Micronemalproteins arenormally cont

Micronemalproteins arenormally contained withinsecretory organelles that are concentrated at the apical end of the parasite and poised for release upon contact with the host cell. We have reported previously that microneme secretion is calcium dependent and can be triggered by calcium ionophores even in the absence of host cells (Carruthers and Sibley, 1999). Chelation of intracellular calcium effectively inhibits microneme release, and we show here that this treatment also inhibits parasite invasion of host cells. This effect was speci®c to depletion of intracellular calcium, and both secretion and invasion were partially restored by adding back calcium in the presence of calcium ionophore A23187. These results imply that a calcium-regulated pathway controls the release of micronemesduringengagementwiththehostcell,although the natural triggers responsible for this event remain uncharacterized. Our studies have also suggested a role for parasitederived protein kinase activity in microneme secretion and invasion by Toxoplasma. Previous studies have also suggested that Plasmodium invasion of red cells is controlled by a staurosporine-sensitive kinase, which showed an IC50 of 250nm (Ward et al., 1994). Staurosporine is a general inhibitor of serine/threonine and, at higher concentrations, tyrosine protein kinases (Tamaoki, 1991). Despite its broad speci®city, the observation that staurosporine produced an identical IC50 (20nM) for Toxoplasma cell invasion and microneme secretion argues that its effect on invasion was a consequence of inhibiting microneme secretion rather than a secondary effect. Additionally, our previous observation that the kinase inhibitor KT5926 also inhibits Toxoplasma invasion and microneme secretion further supports a role for a protein kinase(s) in these processes. Serine/threonine protein kinases are not known to play a key role in controlling intracellular calcium, and we have observed that treatment with A23187 plus high levels of extracellular calcium does not reverse the inhibitory effect of staurosporine (V. B. Carruthers and L. D. Sibley, unpublished). Collectively, these results indicate that the staurosporine block is downstream of the calcium step in a signal transduction pathway that triggers microneme secretion. One possibility is that staurosporine inhibits a protein kinase necessary for microneme docking or fusion with the parasite's apical membrane; however, further studies will be necessary to test this hypothesis. Although the surface antigen SAG1 has been implicated in host cell binding (Kasper and Mineo, 1994), the uniform distribution of SAG1 on the parasite surface is inconsistent with a role in speci®c apical invasion. In contrast, the rapid deployment of MIC2 onto the apical end of the parasite during initial invasion places it in position to mediate directional attachment to the host cell. While most of our experimental assays do not directly distinguish between
