Amplification of the V. harveyi hem

Amplification of the V. harveyi hemolysin gene (vhh)
PCR primers reported by Zhang and co-workers
(2001) were used to amplify the 1.3 kb open reading
frame of the hemolysin gene in the reference strain V.
harveyi IFO 15634 (Fig. 1). The identity of the PCRamplified
1.3 kb product was verified by direct sequencing
and BLAST homology search. The partial
nucleotide sequence displays 95% homology with the
reported Vibrio harveyi vhhA and vhhB genes deposited
in the GenBank database (data not shown).
Subsequently, other nested primers were designed in
this study in order to amplify internal hemolysin vhh
gene fragments in the V. harveyi reference strain.
Primer sequences used (Table 3) include a primer set
F2 and R2 designed in this study, generating a 216-bp
hemolysin gene fragment. PCR reactions using combinations
of the old and new primers and template DNA
from the reference V. harveyi strain, was observed to
yield amplified fragments with the following approximate
sizes: 308 bp and 1.2 kb (with primer sets, F1R2and F2R1, respectively; Fig. 1).
In order to test the universality of the primer sets in
producing the expected vhh gene amplified fragments,
genomic DNA extracts from ten (10) Vibrio harveyi isolates
from different hosts and geographical locations
were used as PCR templates (Fig. 2). The 1.3 kb PCR
product generated using the F1R1 primer set (designed
in an earlier study) was observed in all V. harveyi
strains tested except 2 strains, VIB 391 and STD
3-101, isolated from larval shrimp in Thailand and
Ecuador, respectively. Amplified DNA fragments were
also observed from all isolates tested after PCR using
the new set of primers F2R2 and the combined
primers F2R1 (216-bp and 1.2-kb, respectively), except
in two Vibrio harveyi strains that did not yield the
expected products with F1R1 either. Interestingly, the
308-bp amplified fragment produced by the F1R2
primer set with V. harveyi (IFO 15634) was consistently
obtained in all ten (10) V. harveyi strains. The expected 308-bp band and an additional 600-bp amplicon
were observed in profiles of one strain from
Ecuador (STD 3-101). The presence of this additional
band can not be explained at this time.
Test for the specificity of the PCR detection protocol
for V. harveyi vhh gene
The specificity of the primer set amplifying 308-bp
Vibrio harveyi vhh gene fragment was established by
using the target V. harveyi, non-target Vibrio species,
and several non-Vibrio DNA templates (data not
shown). The expected amplicon was only observed in
V. harveyi. Use of DNA templates from non-Vibrio
