Discussion
In this study we have shown that the different standard sperm preparation techniques used in the routine assisted reproduction techniques laboratory vary in their ability to separate spermatozoa possessing nuclear anomalies from those which are normal. Sperm preparation using the swim-up technique does not appear to be as efficient at isolating a population of spermatozoa with a low percentage of nuclear anomalies. This is in contrast to previous reports (Angelopoulos et al., 1998; Spano et al., 1999) where post-rise spermatozoa prepared using the swim-up technique represented a subpopulation characterized by a general increase of the green head sperm percentage when using acridine orange. Spano and co-workers (Spano et al., 1999) also reported that this subpopulation exhibited improved chromatin structure properties as assessed using the sperm chromatin structure assay (SCSA). The SCSA utilizes the metachromatic properties of acridine orange to distinguish between low-pH or heat-denatured (red fluorescence = single-stranded) and native (green fluorescence = double stranded) DNA in sperm chromatin. We have found however, using the CMA3 fluorochrome, that although the swim-up technique is adequate for the isolation of a highly motile sperm population, overall sperm quality may be compromised, with a similar percentage of CMA3 positive spermatozoa found in the swim-up to those found in the sediment. Interestingly, Colleu and co-workers (Colleu et al., 1996) found that Percoll® gradients appeared to enrich for spermatozoa with less intermediate proteins, and more mature nucleoproteins of the protamine 2 family, a feature not observed with the swim-up spermatozoa. In contrast, Larson et al. (1999) reported that glass wool filtration produced sperm suspensions with improved chromatin integrity (Larson et al., 1999), as measured with the SCSA, compared to density gradient centrifugation using Enhance-S plus™ (Conception Technologies, San Diego, CA, USA). To clarify the differences between the results observed using acridine orange and CMA3 a direct comparison of the two stains using the different preparation techniques is needed.
When examining the ability of Percoll® to isolate spermatozoa of normal chromatin structure both Angelopoulos et al. (1998) and Golan et al. (1997) again found that the percentage of green fluorescent spermatozoa improved in the 90% fraction (Golan et al., 1997; Angelopoulos et al., 1998). In the current study, sperm preparation using density centrifugation techniques with either the now largely obsolete Percoll® or one of its licensed replacements, PureSperm®, is able to reduce significantly the percentage of spermatozoa with nuclear abnormalities. We have assessed two forms of nuclear anomalies: firstly, using CMA3 we have shown that spermatozoa with a more compacted chromatin are more likely to be present in the 90% fraction. We have previously reported that CMA3 can be used to distinguish populations of spermatozoa with differing levels of protamination (Bizzaro et al., 1998) and that there is a strong relationship between CMA3 accessibility and the presence of endogenous DNA nicks in human spermatozoa (Manicardi et al., 1995). Our current findings with both Percoll® and PureSperm® therefore substantiate the work of Colleu (Colleu et al., 1996). More importantly, both Percoll® and PureSperm® significantly reduced the percentage of spermatozoa with nuclear DNA damage. This was clearly evident in the majority of patients who had high levels of DNA damage.
The patients who exhibit high levels of CMA3 positivity and nuclear DNA damage are likely to have poor semen parameters (Manicardi et al., 1995; Bianchi et al., 1996a,b; Sun et al., 1997; Esterhuizen et al., 2000). This brings to light the question of what the benefits are of isolating a fraction of spermatozoa with lower levels of nuclear anomalies A number of studies now clearly indicate that an abnormal sperm nucleus may have a detrimental effect on fertilization, embryo development and pregnancy outcome. We have previously shown that spermatozoa from men with high levels of DNA damaged spermatozoa are more likely to exhibit anomalies in sperm decondensation after ICSI (Sakkas et al., 1996). In addition, Lopes et al. (1998) showed that DNA damage in spermatozoa may contribute to fertilization failure after ICSI. More importantly, the group of Robaire has shown that damage to rat sperm DNA may be linked to an increase in early embryo death (Qiu et al., 1995a,b). Recently, Evenson showed that the SCSA could be used as a prognostic factor for human fertility (Evenson et al., 1999), stating that men who have an SCSA value of greater than 30% would have difficulties in achieving pregnancy. Clearly, isolating spermatozoa of a better nuclear consistency will increase the likelihood of achieving pregnancies with normal embryos.