parasite attachment or penetration, the marked decrease in cell-associated parasites after treatments that disrupt microneme secretion suggests that microneme proteins are required for parasite attachment. After its secretion at the apical end, where the parasite ®rst makes contact with the host cell, MIC2 was progressively capped towards the posterior end of the parasite before being released. This striking posterior relocalization during penetration suggests that MIC2 may also participate in parasite penetration into host cells. MIC2 contains a transmembrane domain and a short cytoplasmic sequence (Wan et al., 1996). The posterior translocation of MIC2 is sensitive to cytochalasin D (Carruthers and Sibley, 1999) and is therefore likely to involve interactions with the parasite's actinomyosin motor. The release of MIC2 at the completion of invasion may occur by proteolytic processing, as we have shown previously that MIC2 is released from extracellular parasites as a truncated form that lacks the C-terminal domain (Wan et al., 1996). A number of recent studies highlight an important role for micronemal proteins in invasion of host cells by apicomplexan parasites. For example, most of the adhesins characterized to date in the related parasite Plasmodium are micronemal proteins, including the Duffy-binding protein of P. knowlesi, the circumsporozoite protein and thrombospondin-related adhesive protein in P. falciparum (Robson et al., 1988; Adams et al., 1990; Aikawa et al., 1990). In Toxoplasma, the microneme proteins MIC1 and MIC3 have been implicated in cell binding: MIC1 contains two degenerate TSP domains and binds to host cells, and MIC3 contains EGF domains that are common in cell adhesion proteins (Fourmaux et al., 1996a). The Toxoplasma protein MIC2 also contains several domains that are potential ligands for host cells, including an integrinlike I domain and a series of six TSP1-like repeats. In support of such a role, we have shown that puri®ed recombinant MIC2 I domain ef®ciently binds in vitro to laminin and, to a lesser extent, to collagens I and IV (V. B. Carruthers and L. D. Sibley, in preparation). Furthermore, we found that recombinant versions of the MIC2 I domain and M domain bound to immobilized heparin. Chondroitin sulphate A and C and dextran sulphate competed for heparin binding, suggesting that MIC2 recognizes a variety of glycosaminoglycans. Thus, MIC2 and/or other micronemal proteins may constitute the recently described heparin-binding molecules that were detected in the apical end of Toxoplasma parasites and were implicated in binding to host cell heparin sulphate proteoglycans (OrtegaBarria and Boothroyd, 1999). We investigated the ability of MIC proteins to bind to HFF cells using semi-puri®ed preparations of microneme proteins isolated either from puri®ed micronemes or after their discharge into the medium by exocytosis. MIC2 bound speci®cally to HFF cells, although this activity was

