2.3. Determination of mutation freq

2.3. Determination of mutation frequency and mutant classification
For the mutation frequency assay,cellswere harvested24 h after irradiation.Thecell pellets werewashed withPBSonceandtheDNA was extracted using standard methods. DNA was extracted from
mouse organs flash frozen in liquid nitrogen until use. DNA was isolated by standard phenol/chloroform extraction from pulverised tissues treated previously with proteinase K.
Mutant frequencies were determined as described earlier
[12]. Briefly, 10–20 ␮g of genomic DNA from lacZ-transgenic mice or fibroblasts was digested with HindIII and the lacZ- reporter plasmids recovered on magnetic beads pre-coated with a lacZ/lacI fusion protein. After washing, the plasmids were eluted with isopropylthio-␤-galactoside (IPTG) and recircularised with T4-ligase. Plasmid DNA was electroporated into the E. coli C strain (GalE−, LacZ). To determine the mutation frequency, the bacteria were plated on two different agars containing either 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-␤-d-galactopyranoside (X-gal) or phenyl-␤-d-galactopyranoside (P-gal). As mutant plasmids will only grow on the selective P-gal plate, the mutation frequency is calculated as the number of mutants divided by the number of total recovered plasmids (X-gal plate) multiplied by the appropri- ate dilution factor.
Mutant plasmids from the P-gal plate were transferred to 150 ␮l LB Medium in 96-well plates and cultured for at least 8 h before a colony-PCR for the lacZ gene was performed. PCR products were digested with AvaI and HindIII and the fragments were resolved on a 1% agarose gel. The mutation rate was corrected as previously described for HindIII star activity and cloning artefacts based on the restriction enzyme patterns [13]. Positive clones were sequenced directly or after mini preparation of plasmid DNA using the pre- viously described overlapping primers in the lacZ sequence [14]. Identical mutations due to clonal expansion of cells were counted only once.
2.4. Single cell gel electrophoresis assay (comet assay)
The comet assay was performed under alkaline conditions as described [15]. Briefly, frosted-end slides were coated with one layer of 1% normal melting agarose (NMA) in PBS, dried overnight and then covered with a second layer of 0.5% NMA. 5 × 105 har- vested fibroblasts were mixed with 0.7% low melting agarose and layered onto the prepared slides. Lysis carried out in the dark at 4 ◦C for 1 h followed by unwinding of the DNA under alkaline conditions for 20 min. Electrophoresis was for 20 min followed by neutralisation. After drying, slides were stained with 1 ␮M 4,6- diamidin-2-phenylindol (DAPI). Each data point is based on the analysis of at least 150 comets per coded sample. The scoring of the comets and the calculation of the tail moment ([percent of DNA in the tail] × [tail length]) was performed with the CASP software

