลองกรองสารละลาย .
( เซลล์สารสกัดไฟฟ้าฟรี ) และการเก็บรวบรวมอย่างระมัดระวัง supernatants
วิเคราะห์การวิเคราะห์กิจกรรมของเอนไซม์ กิจกรรมของ lip
ถูกตรวจสอบโดยต่อปฏิกิริยาออกซิเดชันของแอลกอฮอล์ veratryl ( 4 มม. ) ที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสใน veratraldehyde
02 มิลลิเมตรโซเดียมอะซิเตตบัฟเฟอร์ pH 3 ) ในการแสดงตนของ
0.1 มม. ( และ H2O2 เตียน เคิร์ก , 1988 ) เปล่ามีอยู่ 100 มล. น้ำกลั่นแทน
เอนไซม์ส่วนที่หารลงตัว มีการดูดกลืนแสงของตัวอย่างและ veratraldehyde มาตรฐาน
กิจกรรมอ่านที่ 420 นาโนเมตร ติดตั้งให้ถูกหาโดยวิธีของ wariishi et al . ( 1992 ) ในปฏิกิริยา
ส่วนผสมที่มี 0.1 มิลลิลิตร และนำวัฒนธรรม 1.0 มิลลิลิตร mnso4
1 m , 10 กรัม โซเดียม 50 มม. มาโลเนทบัฟเฟอร์ pH 4.5 ) ในการแสดงตนของ 0.5 มล.
H2O2 0.1 มิลลิเมตร แมงกานีสแมงกานีสไอออนþ 3 แบบฟอร์มที่ซับซ้อนกับมาโลเนทซึ่งดูดซับ
ที่ 270 nm ( การ 11590 M 1 ซม. 1 ) ปริมาณของเอนไซม์ที่จำเป็นเพื่อให้หน่วย
เพิ่มการดูดกลืนแสงใน 1 นาที / ml ( ผสม หมายถึง หน่วยหนึ่งของ
กิจกรรม MNP .- ถูก assayed โดยการปรับเปลี่ยนเล็กน้อยของวิธีของชินและอี
( 2000 ) ต่อไปนี้การเกิดออกซิเดชันของ 2,20-azino-bis ( 3-ethyl-benzo-thiazoline-sulphonate )
( Abbr ) ที่ 420 nm ( 0 , 1 ) ( 1 ) 0.1 มิลลิลิตรเอนไซม์ผสมที่ประกอบด้วย
1 มิลลิลิตร และกรอง 0.3 มม. Abbr ใน 1 มิลลิลิตร 50 มิลลิโมลาร์โซเดียม มาโลเนทบัฟเฟอร์ .
1 หน่วย - กิจกรรม กำหนดปริมาณของเอนไซม์เป็นสาเหตุหนึ่งหน่วย
เพิ่มค่าต่อมิลลิลิตรต่อนาที ( ส่วนผสม
2.1 . ภาษีมูลค่าเพิ่มการย้อมสีสิ่งทอ
สี vat cibanon สีแดง 2b-md ( สาย 67 , 000 ) , cibanon สีเหลืองทอง pk-md ( สาย
5910 ) และ cibanon สีฟ้า gfj-md ( สาย 69825 ) จะได้รับฟรีของค่าใช้จ่ายโดย Ciba
ปากีสถาน ( จำกัด ) , Faisalabad . indanthrene ตรงสีดำนี้คือ procured จาก dyestar
ปากีสถาน ( จำกัด ) , Faisalabad .
2.2 . เชื้อราเน่าสีขาวและการเตรียม inocula
วัฒนธรรมของ slants Pleurotus ostreatus ibl-02 phanerochaete , chrysosporium
ibl-03 C ibl-04 , โรค , ibl-05 เห็ดหลินจือ และเห็ดแครง
ibl-06 ได้จากห้องปฏิบัติการเทคโนโลยีชีวภาพอุตสาหกรรม ภาควิชา
เคมีและชีวเคมี มหาวิทยาลัยเกษตร , Faisalabad . inocula ทั้งหมด
วัฒนธรรมเตรียมในป้าย 500 มล. ขวดบรรจุ 100 ml
เออร์เลนเมเยอร์เคิร์กแรกเริ่มสารอาหารปานกลาง ( เทียน และเคิร์ก , 1988 ) ที่เติมกลูโคส 1%
ขวดทำการปรับ pH 4.5 withmnaoh / M HCl โซลูชั่นและสังเคราะห์สำหรับ
ที่ 121 องศาเซลเซียส 15 นาที ( 1.11 kg ลิตร ) หลังจากเย็นอุณหภูมิห้อง ขวดที่ใส่อยู่
wrf สปอร์จากวัฒนธรรม ลาดที่เกี่ยวข้องและวางไว้ในโรตารี
เครื่องปั่น ( 120 รอบต่อนาทีที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 3 วัน เพื่อให้ได้
ระงับจากเนื้อเดียว1 108 สปอร์ / มล ) .