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Micronemalproteins arenormally ประกอบด้วย organelles withinsecretory ที่เข้มข้นที่สุดปลายยอดของปรสิต และเตรียมพร้อมสำหรับนำออกใช้เมื่อติดต่อกับเซลล์โฮสต์ เรามีรายงานก่อนหน้านี้ว่า microneme หลั่งแคลเซียมอิสระ และสามารถถูกทริกเกอร์ โดยแคลเซียม ionophores แม้ในกรณีเซลล์โฮสต์ (Carruthers และ Sibley, 1999) Chelation intracellular แคลเซียมได้อย่างมีประสิทธิภาพยับยั้งรุ่น microneme และเราแสดงที่นี่ที่นี้รักษายังยับยั้งปรสิตการบุกรุกของเซลล์โฮสต์ นี้คือ speci ® c ถึงการลดลงของ แคลเซียม intracellular ทั้งหลั่ง และบุกรุกบางส่วนคืนค่า ด้วยการเพิ่มแคลเซียมหลังในต่อหน้าของแคลเซียม ionophore A23187 ผลลัพธ์เหล่านี้เป็นสิทธิ์แบบว่า ทางเดินที่ควบคุมแคลเซียมควบคุมการปล่อยของ micronemesduringengagementwiththehostcell แม้ว่าทริกเกอร์ธรรมชาติชอบเหตุการณ์นี้อยู่ uncharacterized การศึกษาของเรายังได้แนะนำบทบาท parasitederived โปรตีน kinase กิจกรรมหลั่ง microneme และบุกรุก โดย Toxoplasma การศึกษาก่อนหน้านี้ได้ยังแนะนำว่า เดียมบุกรุกเซลล์สีแดงจะถูกควบคุม โดย kinase staurosporine ลับ ซึ่งแสดงให้เห็น IC50 250nm (Ward et al., 1994) Staurosporine เป็นสารยับยั้งทั่วไปแถ/ทรีโอนีน และ ที่ความเข้ม ข้นสูง kinases โปรตีน tyrosine (Tamaoki, 1991) แม้ speci ความกว้าง ® เมือง สังเกต staurosporine ที่ผลิต IC50 เหมือน (20nM) สำหรับ Toxoplasma หลั่งบุกรุกและ microneme เซลล์จนว่า ผลของการบุกรุกถูกเวร inhibiting หลั่ง microneme แทนที่เป็นผลต่อรอง นอกจากนี้ เราสังเกตก่อนหน้านี้ว่า ผล kinase KT5926 ยังยับยั้ง Toxoplasma บุกรุกและ microneme หลั่งเพิ่มเติมสนับสนุนบทบาทสำหรับ kinase(s) โปรตีนในกระบวนการเหล่านี้ แถ/ทรีโอนีนโปรตีน kinases ไม่ทราบว่ามีบทบาทสำคัญในการควบคุมแคลเซียม intracellular และเราได้สังเกตว่า รักษาพร้อม A23187 ระดับสูงของแคลเซียม extracellular กลับผลลิปกลอสไขของ staurosporine (V. B. Carruthers และ L. Sibley D. ยกเลิกประกาศ) โดยรวม ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า บล็อก staurosporine ปลายน้ำของขั้นตอนแคลเซียมในทางเดิน transduction สัญญาณที่ทริกเกอร์การหลั่ง microneme ความเป็นไปได้ที่หนึ่งเป็น staurosporine ที่ยับยั้ง kinase โปรตีนจำเป็นสำหรับ microneme เทียบหรือผสมผสานกับของเชื้อมาลาเรียเยื่อปลายยอด อย่างไรก็ตาม เพิ่มเติมการศึกษาจะได้จำเป็นต้องทดสอบสมมติฐานนี้ แม้ว่าการตรวจหาผิว SAG1 มีการเกี่ยวข้องในการผูก (Kasper และ Mineo, 1994) เซลล์โฮสต์ SAG1 กระจายสม่ำเสมอบนพื้นผิวของปรสิตไม่สอดคล้องกับบทบาทใน speci ® บุกรุกปลายยอด c ในทางตรงกันข้าม MIC2 ไปสิ้นสุดที่ปลายยอดของเชื้อมาลาเรียใช้อย่างรวดเร็วในระหว่างการรุกรานเริ่มต้นวางไว้ในตำแหน่งทิศทางที่แนบมากับเซลล์โฮสต์บรรเทา ในขณะที่ส่วนใหญ่ของเรา assays ทดลองไม่ตรงแยกระหว่างparasite attachment or penetration, the marked decrease in cell-associated parasites after treatments that disrupt microneme secretion suggests that microneme proteins are required for parasite attachment. After its secretion at the apical end, where the parasite ®rst makes contact with the host cell, MIC2 was progressively capped towards the posterior end of the parasite before being released. This striking posterior relocalization during