species and the black tiger shrimp (Penaeus
monodon) did not yield the 308-bp amplicon, indicating
that no false positive results will be obtained even in
the presence of these DNA in samples to be analyzed.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ขยายของ V. harveyi hemolysin ยีน (vhh)ไพรเมอร์ PCR รายงาน โดยเตียวและเพื่อนร่วมงาน(2001) ใช้ขยายฐาน 1.3 เปิดอ่านกรอบของยีน hemolysin ในสายพันธุ์อ้างอิง Vharveyi IFO 15634 (Fig. 1) ลักษณะเฉพาะของ PCRamplifiedผลิตภัณฑ์ 1.3 kb ถูกตรวจสอบ โดยลำดับโดยตรงและค้นหาระเบิด homology บางส่วน95% homology กับแสดงลำดับของนิวคลีโอไทด์รายงานผล harveyi vhhA และ vhhB ยีนฝากใน GenBank ฐานข้อมูล (ข้อมูลไม่แสดง)ไพรเมอร์อื่นซ้อนกันถูกออกแบบในภายหลังการศึกษานี้เพื่อขยาย vhh hemolysin ภายในบางส่วนของยีนใน V. harveyi พันธุ์อ้างอิงลำดับรองพื้นใช้พรม (ตาราง 3) รวมชุดรองพื้นF2 และ R2 ในการศึกษานี้ สร้าง 216-bpส่วนของยีน hemolysin ปฏิกิริยา PCR โดยใช้ชุดไพรเมอร์ที่เก่า และใหม่และแม่แบบดีเอ็นเออ้างอิง V. harveyi ต้องใช้ ถูกสังเกตไปผลผลิตบางส่วนของเอาต์กับต่อไปนี้โดยประมาณขนาด: 308 bp และ 1.2 kb (กับพื้นตั้ง F1R2and F2R1 ตามลำดับ Fig. 1)เพื่อทดสอบ universality ชุดรองพื้นในผลิต vhh คาดยีนขยายชิ้นส่วนgenomic DNA แยกออกจากสิบ (10) ผลแยก harveyiจากโฮสต์ที่แตกต่างกันและตำแหน่งที่ตั้งทางภูมิศาสตร์ถูกใช้เป็นแม่แบบ PCR (Fig. 2) ฐาน 1.3 PCRโดยชุดรองพื้น F1R1 (ออกแบบผลิตภัณฑ์ในการศึกษาก่อนหน้านี้) ถูกพบใน V. harveyiทดสอบยกเว้นสายพันธุ์ 2, VIB 391 และมาตรฐานสายพันธุ์3-101 โดดเดี่ยว larval กุ้งในประเทศไทย และเอกวาดอร์ ตามลำดับ มีชิ้นส่วนดีเอ็นเอเอาต์นอกจากนี้ยัง สังเกตจากทั้งหมดที่แยกได้ทดสอบหลังการใช้ PCRชุดใหม่ของไพรเมอร์ F2R2 และการรวมไพรเมอร์ F2R1 (216-bp และ 1.2 kb ตามลำดับ), ยกเว้นในสายพันธุ์ harveyi ผลสองที่ไม่ได้ก่อการคาดว่าผลิตภัณฑ์ที่ มี F1R1 อย่างใดอย่างหนึ่ง เป็นเรื่องน่าสนใจ การ308-bp ส่วนเอาต์ผลิต โดย F1R2มีพื้นที่ตั้งกับ V. harveyi (IFO 15634) อย่างสม่ำเสมอรับในทั้งหมดสิบ (10) V. harveyi สายพันธุ์ วง 308-bp คาดและ amplicon เป็น 600 bp เพิ่มเติมสุภัคของต้องใช้หนึ่งจากเอกวาดอร์ (มาตรฐาน 3-101) ของเพิ่มเติมนี้วงไม่สามารถอธิบายได้ในขณะนี้ทดสอบ specificity ของโพรโทคอลการตรวจ PCRสำหรับ V. harveyi vhh ยีนSpecificity ชุดพื้นมือ 308-bpส่วนผล harveyi vhh ยีนก่อตั้งขึ้นโดยใช้เป้าหมาย V. harveyi ไม่ใช่เป้าหมายต่อสปีชีส์และต้นแบบ DNA ผลต่าง ๆ (ข้อมูลไม่แสดง) Amplicon ที่คาดเท่าที่สังเกตในV. harveyi ใช้ดีเอ็นเอต้นแบบจากผลไม่ชนิดและกุ้งกุลาดำ (กุ้งกุลาmonodon) ได้ผลผลิต amplicon 308-bp แสดงว่า จะได้รับผลบวกเท็จไม่แม้แต่ในการปรากฏตัวของเหล่าดีเอ็นเอในตัวอย่างจะวิเคราะห์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การขยายของ V. harveyi ยีน hemolysin (vhh)
ไพรเมอร์ PCR รายงานโดยวอชิงตันโพสต์และเพื่อนร่วมงาน
(2001) ถูกนำมาใช้เพื่อขยาย 1.3
กิโลเปิดอ่านกรอบของยีนhemolysin ในสายพันธุ์อ้างอิง V.