2.3 การเตรียมสื่อและแรกเริ่มของธาตุอาหารโซลูชั่น
ย้อมสี vat โซลูชั่นเตรียมในการแก้ไขเล็กน้อยเคิร์กแรกเริ่มสารอาหารปานกลาง ( เทียน และเคิร์ก
, 1988 ; asgher et al . , 2007 ) มันเป็นข้อสังเกตว่าสี vat และไม่ละลายในน้ำ
เคิร์ก ) ที่จะได้รับโซลูชั่นสีชัดเจน ด่างเคิร์ก
) เตรียมใน 0.01 M โซเดียมไฮดรอกไซด์ อย่างไรก็ตามpH ของ resultant
สีโซลูชั่นมีพื้นฐาน ( พีเอช 9 – 11 ) และปรับ pH ( pH สำหรับ wrf )
M HCl ที่เกิดกับชั้นเกลือที่สำคัญ ที่จะเอาชนะปัญหานี้ , pH 4.5 M
ปรับใช้เมทิลน้ำตาลแก้ การใช้กรดซัคซิเมทิลที่เกิดขึ้นเพียงเล็กน้อยเกลือหิน
.
2.4 . ขั้นตอนการคัดกรองการทดสอบ
4 ชุด ( 15 ขวดแต่ละ ) ของการทำสำเนาสามฉบับ flaks ที่มีอยู่ 0.01 % ของแต่ละสีไว้ในโซลูชั่น
เคิร์กเป็นด่างปานกลาง การ flasks ทั้งหมด
ถูกเก็บรักษาไว้ที่ pH 4.5 withmmethyl น้ำตาลฆ่าเชื้อ ( 121 องศาเซลเซียส 15 นาทีในหม้อฆ่าเชื้อ (
ซันโย ประเทศญี่ปุ่น และที่ใส่ 5 ml homogenous เดีย
ช่วงล่างของแต่ละ wrf สายพันธุ์ในเครื่องดูดควันทางชีวภาพ ( ดาลตันญี่ปุ่น )
หัวเชื้อขวดสั่นสะเทือน เป็นเวลา 10 วัน ที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสในเครื่องปั่นโคจร ( ซันโย ) gallenkamp
, UK ) ยกเว้นหน้า chrysosporium ที่บ่มที่อุณหภูมิ 37 ( asgher et al . ,
2007 ) ตัวอย่าง ถอนตัวจากการทำสำเนาสามฉบับขวดทุกครั้งหลังจาก 48 ชั่วโมงใช้เพื่อกำหนด
เปอร์เซ็นต์ย้อมสี . ที่สุดพลึงย้อมถูกเลือกสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพของกระบวนการ
.
2.5การเพิ่มประสิทธิภาพของพารามิเตอร์
ปรับปรุงประสิทธิภาพของการกำจัดโรค ibl-04 C สำหรับสูงสุด
พลึงย้อม cibanon gfj-md สีน้ำเงิน อุณหภูมิ ผลของการเปลี่ยนแปลง pH เพิ่ม
ของคาร์บอนและไนโตรเจนที่แตกต่างกันและสีที่มีความเข้มข้นเริ่มต้น
ถูกตรวจสอบ วิธีที่คลาสสิกสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพกระบวนการเป็นลูกบุญธรรม ในแต่ละ
การทดลองหนึ่งปัจจัยที่หลากหลายทั้งสามใบไว้ก่อนหน้านี้ที่ระดับคงที่ (
.
ดาวน์โหลด . ผลของพีเอชเริ่มต้นของอาหารที่มีโซลูชั่นการ
ทำสำเนาสามฉบับ 0.01% ย้อมถูกปรับ pH ( pH แตกต่างกัน
3 , 3.5 , 4 , 4.5 และ 5 ) การใช้เมทิลน้ำตาลฆ่าเชื้อเชื้อ C .
, โรคและสะเทือน ( 120 รอบต่อนาทีที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 วัน ( เวลาที่เหมาะสมในการตรวจเลือก
ศึกษา ) .
งานวาง . ผลของการบ่มที่อุณหภูมิ
ทำสำเนาสามฉบับการ flasks ปรับ pH 4.5 ( ที่เหมาะสม ) มีการประมวลผลที่แตกต่างกัน ได้แก่ อุณหภูมิการบ่ม
; 25 , 30 , 35 , 40 , 45 และ 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 วัน
2.5.3 . ผลของคาร์บอนเสริม
เพื่อเพิ่ม cibanon สีฟ้า gfj-md การกำจัดโรคโดย C .
โตส , มอลโตส , ตาล , ตาลและแป้ง ( 1% w / v ) ใช้เป็นคาร์บอนและพลังงาน
อาหารเสริมและอาหารถูกประมวลผลภายใต้พีเอชและอุณหภูมิอากาศ
เป็นเวลา 10 วัน ในต่อมาการทดลองผลของความเข้มข้นแตกต่างกัน
( 0.1 – 2 % w / v ) ที่สุดของคาร์บอนเพิ่ม ( แป้ง ) คือการตรวจสอบ .
2.5.4 . ผลของไนโตรเจน สารแอมโมเนียมไนเตรท
แอมโมเนียมซัลเฟต , แอมโมเนียมฟอสเฟต dihydrogen
extract , และยูเรีย ( 0.02 % w / v ) ที่ใช้ในการแสดงตนที่ 10 % แป้ง ( แหล่งคาร์บอนที่เหมาะสม
) และ flasks สั่นสะเทือนเป็นเวลา 3 วัน ( สูงสุดของการทดสอบก่อนหน้านี้ )
ภายใต้สภาวะที่เหมาะสมของ pH และอุณหภูมิ
สมบูรณ์ . ผลของความเข้มข้นเริ่มต้นของสีย้อม
คัดกรองและการเพิ่มประสิทธิภาพการทดลองใช้สารละลายสี 0.001 %
ศึกษาความอดทนของเชื้อรากับสี สีคือ
ดำเนินการกับค่าความเข้มข้นสารละลาย 0.01 - 0.02 % ) ของ cibanon สีฟ้า gfjmd .
2.5.6 . การดูดซับสีย้อม
เพื่อตรวจสอบการดูดซับสีเกิดขึ้นบนเส้นใยเชื้อรา , flasks
มีเพียงสี โซลูชั่น ( 0.001 – 0.02% ) ที่เตรียมไว้ในน้ำกลั่นและไม่มี
เคิร์กแรกเริ่มขนาดกลางหรือสารอาหารเพิ่ม . สีโซลูชั่น
ปรับพีเอชที่เหมาะสมสังเคราะห์ , ,บ่มเชื้อภายใต้สภาวะที่เหมาะสม
การกำจัดสีที่เกิดขึ้นในขวดเป็นย้อมเส้นใยเชื้อรา
ดูดซับบนเป็นไม่มีการเจริญเติบโตและเอนไซม์ การพัฒนาจะเกิดขึ้นในการขาดงานของการเจริญเติบโตปานกลาง
และสารอาหาร 2.6 การกำหนดสีและการกำหนดระดับของการ
วัดการดูดกลืนแสงคือการใช้ UV Spectrophotometer ( สหราชอาณาจักร / มองเห็นเครื่องมือ , PG ) Lmax สีย้อมนั้น
cibanon 2b-md cibanon สีแดง , สีเหลืองทอง pk-md cibanon
, สีฟ้าและสีดำ gfj-md indanthrene ตรงนี้ได้ค่า Lmax ของทั้งหมด 665 และ
522 , 580 นาโนเมตร โซลูชั่นสีเดิม ( 0.001 % ) เตรียมจัดเคิร์ก
สื่อที่ถูกใช้เป็นมาตรฐานนคุณค่าของตัวอย่างจากการได้รับการแก้ไขโดยการลบ
ขวดค่าสำหรับแต่ละช่องว่าง
( ด่าง เคิร์ก สื่อ ) แก้ไขค่าค่าเทียบกับมาตรฐานในการคำนวณเปอร์เซ็นต์สี
2.7 สี . . เอนไซม์
ศึกษา ligninases มีส่วนร่วมในกลไกการเนื้อหา
,ในการกำจัดจุลินทรีย์ในตอนท้ายของแต่ละเพิ่มประสิทธิภาพการทดลองกรองสารละลาย .