penetration suggests that MIC2 may also participate in parasite penetration into host cells. MIC2 contains a transmembrane domain and a short cytoplasmic sequence (Wan et al., 1996). The posterior translocation of MIC2 is sensitive to cytochalasin D (Carruthers and Sibley, 1999) and is therefore likely to involve interactions with the parasite's actinomyosin motor. The release of MIC2 at the completion of invasion may occur by proteolytic processing, as we have shown previously that MIC2 is released from extracellular parasites as a truncated form that lacks the C-terminal domain (Wan et al., 1996). A number of recent studies highlight an important role for micronemal proteins in invasion of host cells by apicomplexan parasites. For example, most of the adhesins characterized to date in the related parasite Plasmodium are micronemal proteins, including the Duffy-binding protein of P. knowlesi, the circumsporozoite protein and thrombospondin-related adhesive protein in P. falciparum (Robson et al., 1988; Adams et al., 1990; Aikawa et al., 1990). In Toxoplasma, the microneme proteins MIC1 and MIC3 have been implicated in cell binding: MIC1 contains two degenerate TSP domains and binds to host cells, and MIC3 contains EGF domains that are common in cell adhesion proteins (Fourmaux et al., 1996a). The Toxoplasma protein MIC2 also contains several domains that are potential ligands for host cells, including an integrinlike I domain and a series of six TSP1-like repeats. In support of such a role, we have shown that puri®ed recombinant MIC2 I domain ef®ciently binds in vitro to laminin and, to a lesser extent, to collagens I and IV (V. B. Carruthers and L. D. Sibley, in preparation). Furthermore, we found that recombinant versions of the MIC2 I domain and M domain bound to immobilized heparin. Chondroitin sulphate A and C and dextran sulphate competed for heparin binding, suggesting that MIC2 recognizes a variety of glycosaminoglycans. Thus, MIC2 and/or other micronemal proteins may constitute the recently described heparin-binding molecules that were detected in the apical end of Toxoplasma parasites and were implicated in binding to host cell heparin sulphate proteoglycans (OrtegaBarria and Boothroyd, 1999). We investigated the ability of MIC proteins to bind to HFF cells using semi-puri®ed preparations of microneme proteins isolated either from puri®ed micronemes or after their discharge into the medium by exocytosis. MIC2 bound speci®cally to HFF cells, although this activity was

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Micronemalproteins มี arenormally withinsecretory อวัยวะที่มีความเข้มข้นที่ปลายยอดของปรสิตและทรงตัวสำหรับการเปิดตัวเมื่อสัมผัสกับเซลล์โฮสต์ เราได้มีการรายงานก่อนหน้านี้ว่าการหลั่ง microneme เป็นแคลเซียมขึ้นและสามารถเรียกโดย ionophores แคลเซียมแม้กระทั่งในกรณีที่ไม่มีของเซลล์โฮสต์ (คาร์รูเธอและ Sibley, 1999) ขับแคลเซียมภายในเซลล์ได้อย่างมีประสิทธิภาพยับยั้งการปล่อย microneme