harveyi IFO 15634 (รูปที่ 1. ) เอกลักษณ์ของ PCRamplified
สินค้า 1.3
กิโลได้รับการตรวจสอบโดยลำดับโดยตรงและค้นหาระเบิดที่คล้ายคลึงกัน บางส่วนลำดับเบสแสดงที่คล้ายคลึงกัน 95% กับรายงานVibrio harveyi vhhA และยีน vhhB ฝากในฐานข้อมูลGenBank (ไม่ได้แสดงข้อมูล). ต่อจากนั้นไพรเมอร์ที่ซ้อนกันอื่น ๆ ที่ได้รับการออกแบบในการศึกษาครั้งนี้เพื่อที่จะขยายhemolysin vhh ภายในชิ้นส่วนของยีนในV . สายพันธุ์อ้างอิง harveyi. ลำดับไพรเมอร์ที่ใช้ (ตารางที่ 3) ไพรเมอร์รวมถึงการตั้งF2 และ R2 การออกแบบในการศึกษาครั้งนี้สร้าง 216-bp hemolysin ส่วนของยีน ปฏิกิริยา PCR โดยใช้ชุดของไพรเมอร์เก่าและใหม่และDNA แม่แบบจากการอ้างอิงV. harveyi สายพันธุ์ที่ได้รับการตั้งข้อสังเกตในการให้ผลผลิตชิ้นส่วนที่มีการขยายต่อไปนี้ประมาณขนาด: 308 bp และ 1.2 กิโล (มีชุดไพรเมอร์, F1R2and F2R1 ตามลำดับรูป 1). เพื่อทดสอบความเป็นสากลของชุดไพรเมอร์ในการผลิตยีน vhh คาดว่าชิ้นส่วนขยายสารสกัดดีเอ็นเอจากสิบ(10) Vibrio harveyi แยกจากครอบครัวที่แตกต่างกันและสถานที่ทางภูมิศาสตร์ที่ถูกนำมาใช้เป็นแม่แบบPCR (รูปที่. 2) 1.3 กิโล PCR สร้างผลิตภัณฑ์ที่ใช้ชุดไพรเมอร์ F1R1 (ได้รับการออกแบบในการศึกษาก่อนหน้านี้) พบว่าในทุก V. harveyi สายพันธุ์ทดสอบยกเว้น 2 สายพันธุ์ VIB 391 และ STD 3-101 ที่แยกได้จากกุ้งตัวอ่อนในประเทศไทยและเอกวาดอร์ตามลำดับ ขยายดีเอ็นเอถูกตั้งข้อสังเกตจากทั้งหมดแยกการทดสอบหลังจาก PCR โดยใช้ชุดใหม่ของไพรเมอร์F2R2 และรวมไพรเมอร์F2R1 (216-bp และ 1.2 กิโลไบต์ตามลำดับ) ยกเว้นในสองสายพันธุ์เชื้อVibrio harveyi ที่ไม่ได้ผลผลิตผลิตภัณฑ์คาดว่าจะมีF1R1 อย่างใดอย่างหนึ่ง ที่น่าสนใจส่วนขยาย 308 bp ผลิตโดย F1R2 ไพรเมอร์ชุดที่มี V. harveyi (IFO 15634) ได้อย่างต่อเนื่องได้ในทุกสิบ(10) สายพันธุ์ V. harveyi ที่คาดว่าจะวง 308 bp และเพิ่มเติม amplicon 600 bp ถูกตั้งข้อสังเกตในโปรไฟล์ของหนึ่งในสายพันธุ์จากประเทศเอกวาดอร์ (STD 3-101) การปรากฏตัวของเพิ่มเติมนี้วงไม่สามารถอธิบายได้ในขณะนี้. ทดสอบความจำเพาะของโปรโตคอลการตรวจสอบวิธี PCR ของยีน V. harveyi vhh ความจำเพาะของชุดไพรเมอร์ขยาย 308 ความดันโลหิตVibrio harveyi vhh ส่วนยีนก่อตั้งขึ้นโดยใช้เป้าหมายV. harveyi, ไม่ใช่เป้าหมายชนิดเชื้อ Vibrio, และ DNA ที่ไม่ Vibrio หลายแม่ (ข้อมูลไม่แสดง) amplicon คาดว่าถูกพบเฉพาะในโวลต์ harveyi การใช้แม่แบบดีเอ็นเอจากการไม่ Vibrio สายพันธุ์และกุ้งกุลาดำ (Penaeus monodon) ไม่ได้ผลผลิต amplicon 308 bp แสดงให้เห็นว่าไม่มีผลบวกปลอมจะได้รับแม้ในการปรากฏตัวของดีเอ็นเอเหล่านี้ในกลุ่มตัวอย่างที่จะวิเคราะห์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การเพิ่มปริมาณของยีน ( V . harveyi ตรง vhh
PCR ไพรเมอร์ ) รายงานโดย Zhang และเพื่อนร่วมงาน
( 2001 ) ถูกใช้เพื่อขยาย 1.3 กิโล เปิดอ่าน
กรอบของยีนในสายพันธุ์อ้างอิงตรง V .
5 15634 IFO ( รูปที่ 1 ) เอกลักษณ์ของ pcramplified
1.3 กิโลสินค้าถูกตรวจสอบความถูกต้องโดยการโดยตรงและระเบิด
ตัวค้นหา ส่วน
หาลำดับเบส 95% ซึ่งแสดงด้วย
vhha Vibrio harveyi และรายงาน vhhb ยีนฝากไว้
ในขนาดฐานข้อมูล ( ข้อมูลไม่แสดง ) .
