2.3. Extraction and determination of GLS and phenolic compounds
The HPLC gradient for glucosinolate and phenolic analyses is a multipurpose chromatographic method that simultaneously separates glucosinolates and phenolics (Bennett et al., 2003) and it was recently applied to Galician turnip tops and greens (Francisco et al., 2009). Briefly, a portion of 150 mg of each sample were extracted in 4 mL of 70% MeOH at 70 °C for 30 min with vortex mixing every 5 min to facilitate the extraction. The samples were centrifuged (13,000g, 15 min), and 1 mL of supernatant was collected to completely remove methanol using a sample concentrator (DB-3D, Techne, UK) at 70 °C. The dry material obtained was redissolved in 1 mL of ultrapure water and filtered through a 0.20 μm syringe filters (Acrodisc® Syringe Filters, Pall Life Sciences). Chromatographic analyses were carried out on a Luna C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm particle size; Phenomenex, Macclesfield, UK). The mobile phase was a mixture of: (A) ultrapure water/trifluoro acetic acid (TFA) (99.9:0.1) and (B) methanol/TFA (99.9:0.1). The flow rate was 1 mL min−1 in a linear gradient starting with 0% B at 0–5 min, reaching 17% B at 15–17 min, 25% B at 22 min, 35% B at 30 min, 50% B at 35 min, 99% B at 50 min and at 55–65 min 0% B. The injection volume was 20 μL and chromatograms were recorded at 330 nm for phenolics derivatives and 227 nm for GLS in a Model 600 HPLC instrument (Waters) equipped with a Model 486 UV tunable absorbance detector (Waters). Glucosinolates were quantified using sinigrin (sinigrin monohydrate from Phytoplan, Diehm and Neuberger GmbH, Heidelberg, Germany) as standard. Caffeoyl-quinic and p-coumaroyl-quinic acids derivatives were quantified as chlorogenic acid (5-caffeoyl-quinic acid, Sigma–Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Germany), flavonoids as kaempferol 3-rutinoside (Extrasynthese, Genay, France) and sinapic acid and derivatives as sinapic acid (Sigma).
2.4. Extraction and determination of vitamin C
Ascorbic (AA) and dehydroascorbic (DHAA) acid contents were determined as described by Zapata and Dufour (1992) with some modifications (Gil et al., 1999 and González-Molina et al., 2008). For the determination in fresh, 5 g of fresh weight sample were homogenised in a an Ultra-Turrax T25 (Janke & Kunkel, Germany) for 30 s on an ice bath with 20 mL extractant solution, consisting of MeOH and H2O (5:95), and 2.1% (v:v) dissolved citric acid, 0.05% (v:v) EDTA, and 0.01% (v:v) NaF. For freeze-dried samples 50 mg were homogenised in a vortex stirrer for 20 s with 10 mL of extractant solution. The homogenate was filtered through a four-layer cheesecloth. The extract (1 mL) was centrifuged (3600g for 15 min at 4 °C), and the supernatant was recovered and filtered through a C18 Sep-Pack cartridge (Waters, Milford, MA) previously activated with 10 mL of methanol followed by 10 mL of deionized water, and then 10 mL of air. The collected extract was filtered through a 0.45 μm polyethersulfone filter (Millex-HV, Millipore, Bedford, MA). Then, 250 μL of 1,2-phenilenediamine dihydrochloride (OPDA) solution (18.8 mM) were added to 750 μL of extract for dehyhroascorbic acid derivatization into the fluorophore 3-(1,2-dihydroxietyl)furo[3,4-b]quinoxaline-1-one (DFQ). After 37 min in darkness, the samples were analysed by HPLC. Ascorbic acid and dehydroascorbic acid was evaluated using an HPLC system (Merck-Hitachi, Tokyo, Japan), equipped with a L-6000 pump, injection valve and sample loop 20 μL (Rheodyne, CA, USA) and coupled to a L-4000 UV detector. Samples were analysed on a Lichrospher 100 RP-18 reversed-phase column (250 × 4 mm, particle size 5 μm) (Teknokroma, Barcelona, España) with a C18 precolumn (Teknokroma, Barcelona, España). The mobile phase was MeOH/H2O (5:95, v/v), 5 mM cetrimide, and 50 mM KH2PO4 (pH = 4.59). The flow rate was kept at 0.9 mL min–1. The detector wavelength was initially set at 348 nm, and after DFQ eluted, it was manually shifted to 261 nm, for ascorbic acid detection. L-AA y el L-DHAA were identified and quantified by comparison with pattern areas from L-AA and L-DHAA.