Sperm preparation for assisted reproduction should aim to minimize the risk of abnormal spermatozoa
อภิปรายIn this study we have shown that the different standard sperm preparation techniques used in the routine assisted reproduction techniques laboratory vary in their ability to separate spermatozoa possessing nuclear anomalies from those which are normal. Sperm preparation using the swim-up technique does not appear to be as efficient at isolating a population of spermatozoa with a low percentage of nuclear anomalies. This is in contrast to previous reports (Angelopoulos et al., 1998; Spano et al., 1999) where post-rise spermatozoa prepared using the swim-up technique represented a subpopulation characterized by a general increase of the green head sperm percentage when using acridine orange. Spano and co-workers (Spano et al., 1999) also reported that this subpopulation exhibited improved chromatin structure properties as assessed using the sperm chromatin structure assay (SCSA). The SCSA utilizes the metachromatic properties of acridine orange to distinguish between low-pH or heat-denatured (red fluorescence = single-stranded) and native (green fluorescence = double stranded) DNA in sperm chromatin. We have found however, using the CMA3 fluorochrome, that although the swim-up technique is adequate for the isolation of a highly motile sperm population, overall sperm quality may be compromised, with a similar percentage of CMA3 positive spermatozoa found in the swim-up to those found in the sediment. Interestingly, Colleu and co-workers (Colleu et al., 1996) found that Percoll® gradients appeared to enrich for spermatozoa with less intermediate proteins, and more mature nucleoproteins of the protamine 2 family, a feature not observed with the swim-up spermatozoa. In contrast, Larson et al. (1999) reported that glass wool filtration produced sperm suspensions with improved chromatin integrity (Larson et al., 1999), as measured with the SCSA, compared to density gradient centrifugation using Enhance-S plus™ (Conception Technologies, San Diego, CA, USA). To clarify the differences between the results observed using acridine orange and CMA3 a direct comparison of the two stains using the different preparation techniques is needed.