2.2. Shake flask culturesOne single

2.2. Shake flask culturesOne single colony carrying the plasmid pET21-60EGP was usedto inoculate 5 mL of LB medium supplemented with 100 g mL−1of ampicillin, incubated at 37◦C for 18 h. For expression, 2 mL ofseed culture were subsequently used to inoculate 198 mL of LB, Ter-rific Broth (TB) (tryptone 12 g L−1, yeast extract 24 g L−1, KH2PO42,31 g L−1, K2HPO412,54 g L−1, pH 7 and ampicillin 100 ug.mL−1)or TB supplemented (TB media with glycerol 4 mL L−1). This cul-ture was incubated in 1 L Erlenmeyer flasks at 37◦C in an orbitalshaker, until the OD600nmreached between 0.5 and 0.7. Then, theexpression was initiated by addition of 1 mM IPTG. Samples werecollected at times 0 h (shortly before induction) and 0.25 h, 0.5 h,1 h, 2 h, 3 h and 4 h, then harvested by centrifugation at 5000 × g for10 min at 4◦C. The cell pellet was recovered and stored at −80◦C.2.3. ELP purificationThe cell pellet from shake flask and batch fermentation cultureswas resuspended in 1/20 of the original culture volume with lysisbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.5, 2 mM EDTA, 0.1 mg mL−1lysozyme)and frozen at −80◦C for one hour. Cells were subsequently thawedat room temperature and disrupted by sonication on ice (18 pulsesof 10 s each with 80% amplitude). Cell lysates were clarified by cen-trifugation at 20,000 × g for 1 h at 4◦C. Next, 3 M sodium chloridewas directly added to each clarified lysate to induce ELP pre-cipitation, and the samples were incubated at room temperaturefor 10 min in order to allow ELP aggregation. Samples were thencentrifuged at 8000 × g for 10 min at 40◦C, and the pellet was resus-pended in ice-cold PBS (pH 7.4) and incubated in ice for 10 min.After centrifugation at 8000 × g at 4◦C the supernatant was col-lected, ending a cycle of precipitation, which was repeated twice.A new precipitation induced by NaCl yielded the pellet fractionrich in ELP aggregates in which the peptide Pa-MAP 2 was fused tothe intein Mxe GyrA. These parameters were applied in subsequentsamples and analyses.2.4. Mxe GyrA intein activation analysis and Pa-MAP 2purificationActivation of Mxe GyrA intein was analyzed in different cleavingbuffers (50 mM sodium acetate pH 5, 5.5; 20 mM Bis-Tris pH 6, 6.5;20 mM Tris-HCl pH 7, 7.5, 8, 8.5). For these, ELP aggregates wereresuspended in ice-cold buffer and incubated at 19, 25 or 30◦C.Samples were taken at 24 and 48 h and evaluated by 12% SDS-PAGE(Laemmli, 1970) using a Mini-PROTEAN®Electrophoresis