( เซลล์สารสกัดไฟฟ้าฟรี ) และการเก็บรวบรวมอย่างระมัดระวัง supernatants
วิเคราะห์การวิเคราะห์กิจกรรมของเอนไซม์ กิจกรรมของ lip
ถูกตรวจสอบโดยต่อปฏิกิริยาออกซิเดชันของแอลกอฮอล์ veratryl ( 4 มม. ) ที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสใน veratraldehyde
02 มิลลิเมตรโซเดียมอะซิเตตบัฟเฟอร์ pH 3 ) ในการแสดงตนของ
0.1 มม. ( และ H2O2 เตียน เคิร์ก , 1988 ) เปล่ามีอยู่ 100 มล. น้ำกลั่นแทน
เอนไซม์ส่วนที่หารลงตัว มีการดูดกลืนแสงของตัวอย่างและ veratraldehyde มาตรฐาน
กิจกรรมอ่านที่ 420 นาโนเมตร ติดตั้งให้ถูกหาโดยวิธีของ wariishi et al . ( 1992 ) ในปฏิกิริยา
ส่วนผสมที่มี 0.1 มิลลิลิตร และนำวัฒนธรรม 1.0 มิลลิลิตร mnso4
1 m , 10 กรัม โซเดียม 50 มม. มาโลเนทบัฟเฟอร์ pH 4.5 ) ในการแสดงตนของ 0.5 มล.
H2O2 0.1 มิลลิเมตร แมงกานีสแมงกานีสไอออนþ 3 แบบฟอร์มที่ซับซ้อนกับมาโลเนทซึ่งดูดซับ
ที่ 270 nm ( การ 11590 M 1 ซม. 1 ) ปริมาณของเอนไซม์ที่จำเป็นเพื่อให้หน่วย
เพิ่มการดูดกลืนแสงใน 1 นาที / ml ( ผสม หมายถึง หน่วยหนึ่งของ
กิจกรรม MNP .- ถูก assayed โดยการปรับเปลี่ยนเล็กน้อยของวิธีของชินและอี
( 2000 ) ต่อไปนี้การเกิดออกซิเดชันของ 2,20-azino-bis ( 3-ethyl-benzo-thiazoline-sulphonate )
( Abbr ) ที่ 420 nm ( 0 , 1 ) ( 1 ) 0.1 มิลลิลิตรเอนไซม์ผสมที่ประกอบด้วย
1 มิลลิลิตร และกรอง 0.3 มม. Abbr ใน 1 มิลลิลิตร 50 มิลลิโมลาร์โซเดียม มาโลเนทบัฟเฟอร์ .
1 หน่วย - กิจกรรม กำหนดปริมาณของเอนไซม์เป็นสาเหตุหนึ่งหน่วย
เพิ่มค่าต่อมิลลิลิตรต่อนาที ( ส่วนผสม
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- Hi :)I found your profile here, I wanted
- 今天快递公司把书送来的时候
- ซึ่งจากการศึกษาทางด้านศักยภาพของแหล่งท่อ
- a well-placed government source confirme
- หุ่นดี
- I'm just arrived home, my sister.
- even today Tetris comes with many phones
- 论据，是用来证实论点的根据，在逻辑学上，它是用来确定论题的真实性的那些判断。
- Buy some paper clips please
- ทุกคนเป็นคนน่ารัก
- alone
- The L. acidophilus La5 is one of the mos
- Well sometimes I go out by myself
- Curated by Emma Lavigne, Director of the
- Umm… my hands were touching that dirty g
- living thvings
- Hi :)I found your profile here, I wanted
- มุ่งหน้าทำต่อไปให้ดีที่สุด
- ฉันกลับมานั่งสังเกตทุกคนในชีวิตของฉัน ไม
- procedures
- Umm… my hands were touching that dirty g
- communities appear
- ฉันต้องการอิสระในการทำอะไรบ้าง ได้โปรดปล
- I never lose in my mind