ต่อมาอื่นซ้อนกันโดยออกแบบ
การศึกษาเพื่อทำหน้าที่ขยายยีน vhh
ตรงภายในชิ้นส่วนใน V . harveyi สายพันธุ์อ้างอิง .
ลำดับ ( ตารางที่ 3 การใช้ไพรเมอร์ ) รวมถึงรองพื้นเซ็ต
F2 และ R2 ที่ออกแบบในการศึกษานี้สร้าง 216 bp
ตรงยีนจำเพาะ . ปฏิกิริยา PCR โดยใช้ชุดของทั้งเก่าและใหม่

ดีเอ็นเอแม่แบบจากไพรเมอร์และอ้างอิง V . harveyi สายพันธุ์ พบชิ้นส่วนของ
ผลผลิตที่มีดังต่อไปนี้โดยประมาณ
ขนาด : 308 bp และ 1.2 KB ( ชุดไพรเมอร์ f1r2and f2r1 ตามลำดับ ; รูปที่ 1 ) .
เพื่อทดสอบสากลของ ไพรเมอร์ชุด
ผลิตชิ้นส่วนของยีนที่คาดว่า vhh
genomic DNA , สารสกัดจากสิบ ( 10 ) Vibrio harveyi สายพันธุ์
จากโฮสต์ที่แตกต่างกันและภูมิศาสตร์ที่ตั้ง
ถูกใช้เป็นแม่แบบ ) ( รูปที่ 2 ) 1.3 กิโล PCR
ผลิตภัณฑ์ที่สร้างโดยใช้ไพรเมอร์ที่ออกแบบชุด f1r1
ในการศึกษาก่อนหน้านี้พบว่าทุกสายพันธุ์ ยกเว้น 2 V . harveyi
ทดสอบสายพันธุ์อื่นแล้ว
3-101 STD ,ที่แยกได้จากตัวอ่อนกุ้งในไทยและ
เอกวาดอร์ ตามลำดับ ชิ้นส่วนของดีเอ็นเอถูก
ยังสังเกตได้จากการทดสอบหลังจากทุกไอโซเลทสามารถใช้
ชุดใหม่ของไพรเมอร์ f2r2 และไพรเมอร์รวม
f2r1 ( 216 BP และ 1.2-kb ตามลำดับ ) ยกเว้น
2 Vibrio harveyi สายพันธุ์ที่ไม่ได้ให้ผล
คาดว่าผลิตภัณฑ์ที่มี f1r1 เหมือนกัน น่าสนใจ ,
308 bp amplified fragment ที่ผลิตโดย f1r2
primer ชุด V . harveyi ( IFO 15634 ) คือเสมอ
ได้ทั้งหมดสิบ ( 10 ) V . harveyi สายพันธุ์ คาดว่าคุณ BP วงดนตรีและเพิ่มเติม 600 bp และ
พบในโปรไฟล์ของสายพันธุ์หนึ่งจาก
เอกวาดอร์ ( STD 3-101 ) การแสดงของวงนี้ไม่สามารถอธิบายเพิ่มเติม

ในเวลานี้ทดสอบความจำเพาะของวิธี PCR ตรวจสอบโปรโตคอล

V . harveyi vhh สำหรับยีนที่เฉพาะเจาะจงของไพรเมอร์ชุดขยายสัญญาณ 308 BP
Vibrio harveyi vhh ยีนจำเพาะที่ก่อตั้งโดย
ใช้เป้าหมาย V . harveyi ที่ไม่ใช่เป้าหมาย Vibrio ชนิด
และหลายไม่ดีเอ็นเอแม่แบบ ( จำนวนข้อมูลไม่
แสดง ) และคาดว่าเป็นเพียงสังเกต
V . harveyi . ใช้ดีเอ็นเอแม่แบบจากที่ไม่ใช่เอกนาม
ชนิดและกุ้งกุลาดำ ( Penaeus monodon
) ไม่มีผลผลิต 308 bp และระบุว่าไม่มีผลในเชิงบวกเท็จ

จะได้แม้ในการปรากฏตัวของเหล่าดีเอ็นเอในตัวอย่างที่จะวิเคราะห์