System(Bio-Rad) and PageRuler Unstained Protein Ladder (Fermentas) asmolecular weight marker. Bands were visualized by coomassiestaining (Pink et al., 2010). The best method was chosen basedfirstly on the shortest time and highest level of intein-cleavage(pH 5.5 at 24 h) and secondly on how fast the system achievedthe temperature of 25◦C. These parameters were applied in sub-sequent samples and analyses. Once the cleavage procedure wascompleted, another cycle of ELP precipitation was performed. Thefinal purified supernatant containing the residual-free peptide wasthen transferred into a new 1.5 mL tube and lyophilized. To ana-lyze the size of the peptide Pa-MAP 2 after its release, MALDI-TOFMS analysis was performed using an Ultraflex mass spectrometer(Bruker), with a 600 m AnchorChip target (Bruker) and proteincalibration standard II (Bruker) using -cyano-4-hydroxycinnamicacid as matrix.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 เขย่าขวด culturesOne อาณานิคมเดียวแบกพลาสมิด pET21-60EGP ถูกเติมเชื้อ usedto ขนาด 5 ml ของกลาง LB เสริมด้วย 100 กรัม ML-1of ampicillin, บ่มที่37◦Cสำหรับ 18 ชั่วโมง สำหรับการแสดงออก 2 มลวัฒนธรรม ofseed ถูกนำมาใช้ในการฉีดวัคซีน 198 มล LB, Ter-rific น้ำซุป (TB) (Tryptone 12 กรัม L-1, สารสกัดจากยีสต์ 24 กรัม L-1, L-1 KH2PO42,31 กรัม K2HPO412, 54 กรัม L-1, ค่า pH 7 และ ampicillin 100 ug.mL-1) หรือวัณโรคเสริม (Media วัณโรคกับกลีเซอรอล 4 มิลลิลิตร L-1) Cul-ture นี้ถูกบ่มในขวด 1 ลิตร Erlenmeyer ที่37◦Cใน orbitalshaker จน OD600nmreached ระหว่าง 0.5 และ 0.7 จากนั้น theexpression ได้ริเริ่มขึ้นโดยการเติม 1 มิลลิ IPTG ตัวอย่าง werecollected ในเวลา 0 h (ไม่นานก่อนที่การเหนี่ยวนำ) และ 0.25 ชั่วโมง, 0.5 H, 1 ชั่วโมง 2 ชั่วโมง 3 ชั่วโมงและ 4 ชั่วโมงที่แล้วเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 5000 ×กรัม for10 นาทีที่4◦C เม็ดเซลล์ถูกกู้คืนและเก็บไว้ที่-80◦C.2.3 ตะกอนเซลล์ ELP purificationThe จากขวดสั่นและหมัก cultureswas resuspended ใน 1/20 ของปริมาณวัฒนธรรมเดิมที่มี lysisbuffer (10 mM Tris-HCl พีเอช 8.5, 2 mm EDTA 0.1 มิลลิกรัม ML-1lysozyme) และแช่แข็งที่-80◦C เป็นเวลาหนึ่งชั่วโมง เซลล์ต่อมาอุณหภูมิห้อง thawedat และหยุดชะงักโดย sonication บนน้ำแข็ง (18 pulsesof 10 วินาทีแต่ละคนมีความกว้าง 80%) lysates เซลล์ได้รับการชี้แจงจาก CEN-trifugation 20,000 ×กรัมเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่4◦C ถัดไป 3 เมตร chloridewas โซเดียมเพิ่มโดยตรงกับแต่ละ lysate ชี้แจงเพื่อก่อให้เกิด ELP ก่อน cipitation และตัวอย่างที่ถูกบ่มที่อุณหภูมิห้อง temperaturefor 10 นาทีเพื่อให้การรวม ELP ตัวอย่าง