และเราแสดงให้เห็นว่าการรักษาที่นี่นอกจากนี้ยังช่วยยับยั้งการบุกรุกปรสิตเซลล์โฮสต์ ผลกระทบนี้เป็นspeci®cการสูญเสียแคลเซียมภายในเซลล์และทั้งสองหลั่งและการรุกรานถูกเรียกคืนบางส่วนจากการบวกกลับแคลเซียมในการปรากฏตัวของแคลเซียม ionophore A23187 ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งบอกว่าการควบคุมทางเดินแคลเซียมควบคุมการเปิดตัวของ micronemesduringengagementwiththehostcell แม้ว่าธรรมชาติก่อให้เกิดความรับผิดชอบในการจัดงานครั้งนี้ยังคงอยู่ uncharacterized การศึกษาของเราได้ชี้ให้เห็นบทบาทสำหรับกิจกรรมโปรตีนไคเนส parasitederived ในการหลั่ง microneme และการรุกรานโดย Toxoplasma ศึกษาก่อนหน้านี้ยังชี้ให้เห็นว่าการบุกรุก Plasmodium ของเซลล์เม็ดเลือดแดงถูกควบคุมโดยไคเนส staurosporine ที่สำคัญที่แสดงให้เห็นว่า IC50 ของ 250nm (วอร์ด et al., 1994) staurosporine เป็นยับยั้งทั่วไปของซีรีน ธ รีโอนี / และที่ความเข้มข้นสูงกว่าโปรตีนไคเนสซายน์ (ทามาโอกิ, 1991) แม้จะมีspeci®cityในวงกว้างของการสังเกตว่า staurosporine ผลิต IC50 เหมือนกัน (20nm) สำหรับการบุกรุกเซลล์ Toxoplasma และหลั่ง microneme ระบุว่าส่งผลกระทบต่อการบุกรุกเป็นผลมาจากการยับยั้งการหลั่ง microneme มากกว่าผลรอง นอกจากนี้การสังเกตก่อนหน้านี้ของเราที่ยับยั้งไคเนส KT5926 ยังยับยั้งการบุกรุกและการหลั่ง Toxoplasma microneme ส่งเสริมสนับสนุนบทบาทสำหรับโปรตีนไคเนส (s) ในกระบวนการเหล่านี้ ซีรีน / ธ รีโอนีโปรตีนไคเนสส์จะไม่รู้จักกันจะมีบทบาทสำคัญในการควบคุมแคลเซียมภายในเซลล์และเราได้ตั้งข้อสังเกตว่าการรักษาด้วย A23187 บวกระดับสูงของสารแคลเซียมไม่กลับผลยับยั้งของ staurosporine (VB คาร์รูเธอและ LD Sibley, ไม่ถูกเผยแพร่) เรียกรวมกันว่าผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าบล็อก staurosporine เป็นขั้นตอนต่อเนื่องของแคลเซียมในทางเดินสัญญาณพลังงานที่ก่อให้เกิดการหลั่ง microneme หนึ่งเป็นไปได้คือการที่ staurosporine ยับยั้งโปรตีนไคเนสที่จำเป็นสำหรับการเชื่อมต่อ microneme หรือฟิวชั่นที่มีเยื่อหุ้มปลายของปรสิต; แต่การศึกษาต่อไปจะมีความจำเป็นในการทดสอบสมมติฐานนี้ แม้ว่าแอนติเจน SAG1 พื้นผิวที่ได้รับการที่เกี่ยวข้องในเซลล์โฮสต์ผูกพัน (แคสเปอร์และ Mineo, 1994) การกระจายชุดของ SAG1 บนพื้นผิวปรสิตไม่สอดคล้องกับบทบาทในการบุกปลายspeci®c ในทางตรงกันข้ามการใช้งานอย่างรวดเร็วของ MIC2 ลงบนปลายยอดของปรสิตในช่วงเริ่มต้นการบุกรุกสถานที่มันอยู่ในฐานะที่จะเป็นสื่อกลางในสิ่งที่แนบมาทิศทางเพื่อเซลล์โฮสต์ ขณะที่ส่วนใหญ่ของการวิเคราะห์การทดลองของเราไม่ตรงความแตกต่างระหว่างสิ่งที่แนบมาปรสิตหรือเจาะลดลงการทำเครื่องหมายในปรสิตเซลล์ที่เกี่ยวข้องหลังจากการรักษาที่ส่งผลกระทบต่อการหลั่ง microneme แสดงให้เห็นว่าโปรตีน microneme ที่จำเป็นสำหรับสิ่งที่แนบมาปรสิต
หลังจากการหลั่งของที่ปลายยอดที่ปรสิต®rstทำให้การติดต่อกับเซลล์โฮสต์ที่ MIC2 ต่อยอดความก้าวหน้าในช่วงปลายหลังของปรสิตก่อนที่จะถูกปล่อยออกมา นี้ relocalization หลังที่โดดเด่นในช่วงที่แสดงให้เห็นว่าการเจาะ MIC2 นอกจากนี้ยังอาจมีส่วนร่วมในการเจาะพยาธิเข้าสู่เซลล์โฮสต์ MIC2 มีโดเมนรนและลำดับนิวเคลียสสั้น (Wan et al., 1996) ทำให้มี translocation หลังของ MIC2 มีความไวต่อ cytochalasin D (คาร์รูเธอและ Sibley, 1999) และดังนั้นจึงมีแนวโน้มที่จะเกี่ยวข้องกับการสื่อสารกับ actinomyosin ปรสิตมอเตอร์ การเปิดตัวของ MIC2 ที่เสร็จสิ้นการบุกรุกอาจเกิดขึ้นโดยการประมวลผลโปรตีนที่เราได้แสดงให้เห็นก่อนหน้านี้ว่า