เมื่อตรวจสอบความสามารถของ Percoll® จะแยก โครงสร้างตัวอสุจิปกติรมาทั้ง Angelopoulos et al. (1998) และ Golan et al. (1997) อีกครั้งพบว่าเปอร์เซ็นต์ของสีเขียวเรืองแสงตัวอสุจิดีขึ้นเศษส่วน 90% (Golan et al. 1997 Angelopoulos et al. 1998) ในการศึกษาปัจจุบัน การเตรียมอสุจิโดยใช้เทคนิคการหมุนเหวี่ยงความหนาแน่น Percoll® ตอนนี้ล้าสมัยมากขึ้นหรือแทนที่ได้รับใบอนุญาต PureSperm® อย่างใดอย่างหนึ่งคือสามารถลดเปอร์เซ็นต์ของตัวอสุจิด้วยนิวเคลียร์ความผิดปกติอย่างมีนัยสำคัญ เรามีประเมิน 2 รูปแบบของความผิดปกตินิวเคลียร์: แรก ใช้ CMA3 เราได้แสดงให้เห็นว่า ตัวอสุจิกับโครมาตินที่กระชับมากขึ้นมีแนวโน้มจะอยู่ในสัดส่วน 90% เราก่อนหน้านี้มีรายงานว่า สามารถใช้ CMA3 เพื่อแยกประชากรตัวที่มีระดับแตกต่างกัน protamination (Bizzaro et al. 1998) และมีความสัมพันธ์ที่ดีระหว่าง CMA3 การเข้าถึงและการปรากฏตัวของดีเอ็นเอคมภายนอกในตัวอสุจิมนุษย์ (Manicardi et al. 1995) ผลการวิจัยของเราปัจจุบันทั้ง Percoll® และ PureSperm® ดังนั้นยืนยันการทำงานของ Colleu (Colleu et al. 1996) สำคัญ Percoll® และ PureSperm® อย่างมีนัยสำคัญลดเปอร์เซ็นต์ของตัวอสุจิมีความเสียหายของดีเอ็นเอนิวเคลียร์ นี้คือแสดงออกอย่างในส่วนของผู้ป่วยที่มีความเสียหายของดีเอ็นเอในระดับสูงผู้ป่วยที่แสดงระดับสูงของ CMA3 บวกและความเสียหายของดีเอ็นเอนิวเคลียร์ มักจะมีน้ำเชื้อดีพารามิเตอร์ (Manicardi et al. 1995 เบียนชี et al. 1996a, b Sun et al. 1997 Esterhuizen et al. 2000) นี้เพื่อนำแสงคำถามของสิ่งที่ประโยชน์ในการแยกเศษส่วนตัว ด้วยการลดระดับของความผิดปกตินิวเคลียร์ A จำนวนของการศึกษาขณะนี้ ชัดเจนว่า มีนิวเคลียสของอสุจิผิดปกติอาจมีผลปฏิสนธิ การพัฒนาตัวอ่อน และผลการตั้งครรภ์เป็นอันตราย ก่อนหน้านี้เราได้แสดงว่า ตัวอสุจิจากผู้ชายมีระดับสูงตัวดีเอ็นเอที่เสียหายมีแนวโน้มที่จะแสดงความผิดปกติในสเปิร์ม decondensation หลังอำนวย (Sakkas et al. 1996) นอกจากนี้ เปส et al. (1998) พบว่า ความเสียหายของดีเอ็นเอในตัวอสุจิอาจนำไปสู่ความล้มเหลวในการปฏิสนธิหลังอำนวย สำคัญ กลุ่มของ Robaire ได้แสดงความเสียหายที่หนูสเปิร์มดีเอ็นเออาจจะเชื่อมโยงกับการเพิ่มขึ้นของตัวอ่อนเสียชีวิต (คู et al. 1995a, b) เมื่อเร็ว ๆ นี้ Evenson พบว่า SCSA ที่อาจใช้เป็นตัวคูณ prognostic มนุษย์โพรง (Evenson et al. 1999), ระบุว่า ผู้ชายที่มีค่า SCSA มากกว่า 30% จะมีความยากลำบากในการบรรลุการตั้งครรภ์ อย่างชัดเจน แยกตัวอสุจิของความสอดคล้องนิวเคลียร์ดีกว่าจะเพิ่มโอกาสของการตั้งครรภ์ที่ตัวอ่อนที่ปกติบรรลุเตรียมอสุจิปฏิสนธิควรมุ่งมั่นที่จะลดความเสี่ยงของตัวอสุจิที่ผิดปกติ
การแปล กรุณารอสักครู่..