thencentrifuged ที่ 8000 ×กรัมเป็นเวลา 10 นาทีที่40◦Cและเม็ดถูก resus-pended ในเย็นพีบีเอส (pH 7.4) และบ่มในน้ำแข็ง 10 min.After หมุนเหวี่ยงที่ 8000 ×กรัมที่4◦C ใสเป็น Col-เลือกไว้สิ้นสุดวงจรของการเกิดฝนซึ่งเป็นซ้ำ twice.A เร่งรัดใหม่ที่เกิดจากโซเดียมคลอไรด์ให้ผล fractionrich เม็ดใน ELP มวลรวมที่เปปไทด์ Pa-MAP 2 ผสม tothe intein MXE Gyra พารามิเตอร์เหล่านี้ถูกนำมาใช้ใน subsequentsamples และ analyses.2.4 MXE Gyra intein กระตุ้นการวิเคราะห์และ Pa-MAP 2purificationActivation ของ MXE Gyra intein วิเคราะห์ใน cleavingbuffers แตกต่างกัน (ขนาด 50 มมโซเดียมอะซิเตทพีเอช 5, 5.5; 20 มิลลิเมตร Bis-Tris พีเอช 6, 6.5; 20 มิลลิเมตร Tris-HCl พีเอช 7, 7.5, 8 8.5) สำหรับเหล่ามวลรวม ELP wereresuspended ในบัฟเฟอร์เย็นและบ่มที่ 19, 25 หรือ30◦C.Samplesถูกนำตัวที่ 24 และ 48 ชั่วโมงและประเมินผล 12% SDS-PAGE (Laemmli 1970) โดยใช้ Mini-PROTEAN®Electrophoresis ระบบ (Bio-Rad) และ PageRuler ไม่มีรอยเปื้อนโปรตีนบันได (Fermentas) asmolecular เครื่องหมายน้ำหนัก วงดนตรีที่ได้รับการมองเห็นโดย coomassiestaining สีชมพู (et al., 2010) วิธีที่ดีที่สุดที่ได้รับเลือก basedfirstly ในเวลาที่สั้นที่สุดและระดับสูงสุดของ intein-ความแตกแยก (pH 5.5 เวลา 24 ชั่วโมง) และประการที่สองเกี่ยวกับวิธีการที่รวดเร็วระบบอุณหภูมิ25◦C achievedthe พารามิเตอร์เหล่านี้ถูกนำไปใช้ในตัวอย่างย่อยตามลำดับและการวิเคราะห์ เมื่อขั้นตอนการแตกแยก wascompleted วงจรของ ELP เร่งรัดอื่นที่ได้ดำเนินการ ใสบริสุทธิ์ Thefinal มีเหลือฟรี wasthen เปปไทด์โอนเข้าใหม่ 1.5 มิลลิลิตรหลอดและแห้ง ไปที่ Ana-lyze ขนาดของเปปไทด์ Pa-MAP 2 หลังจากที่ปล่อยวิเคราะห์ MALDI-TOFMS ถูกดำเนินการโดยใช้มวลสเปกโตรมิเตอร์ UltraFlex (Bruker) กับ 600 เมตร AnchorChip เป้าหมาย (Bruker) และ proteincalibration มาตรฐาน ii (Bruker) โดยใช้ ? -cyano-4-hydroxycinnamicacid เป็นเมทริกซ์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2 . เขย่าขวด culturesone เดียวอาณานิคมแบก pet21-60egp พลาสมาฉีดวัคซีน 5 ml ของปอนด์เติม 100 กรัมมิลลิลิตร− 1of แอมพิบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 18 ชั่วโมง◦สำหรับการแสดง , วัฒนธรรม ofseed 2 มลต่อมาใช้ปลูกฝี 198 กรัมปอนด์ เธอ rific broth ( TB ) ( 12 g L − 1 ทริพโทนสารสกัดจากยีสต์ 24 g L − 1 , kh2po42,31 G L − 1 , − 1 k2hpo412,54 กรัมต่อลิตร pH 7 และ ampicillin 100 มคก . มล. − 1 TB ( วัณโรค ) หรือเสริมสื่อกับกลีเซอรอล 4 มล. L − 1 ) นี้มักจะถูกเลี้ยงใน cul 1 ขวดเออร์เลนเมเยอร์ที่ 37 ◦ C ใน orbitalshaker จน od600nmreached ระหว่าง 0.5 และ 0.7 แล้ว theexpression ริเริ่มขึ้นโดยเพิ่มโปรตีน 1 มิลลิเมตร ตัวอย่างข้อมูลที่เวลา 0 H ( ก่อนที่จะเหนี่ยวนำ ) 0.25 0.5 และ 1 H , H , H 2 H , 3 ชั่วโมงและ 4 ชั่วโมง