MIC2 จะถูกปล่อยออกจากปรสิตเซลล์เป็นรูปแบบที่ถูกตัดทอนที่ขาดโดเมน C ขั้ว (Wan et al., 1996) จากการศึกษาที่ผ่านมาเน้นบทบาทสำคัญโปรตีน micronemal ในการบุกของเซลล์โฮสต์จากปรสิต apicomplexan ยกตัวอย่างเช่นส่วนใหญ่ของ adhesins โดดเด่นในวันที่ปรสิต Plasmodium ที่เกี่ยวข้องเป็นโปรตีน micronemal รวมทั้งโปรตีนดัฟฟี่ที่มีผลผูกพันของพี knowlesi โปรตีน circumsporozoite และโปรตีนกาว thrombospondin ที่เกี่ยวข้องกับ falciparum พี (ร็อบสัน et al., 1988 ; อดัมส์, et al, 1990;.. Aikawa, et al, 1990) ใน Toxoplasma ที่ microneme โปรตีน MIC1 และ MIC3 มีส่วนเกี่ยวข้องในเซลล์ที่มีผลผูกพัน: MIC1 มีสองโดเมน TSP เลวและผูกกับเซลล์เป็นเจ้าภาพและมีโดเมน MIC3 EGF ที่มีโปรตีนที่พบบ่อยในการยึดเกาะของเซลล์ (. Fourmaux, et al, 1996a) MIC2 โปรตีน Toxoplasma นอกจากนี้ยังมีหลายโดเมนที่มีแกนด์ที่มีศักยภาพสำหรับเซลล์โฮสต์รวมถึงโดเมนที่ฉัน integrinlike และชุดของหกซ้ำ tsp1 เหมือน ในการสนับสนุนบทบาทดังกล่าวเราได้แสดงให้เห็นว่าฉันpuri®edโดเมน MIC2 recombinant ef®cientlyผูกในหลอดทดลองเพื่อ laminin และในระดับน้อยเพื่อให้คอลลาเจนและฉัน IV (VB คาร์รูเธอและ LD Sibley ในการเตรียมการ) นอกจากนี้เราพบว่ารุ่น recombinant ของโดเมน MIC2 I และ M โดเมนผูกไว้กับเฮตรึง chondroitin ซัลเฟต A และ C และซัลเฟต dextran สำหรับการแข่งขันที่มีผลผูกพันเฮบอกว่า MIC2 ตระหนักถึงความหลากหลายของ glycosaminoglycans ดังนั้น MIC2 และ / หรือโปรตีน micronemal อื่น ๆ อาจเป็นที่อธิบายไว้เมื่อเร็ว ๆ นี้โมเลกุลเฮผูกพันที่ถูกตรวจพบในปลายยอดของปรสิต Toxoplasma และมีผลผูกพันเกี่ยวข้องในการที่จะเป็นเจ้าภาพเซลล์เฮซัลเฟต proteoglycans (OrtegaBarria และดิ้น, 1999) เราตรวจสอบความสามารถของโปรตีน MIC จะผูกกับเซลล์ HFF ใช้เตรียมกึ่งpuri®edของโปรตีน microneme แยกทั้งจาก micronemes puri®edหรือหลังจากที่ปล่อยของพวกเขาในสื่อโดย exocytosis MIC2 ผูกพันspeci®callyไปยังเซลล์ HFF แม้ว่ากิจกรรมนี้คือ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

micronemalproteins arenormally ที่มีอยู่ของ withinsecretory ที่เข้มข้นที่สุดยอดของปรสิตและทรงตัวสำหรับปล่อยเมื่อสัมผัสกับเซลล์โฮสต์ เราได้รายงานก่อนหน้านี้ว่า microneme หลั่งเป็นแคลเซียมอิสระ และสามารถเรียกโดย ionophores แคลเซียม แม้ในกรณีที่ไม่มีของเซลล์โฮสต์ ( และ คาร์รัทเธอร์ Sibley , 1999 )คีเลชั่นแคลเซียมได้อย่างมีประสิทธิภาพยับยั้งเซลล์ของ microneme ปล่อยและเราจะแสดงที่นี่ที่บัดนี้ยังยับยั้งการบุกรุกของเซลล์โฮสต์อื่นๆ ผลนี้ถูก speci ® C ลดลงเซลล์ของแคลเซียม และทั้งการบุกรุกเป็นบางส่วนกลับคืนมา โดยการเพิ่มกลับแคลเซียมในการแสดงตนของแคลเซียมไอโอโนฟอร์ a23187 .ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า มีแคลเซียม ควบคุมเส้นทางการควบคุมการปล่อย micronemesduringengagementwiththehostcell แม้ว่าธรรมชาติจะรับผิดชอบเหตุการณ์นี้ยังคง uncharacterized . การศึกษาของเรายังชี้ให้เห็นบทบาทให้ parasitederived โปรตีนไคเนสกิจกรรมในการหลั่ง microneme บุกรุกโดย Toxoplasma .ก่อนหน้านี้มีการศึกษายังชี้ให้เห็นว่า การรุกรานของเม็ดเลือดแดงที่ถูกควบคุมโดย staurosporine อ่อนไหว kinase ซึ่งแสดง ic50 ของ 250nm ( Ward et al . , 1994 ) staurosporine คือยับยั้งทั่วไปของเซรีน / ถ่ายทอดวิชาและที่ความเข้มข้นสูงซีนโปรตีนไคเนส ( tamaoki , 1991 ) แม้จะมี®กว้างกาเมือง