2.5. Statistical analyses
All analyses were made separately for each plant organ (turnip greens and turnip tops). The content of each metabolite (individual and total GLS and phenolic compounds) was determined in two ways: (i) in the fresh (raw) and cooked vegetable tissue and (ii) in the sum in the cooked vegetable tissue plus the cooking water (CW). Individual analyses of variance were performed for each compound. Varieties were considered as random factors. Comparison of means among cooking methods was made by Fisher’s protected least significant difference (LSD) at P = 0.05 ( Steel, Torrie, & Dickey, 1997). All statistical analyses were made using SAS ( SAS Institute., 2007).
2.3 การสกัดและความมุ่งมั่นของ GLS และม่อฮ่อมการไล่ระดับสี HPLC สำหรับ glucosinolate และฟีนอวิเคราะห์คือ วิธี chromatographic อเนกประสงค์ที่พร้อมแยก glucosinolates และ phenolics (เบนเนตและ al., 2003) และล่าสุดใช้หัวผักกาดกาลิเซียหนึ่งตัวและสีเขียว (Francisco et al., 2009) สั้น ๆ ส่วนของตัวอย่างแต่ละ 150 มก.ถูกสกัดใน 4 mL 70% ทานอที่ 70 ° C สำหรับ 30 นาทีด้วย vortex ผสมทุก 5 นาทีเพื่อสกัด ตัวอย่างดี centrifuged (13, 000g, 15 นาที) , และ 1 mL ของ supernatant ถูกรวบรวมเพื่อเอาเมทานอลโดยใช้อาทิตย์หัวตัวอย่าง (DB 3D, Techne สหราชอาณาจักร) ที่ 70 องศาเซลเซียส วัสดุแห้งที่ได้รับ redissolved ใน 1 mL น้ำ ultrapure และถูกกรองผ่าน 0.20 μm เข็มตัวกรอง (กรองเข็ม® Acrodisc แถบวายชีวิตวิทยาศาสตร์) วิเคราะห์ chromatographic ถูกดำเนินการบนคอลัมน์ Luna C18 (250 มม. × 4.6 มม. 5 μm ขนาดอนุภาค Phenomenex, Macclesfield สหราชอาณาจักร) ระยะการเคลื่อนผสมระหว่าง: trifluoro (A) ultrapure น้ำกรดน้ำส้ม (TFA) (99.9:0.1) และ (ข) เมทานอ ล/TFA (99.9:0.1) อัตราการไหล 1 mL min−1 ในเส้นไล่ระดับเริ่มต้นด้วย 0% B 0 – 5 นาที ถึง 17% B ที่ 15 – 17 นาที 25% B 22 นาที 35% B 30 นาที 50% B 35 นาที 99% B 50 นาที และนาที 55 – 65 0% เกิด ปริมาณฉีดได้ 20 μL และ chromatograms บันทึกที่ 330 nm phenolics อนุพันธ์และ 227 nm สำหรับ GLS ในเครื่องมือ HPLC รุ่น 600 (น้ำ) พร้อมตัวจับ tunable absorbance UV รุ่น 486 (น้ำ) Glucosinolates ที่ quantified ใช้ sinigrin (sinigrin monohydrate จาก Phytoplan, Diehm และ Neuberger GmbH ไฮเดลเบิร์ก เยอรมนี) เป็นมาตรฐาน Caffeoyl quinic และอนุพันธ์กรด p-coumaroyl-quinic ถูก quantified เป็น chlorogenic กรด (5-caffeoyl-quinic ซิก-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim เยอรมัน), flavonoids kaempferol 3-rutinoside (Extrasynthese, Genay ฝรั่งเศส) และกรด sinapic และอนุพันธ์เป็นกรด sinapic (ซิกมา)2.4 การแยกและความมุ่งมั่นของวิตามินซีแอสคอร์บิค (AA) และ dehydroascorbic (DHAA) กรดเนื้อหาถูกกำหนดตามที่อธิบายไว้โดย Zapata Dufour (1992) ด้วยการปรับเปลี่ยนบางอย่าง (Gil et al., 1999 และ González Molina et al., 2008) สำหรับการกำหนดในสด 5 กรัมของน้ำหนักสดอย่างถูก homogenised ในการ T25 เป็นอัลตร้า Turrax (Janke & Kunkel เยอรมนี) สำหรับ 30 s บนผิดน้ำแข็งอาบน้ำ 20 mL extractant โซลูชั่น ประกอบด้วยทานอและ H2O (5:95), และส่วนยุบ 2.1% (v: v) กรดซิตริก EDTA 0.05% (v: v) และ 0.01% (v: v) NaF ตัวอย่างกรอบ 50 มิลลิกรัมถูก homogenised ใน vortex ช้อนคนสำหรับ 20 s กับ 10 mL ของ extractant Homogenate ที่ถูกกรองผ่าน cheesecloth ชั้น 4 สารสกัด (1 mL) centrifuged (3600 กรัมสำหรับ 15 นาทีที่ 4 ° C), และ supernatant ถูกกู้คืน และกรองผ่าน C18 Sep-ชุดตลับหมึก (น้ำ ลฟอร์ด MA) ก่อนหน้านี้ ใช้ 10 mL ของเมทานอลตาม ด้วย 10 mL น้ำ deionized และ 10 mL ของอากาศ การดึงข้อมูลที่เก็บรวบรวมถูกกรองผ่าน 0.45 μm polyethersulfone ตัว (Millex HV มาก กลาสโกว์ MA) แล้ว μL 250 ของ 1, 2 phenilenediamine dihydrochloride (OPDA) (18.8 กิกะ mM) ถูกเพิ่มเข้าไป μL 750 ของสารสกัดสำหรับ dehyhroascorbic กรด derivatization เป็น fluorophore 3-(1,2-dihydroxietyl)furo[3,4-b]quinoxaline-1-one (DFQ) หลังจากนาที 37 ในความมืด ตัวอย่างการถูก analysed โดย HPLC กรดแอสคอร์บิคและ dehydroascorbic กรดได้ถูกประเมินโดยใช้ HPLC ระบบการ (เมอร์คฮิตาชิ โตเกียว ญี่ปุ่น), พร้อมปั๊ม L-6000 วาล์วฉีดอย่างวน 20 μL (Rheodyne, CA, USA) และควบคู่กับจับ UV L 4000 ตัวอย่างที่ analysed ในคอลัมน์ Lichrospher 100 RP-18 ขั้นตอนย้อนกลับ (250 × 4 mm อนุภาคขนาด 5 μm) (Teknokroma บาร์เซโลนา España) กับ precolumn C18 (Teknokroma บาร์เซโลนา España) เฟสเคลื่อนทา นอ/H2O (5:95, v/v), 5 mM cetrimide และ 50 มม. KH2PO4 (pH = 4.59) อัตราการไหลถูกเก็บไว้ที่ 0.9 mL min-1 ความยาวคลื่นตรวจจับการตั้งค่าเริ่มต้นที่ 348 nm และหลัง DFQ eluted มันได้ด้วยตนเองจาก 261 nm ตรวจกรดแอสคอร์บิค เอเอเอ L y L-DHAA ได้ระบุ และ quantified by comparison with พื้นที่รูปแบบ L AA และ L-DHAA2.5. สถิติวิเคราะห์วิเคราะห์ทั้งหมดได้ทำการแยกต่างหากสำหรับแต่ละอวัยวะพืช (สีเขียวหัวผักกาดและหัวผักกาดท็อปส์) กำหนดเนื้อหาของแต่ละ metabolite (GLS แต่ละรายการ และรวมและม่อฮ่อม) ในสองวิธี: (i) ในเนื้อเยื่อผักสุกและสด (ดิบ) และ (ii) ในผลผักสุกในเนื้อเยื่อและการปรุงอาหารน้ำ (ตามน้ำหนักจริง) ผลต่างของการวิเคราะห์แต่ละถูกดำเนินการในแต่ละบริเวณ พันธุ์ได้ถือเป็นปัจจัยที่สุ่ม เปรียบเทียบหมายถึงระหว่างทำอาหารวิธีทำโดย Fisher ของป้องกันความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญน้อยที่สุด (LSD) ที่ P = 0.05 (เหล็ก Torrie และ Dickey, 1997) สถิติวิเคราะห์ทั้งหมดได้ทำการใช้ SAS (SAS สถาบัน. 2007)
การแปล กรุณารอสักครู่..