แล้วเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 5000 ×กรัม for10 นาทีที่ 4 ◦ C เซลล์เม็ดถูกกู้คืนและเก็บไว้ที่− 80 ◦ c.2.3 . แอลพี purificationthe เซลล์เม็ดจากขวดเขย่าและการหมักแบบ cultureswas resuspended 1 / 20 ของวัฒนธรรมเล่มเดิมที่มี lysisbuffer ( 10 มม. นอกจากนี้ กรดไฮโดรคลอริก pH 8.5 , 2 mM EDTA , 0.1 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร 1lysozyme −− ) และแช่แข็งที่อุณหภูมิ 80 ◦ C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง เซลล์มีต่อมา thawedat อุณหภูมิห้องและรบกวนด้วย sonication บนน้ำแข็ง ( 18 pulsesof 10 แต่ละกับ 80% ของ ) เซลล์ lysates มีการชี้แจงโดย CEN trifugation ที่ 20000 ×กรัมเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ใน 4 ◦ C หน้า 3 M โซเดียม chloridewas โดยตรงเพิ่มแต่ละชี้แจง lysate ชวน ELP ก่อน cipitation และจำนวนเชื้อที่ temperaturefor ห้อง 10 นาทีเพื่อให้แอลพีเก . จำนวน thencentrifuged ที่ 8000 × G สำหรับ 10 นาทีที่ 40 ◦ C และเม็ดคือรีซัส pended ใน PBS เย็น ( pH 7.4 ) บ่มในน้ำแข็งเป็นเวลา 10 นาทีหลังการปั่นเหวี่ยงที่ 8000 × g 4 ◦ C สูงเป็นคอลัมน์ lected สิ้นสุดวงจรของการตกตะกอน ซึ่งเกิดขึ้นซ้ำสองได้ ใหม่ด้วยการพบเกลือเม็ด fractionrich Elp มวลรวมที่ผสมกับแผนที่ 2 คือ เปปไทด์ ปาอินทีอิน mxe Gyra . ตัวแปรเหล่านี้จะถูกใช้ในการวิเคราะห์ subsequentsamples 2.4 . mxe Gyra อินทีอินด้วยการวิเคราะห์และป่าแผนที่ 2purificationactivation ของ mxe Gyra อินทีอินถูกวิเคราะห์ใน cleavingbuffers แตกต่างกัน ( 50 มิลลิโมลาร์โซเดียมอะซิเตต pH 5 , 5.5 ; 20 มิลบิสบริษัทพีเอช 6 , 6.5 ; 20 มม. โดยกรดไฮโดรคลอริก pH 7 , 7.5 , 8 , 8.5 ) เหล่านี้ wereresuspended ELP มวลรวมในบัฟเฟอร์และน้ำแข็งเย็นอุณหภูมิ 19 , 25 หรือ 30 ◦ c.samples ถ่ายที่ 24 และ 48 ชั่วโมง และประเมิน โดยร้อยละ 12 การศึกษา ( laemmli , 1970 ) โดยใช้วิธีระบบ ( Bio Mini ซึ่งเปลี่ยนแปลงได้มาก® rad ) และ pageruler ไม่มีรอยเปื้อนโปรตีนบันได ( fermentas ) asmolecular น้ำหนักเครื่องหมาย วงถูกมองเห็นโดย coomassiestaining ( สีชมพู et al . , 2010 ) วิธีที่ดีที่สุดคือการเลือก basedfirstly ในเวลาที่สั้นที่สุด และระดับของอินทีอินตัวสูงสุด ( 5.5 pH 24 H ) และประการที่สอง ในวิธีการที่รวดเร็ว achievedthe ระบบอุณหภูมิ 25 C ◦ พารามิเตอร์เหล่านี้มาใช้ย่อยตามลำดับตัวอย่าง และวิเคราะห์ข้อมูล เมื่อขั้นตอนการ wascompleted อีกรอบของการตกตะกอน ELP กำหนด บริสุทธิ์สูง จะมีประกอบด้วยเปปไทด์อิสระตกค้างและย้ายเข้าใหม่ 1.5 ml หลอดและแห้ง . กับอนาไลซ์ขนาดของเปปไทด์ PA แผนที่ 2 หลังจากปล่อย , การวิเคราะห์การใช้ maldi-tofms ultraflex แมสสเปกโตรมิเตอร์ ( BRUKER ) กับ 600 เมตร anchorchip เป้าหมาย ( บรุคเกอร์ ) และมาตรฐาน ( 2 proteincalibration BRUKER ) ใช้ - cyano-4-hydroxycinnamicacid เป็นเมทริกซ์