การอภิปราย
ในการศึกษานี้เราได้แสดงให้เห็นว่าเทคนิคการจัดทำมาตรฐานสเปิร์มที่แตกต่างกันที่ใช้ในชีวิตประจำช่วยห้องปฏิบัติการเทคนิคการทำสำเนาแตกต่างกันไปในความสามารถของพวกเขาที่จะแยกตัวอสุจิที่มีความผิดปกติจากนิวเคลียร์เหล่านั้นซึ่งเป็นเรื่องปกติ การเตรียมความพร้อมของตัวอสุจิโดยใช้เทคนิคการว่ายน้ำไม่ได้ดูเหมือนจะมีประสิทธิภาพในการแยกประชากรของสเปิร์มที่มีเปอร์เซ็นต์ต่ำของความผิดปกตินิวเคลียร์ นี้เป็นในทางตรงกันข้ามกับรายงานก่อนหน้านี้ (Angelopoulos et al, 1998;. สปาโน et al, 1999.) ที่โพสต์ขึ้นอสุจิที่เตรียมไว้โดยใช้เทคนิคการว่ายน้ำเป็นตัวแทน subpopulation ที่โดดเด่นด้วยการเพิ่มขึ้นทั่วไปของเปอร์เซ็นต์อสุจิหัวสีเขียวเมื่อใช้ สีส้ม acridine สปาโนและเพื่อนร่วมงาน (สปาโน et al., 1999) นอกจากนี้ยังมีรายงานว่า subpopulation นี้แสดงการปรับปรุงคุณสมบัติโครงสร้างโครมาติที่ประเมินโดยใช้การทดสอบโครงสร้างสเปิร์มโครมาติ (SCSA) SCSA ใช้คุณสมบัติ Metachromatic ส้ม acridine ที่จะแยกแยะระหว่างต่ำค่า pH หรือความร้อนเอทิลแอลกอฮอล์ (เรืองแสงสีแดง = เดียวควั่น) (เรืองแสงสีเขียว = คู่ควั่น) และพื้นเมืองดีเอ็นเอในโครมาติสเปิร์ม เราพบอย่างไรก็ตามการใช้สารเรืองแสง CMA3 ว่าแม้เทคนิคการว่ายน้ำเพียงพอสำหรับการแยกประชากรอสุจิเคลื่อนที่สูงที่มีคุณภาพสเปิร์มโดยรวมอาจถูกละเมิดมีเปอร์เซ็นต์ที่คล้ายกันของ CMA3 อสุจิในเชิงบวกที่พบในสระว่ายน้ำ กับที่พบในตะกอน ที่น่าสนใจ Colleu และเพื่อนร่วมงาน (Colleu et al., 1996) พบว่าการไล่ระดับสีPercoll®ปรากฏเพื่อเพิ่มสำหรับตัวอสุจิกับโปรตีนกลางน้อยลงและเป็นผู้ใหญ่มากขึ้น nucleoproteins ของ protamine 2 ครอบครัวคุณลักษณะที่ไม่ได้สังเกตกับตัวอสุจิว่ายน้ำ . ในทางตรงกันข้าม Larson, et al (1999) รายงานว่าการกรองใยแก้วผลิตสารแขวนลอยสเปิร์มด้วยความซื่อสัตย์สุจริตโครมาติที่ดีขึ้น (Larson et al., 1999) เป็นวัดที่มี SCSA เมื่อเทียบกับความหนาแน่นของการไล่ระดับสีหมุนเหวี่ยงใช้เพิ่ม-S บวก™ (Conception Technologies, ซานดิเอโก, สหรัฐอเมริกา). เพื่อชี้แจงความแตกต่างระหว่างผลที่สังเกตโดยใช้สีส้มและ acridine CMA3 การเปรียบเทียบโดยตรงของทั้งสองคราบโดยใช้เทคนิคการเตรียมความพร้อมที่แตกต่างกันเป็นสิ่งจำเป็น.