2.3 การสกัดและความมุ่งมั่นของแอลเอสและฟีนอลสารลาด HPLC สำหรับ glucosinolate และวิเคราะห์ฟีนอลเป็นวิธีโครมาอเนกประสงค์ที่พร้อมแยก glucosinolates และฟีนอล (เบนเน็ตต์ et al., 2003) และจะถูกนำมาใช้เมื่อเร็ว ๆ นี้ท็อปส์ซูหัวผักกาดกาลิเซียและสีเขียว (ฟรานซิสและอัล . 2009) สั้น ๆ , เป็นส่วนหนึ่งของ 150 mg ของแต่ละตัวอย่างถูกสกัดใน 4 มิลลิลิตรเมธานอล 70% ที่ 70 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาทีด้วยการผสมน้ำวนทุก 5 นาทีเพื่อความสะดวกในการสกัด กลุ่มตัวอย่างที่ได้รับการหมุนเหวี่ยง (13,000g 15 นาที) และ 1 มิลลิลิตรใสเก็บที่จะสมบูรณ์ลบเมทานอลโดยใช้หัวตัวอย่าง (DB-3D, Techne สหราชอาณาจักร) ที่ 70 ° C วัสดุที่แห้งได้ถูก redissolved ใน 1 มิลลิลิตรของน้ำบริสุทธิ์และกรองผ่าน 0.20 ไมครอนกรองเข็มฉีดยา (Acrodisc®กรองเข็มพอล Life Sciences) การวิเคราะห์สารได้ดำเนินการใน Luna คอลัมน์ C18 (250 × 4.6 มมมม 5 อนุภาคขนาดไมครอน; Phenomenex, แฟรงก์สสหราชอาณาจักร) ขั้นตอนถือเป็นส่วนผสมของ: (A) น้ำบริสุทธิ์ / trifluoro กรดอะซิติก (TFA) (99.9: 0.1) และ (B) เมทานอล / TFA (99.9: 0.1) อัตราการไหล 1 มิลลิลิตร 1 นาทีในการไล่ระดับสีเชิงเส้นที่เริ่มต้นด้วย 0% B ที่ 0-5 นาทีถึง B 17% ที่ 15-17 นาที, B 25% วันที่ 22 นาที, 35% B วันที่ 30 นาที, 50% B ที่ 35 นาที, B 99% ใน 50 นาทีและใน 55-65 นาที 0% บีปริมาณการฉีด 20 ไมโครลิตรและ chromatograms ถูกบันทึกไว้ที่ 330 นาโนเมตรสำหรับสัญญาซื้อขายล่วงหน้าฟีนอลและ 227 นาโนเมตรสำหรับ GLS ในรุ่น 600 เครื่องมือ HPLC (น้ำ ) พร้อมกับรังสียูวีรุ่น 486 เครื่องตรวจจับการดูดกลืนแสงพริ้ง (น้ำ) glucosinolates ถูกวัดโดยใช้ sinigrin (sinigrin monohydrate จาก Phytoplan, Diehm และ Neuberger GmbH, ไฮเดลเบิร์ก, เยอรมนี) เป็นมาตรฐาน Caffeoyl-quinic และพี coumaroyl-quinic อนุพันธ์กรดถูกปริมาณกรด chlorogenic (5-caffeoyl-quinic กรด Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, เยอรมนี) flavonoids เป็นเฟอรอล 3 rutinoside (Extrasynthese, Genay ฝรั่งเศส) และ sinapic กรดและอนุพันธ์กรด sinapic (ซิกม่า). 2.4 การสกัดและความมุ่งมั่นของวิตามินซีวิตามินซี (AA) และ dehydroascorbic (DHAA) ปริมาณกรดได้รับการพิจารณาตามที่อธิบายเปาลาและ Dufour (1992) มีการปรับเปลี่ยนบางส่วน (กิล et al., 1999 และGonzález-Molina et al., 2008) สำหรับความมุ่งมั่นในสด 5 กรัมน้ำหนักสดถูก homogenised หนึ่งในอัลตร้า Turrax T25 (Janke & เกิล, เยอรมนี) เป็นเวลา 30 วินาทีในการอาบน้ำน้ำแข็งที่มีวิธีการแก้ปัญหา 20 มลสารสกัดที่ประกอบด้วยเมธานอลและ H2O (5:95 ) และ 2.1% (V: V) ละลายกรดซิตริก 0.05% (V: V) EDTA และ 0.01% (V: V) NaF สำหรับตัวอย่างแห้ง 50 มก. ถูก homogenised กวนในน้ำวนเป็นเวลา 20 s 10 มิลลิลิตรของการแก้ปัญหาสารสกัด homogenate ถูกกรองผ่านผ้าสี่ชั้น สารสกัดจาก (1 มิลลิลิตร) ได้รับการหมุนเหวี่ยง (3600G นาน 15 นาทีที่ 4 ° C) และใสหายและกรองผ่าน C18 ก.