เมื่อตรวจสอบความสามารถของPercoll®เพื่อแยกตัวอสุจิของโครงสร้างโครมาปกติทั้ง Angelopoulos et al, (1998) และโกลาน, et al (1997) อีกครั้งพบว่าร้อยละของตัวอสุจิสีเขียวเรืองการปรับปรุงในส่วน 90% (Golan, et al, 1997;.. Angelopoulos, et al, 1998) ในการศึกษาในปัจจุบันการเตรียมอสุจิโดยใช้เทคนิคความหนาแน่นของการหมุนเหวี่ยงกับทั้งขณะนี้ล้าสมัยส่วนใหญ่Percoll®หรือหนึ่งของการเปลี่ยนใบอนุญาตของPureSperm®คือสามารถที่จะลดอย่างมีนัยสำคัญร้อยละของสเปิร์มที่มีความผิดปกติของนิวเคลียร์ เราได้รับการประเมินสองรูปแบบของความผิดปกตินิวเคลียร์: ประการแรกใช้ CMA3 เราได้แสดงตัวอสุจิที่มีโครมาบดอัดมากขึ้นมีแนวโน้มที่จะนำเสนอในส่วน 90% เราได้มีการรายงานก่อนหน้านี้ว่า CMA3 สามารถใช้ในการแยกแยะความแตกต่างของประชากรสเปิร์มที่มีระดับที่แตกต่างกันของ protamination (bizzaro et al., 1998) และมีความสัมพันธ์ที่แข็งแกร่งระหว่าง CMA3 การเข้าถึงและการปรากฏตัวของชื่อเล่นดีเอ็นเอภายนอกในสเปิร์มของมนุษย์ (Manicardi et al., 1995) ผลการวิจัยของเราในปัจจุบันมีทั้งPercoll®และPureSperm®จึงยืนยันการทำงานของ Colleu นี้ (Colleu et al., 1996) ที่สำคัญมากขึ้นทั้งPercoll®และPureSperm®อย่างมีนัยสำคัญลดลงร้อยละของสเปิร์มที่มีการเสียหายของดีเอ็นเอนิวเคลียร์ . นี้ชัดเจนในส่วนของผู้ป่วยที่มีระดับสูงของความเสียหายของดีเอ็นเอ
ผู้ป่วยที่แสดงระดับสูงของ positivity CMA3 และความเสียหายของดีเอ็นเอนิวเคลียร์มีแนวโน้มที่จะมีพารามิเตอร์ที่น้ำอสุจิยากจน (Manicardi, et al, 1995;.. Bianchi, et al, 1996a, B; Sun, et al, 1997;.. Esterhuizen, et al, 2000) นี้นำมาสู่แสงคำถามของสิ่งที่เป็นประโยชน์ในการแยกส่วนของสเปิร์มที่มีระดับต่ำของนิวเคลียร์ผิดปกติจากการศึกษาในขณะนี้อย่างชัดเจนระบุว่านิวเคลียสของสเปิร์มที่ผิดปกติอาจจะมีผลกระทบต่อการปฏิสนธิการพัฒนาตัวอ่อนและผลการตั้งครรภ์ เราได้แสดงให้เห็นก่อนหน้านี้ว่าสเปิร์มจากผู้ชายที่มีระดับสูงของดีเอ็นเอเสียหายอสุจิมีแนวโน้มที่จะแสดงความผิดปกติใน decondensation อสุจิหลังจาก ICSI (Sakkas et al., 1996) นอกจากนี้โลเปส, et al (1998) แสดงให้เห็นว่าการเสียหายของดีเอ็นเอในอสุจิอาจนำไปสู่ความล้มเหลวในการปฏิสนธิหลังจาก ICSI ที่สำคัญกว่ากลุ่ม Robaire ได้แสดงให้เห็นความเสียหายให้กับดีเอ็นเอหนูอสุจิอาจเชื่อมโยงกับการเพิ่มขึ้นของการตายของตัวอ่อนในช่วงต้น (Qiu et al., 1995a, B) เมื่อเร็ว ๆ นี้ Evenson แสดงให้เห็นว่า SCSA สามารถนำมาใช้เป็นปัจจัยการพยากรณ์โรคสำหรับความอุดมสมบูรณ์ของมนุษย์ (Evenson et al., 1999) ที่ระบุว่าผู้ชายที่มีค่า SCSA มากกว่า 30% จะมีความยากลำบากในการบรรลุการตั้งครรภ์ เห็นได้ชัดว่าการแยกตัวอสุจิของความสอดคล้องนิวเคลียร์ดีกว่าจะเพิ่มโอกาสในการบรรลุการตั้งครรภ์ที่มีตัวอ่อนปกติ.
เตรียมอสุจิสำหรับช่วยการเจริญพันธุ์ควรมุ่งที่จะลดความเสี่ยงของตัวอสุจิผิดปกติ
การแปล กรุณารอสักครู่..