ย. ชุดตลับหมึก (Waters, ฟอร์ด, แมสซาชูเซต) เปิดใช้งานก่อนหน้านี้กับ 10 มิลลิลิตรของเมทานอลตามด้วย 10 มิลลิลิตรน้ำปราศจากไอออนแล้ว 10 มิลลิลิตรของอากาศ สารสกัดที่เก็บรวบรวมได้ถูกกรองผ่าน 0.45 ไมโครเมตร polyethersulfone กรอง (Millex-HV, ค, ฟอร์ด, แมสซาชูเซต) จากนั้น 250 ไมโครลิตรของ 1,2-phenilenediamine dihydrochloride (OPDA) วิธีการแก้ปัญหา (18.8 มิลลิเมตร) ถูกเพิ่มเข้าไปใน 750 ไมโครลิตรของสารสกัดจากกรดสำหรับอนุพันธ์ dehyhroascorbic ลงในสารเรืองแสง 3 (1,2-dihydroxietyl) furo [3,4-b] quinoxaline-1-หนึ่ง (DFQ) หลังจาก 37 นาทีในความมืดตัวอย่างมาวิเคราะห์โดยวิธี HPLC วิตามินซีและกรด dehydroascorbic ได้รับการประเมินโดยใช้ระบบ HPLC (เมอร์ค-Hitachi, กรุงโตเกียวประเทศญี่ปุ่น) พร้อมกับปั๊ม L-6000, วาล์วหัวฉีดและตัวอย่างวง 20 ไมโครลิตร (Rheodyne, CA, USA) และคู่กับ L-4000 เครื่องตรวจจับรังสียูวี ตัวอย่างที่ได้มาวิเคราะห์บน LiChrospher 100 RP-18 คอลัมน์กลับเฟส (250 × 4 มมอนุภาคขนาด 5 ไมครอน) (Teknokroma บาร์เซโลนาEspaña) กับ C18 precolumn (Teknokroma บาร์เซโลนาEspaña) เฟสเคลื่อนที่เป็นเมธานอล / H2O (5:95, v / v) 5 มิลลิ cetrimide และ 50 มิลลิ KH2PO4 (pH = 4.59) อัตราการไหลที่ถูกเก็บไว้ที่ 0.9 มิลลิลิตร 1 นาที ความยาวคลื่นตรวจจับได้รับการตั้งค่าเริ่มต้นที่ 348 นาโนเมตรและหลังจาก DFQ ชะมันก็เปลี่ยนไปด้วยตนเอง 261 นาโนเมตรสำหรับการตรวจสอบวิตามินซี L-AA y เอ L-DHAA ถูกระบุและวัดโดยเปรียบเทียบกับพื้นที่รูปแบบจาก L-AA และ L-DHAA. 2.5 วิเคราะห์ทางสถิติการวิเคราะห์ทั้งหมดถูกสร้างขึ้นแยกต่างหากสำหรับแต่ละอวัยวะพืช (หัวผักกาดเขียวและท็อปส์ซูหัวผักกาด) เนื้อหาของแต่ละ metabolite (บุคคลและรวม GLS และสารประกอบฟีนอล) ถูกกำหนดในสองวิธี: (i) ในสด (สด) และเนื้อเยื่อพืชผักที่ปรุงสุกและ (ii) ในผลรวมในเนื้อเยื่อของพืชที่ปรุงสุกพร้อมน้ำปรุงอาหาร ( CW) การวิเคราะห์ความแปรปรวนของแต่ละบุคคลได้ดำเนินการสำหรับแต่ละสารประกอบ พันธุ์ได้รับการพิจารณาเป็นปัจจัยสุ่ม การเปรียบเทียบวิธีการปรุงอาหารในวิธีการทำโดยฟิชเชอร์ได้รับการคุ้มครองอย่างมีนัยสำคัญน้อย (LSD) ที่ p = 0.05 (เหล็ก Torrie และผ้ากันเปื้อน, 1997) วิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมดถูกสร้างขึ้นมาโดยใช้ SAS (SAS Institute., 2007)
การแปล กรุณารอสักครู่..