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 การกำหนดความถี่การกลายพันธุ์และไอออนบวกจัดประเภทกลายพันธุ์สำหรับการทดสอบความถี่กลายพันธุ์เอช harvested24 cellswere หลังจากเม็ด irradiation.Thecell werewashed withPBSonceandtheDNA ถูกสกัดโดยใช้วิธีการมาตรฐาน ดีเอ็นเอที่สกัดจากอวัยวะเมาส์ชั้นเถ้าแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวจนการใช้งาน ดีเอ็นเอที่แยกได้จากมาตรฐานฟีนอล / สกัดคลอโรฟอร์มจากเนื้อเยื่อแหลกลาญรับการรักษาก่อนหน้านี้กับโปรเคความถี่กลายพันธุ์ได้รับการพิจารณาตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้[12] Brie ชั้นปี 10-20 ␮gของดีเอ็นเอจากหนูยีน lacZ-Fi หรือ broblasts ถูกย่อยด้วย HindIII และพลาสมิดนักข่าว lacZ- กู้คืนบนลูกปัดแม่เหล็กก่อนเคลือบด้วย lacZ / Laci โปรตีนฟิวชั่น หลังจากล้างพลาสมิดที่ถูกชะด้วย isopropylthio-␤-galactoside (IPTG) และ recircularised กับ T4-ลิกาเซ ดีเอ็นเอถูก electroporated เข้าไปในอีโคไลสายพันธุ์ C (GalE-? lacZ) การตรวจสอบความถี่การกลายพันธุ์ของเชื้อแบคทีเรียที่ถูกชุบสองสาหร่ายที่แตกต่างกันมีทั้ง 5 บรอมวิช-4-คลอร์ 3 indoxyl-␤-D-galactopyranoside (X-แกลลอน) หรือ phenyl-␤-D-galactopyranoside (P-แกลลอน ) ในฐานะที่เป็นพลาสมิดที่กลายพันธุ์จะเติบโตบนแผ่น P-แกลลอนเลือกความถี่การกลายพันธุ์ที่มีการคำนวณกับจำนวนของการกลายพันธุ์หารด้วยจำนวนของพลาสมิดหายทั้งหมด (แผ่น X-แกลลอน) คูณด้วย appropri- กินปัจจัยที่ทำให้เจือจาง. พลาสมิดกลายพันธุ์จาก แผ่น P-สาวถูกถ่ายโอนไป 150 ␮l LB กลางในแผ่น 96 หลุมและการเพาะเลี้ยงเป็นเวลาอย่างน้อย 8 ชั่วโมงก่อนอาณานิคม-PCR สำหรับยีน lacZ ได้ดำเนินการ ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกย่อยด้วย Avai และ HindIII และชิ้นส่วนได้รับการแก้ไขในเจล 1% agarose อัตราการกลายพันธุ์ได้รับการแก้ไขตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ว่าเป็นกิจกรรมที่ดาว HindIII และสิ่งของโคลนขึ้นอยู่กับรูปแบบการทำงานของเอนไซม์ข้อ จำกัด [13] โคลนมีลำดับขั้นตอนบวกโดยตรงหรือหลังการจัดทำมินิพลาสมิดดีเอ็นเอโดยใช้ก่อนอธิบาย viously ไพรเมอร์ที่ทับซ้อนกันในลำดับ lacZ เมื่อ [14] การกลายพันธุ์เหมือนกันเนื่องจากการขยายตัวของเซลล์ clonal นับเพียงครั้งเดียว. 2.4 เซลล์เดียวทดสอบข่าวคราว (การทดสอบดาวหาง) การวิเคราะห์ดาวหางได้ดำเนินการภายใต้เงื่อนไขที่อัลคาไลน์ตามที่อธิบายไว้ [15] Brie ชั้นปีสไลด์น้ำค้างแข็งสิ้นถูกเคลือบด้วยชั้นหนึ่งของ 1% agarose ละลายปกติ (NMA) ในพีบีเอสแห้งในชั่วข้ามคืนและปกคลุมด้วยชั้นที่สอง 0.5% NMA 5 × 105 กระบวนการทำงาน broblasts ไฟตกเป็นถูกผสมกับ 0.7% agarose ละลายต่ำและชั้นบนสไลด์ที่เตรียมไว้ สลายดำเนินการในที่มืดที่ 4 ◦Cเป็นเวลา 1 ชั่วโมงตามด้วยการคลี่คลายของดีเอ็นเอภายใต้เงื่อนไขที่อัลคาไลน์เป็นเวลา 20 นาที อิเล็กได้เป็นเวลา 20 นาทีตามด้วยการวางตัวเป็นกลาง หลังจากการอบแห้งภาพนิ่งถูกย้อมด้วยสี 1 ␮M 4, 6 diamidin-2-phenylindol (DAPI) แต่ละจุดข้อมูลจะขึ้นอยู่กับการวิเคราะห์อย่างน้อย 150 ดาวหางต่อตัวอย่างรหัส เกณฑ์การให้คะแนนของดาวหางและการคำนวณช่วงเวลาที่หาง ([เปอร์เซ็นต์ของดีเอ็นเอในหาง] × [หางยาว]) ได้ดำเนินการกับซอฟแวร์ CASP

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 การหาความถี่การกลายพันธุ์และกลายพันธุ์ classi จึงบวก
สำหรับการกลายพันธุ์ในระดับความถี่ , harvested24 H หลังการฉายรังสี thecell เม็ด werewashed withpbsonceandthedna ถูกสกัดด้วยวิธีมาตรฐาน ดีเอ็นเอจาก
อวัยวะเมาส์flเถ้าแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวจนใช้ดีเอ็นเอที่แยกได้โดยการสกัดฟีนอล / คลอโรฟอร์มมาตรฐานจาก pulverised เนื้อเยื่อรักษาก่อนหน้านี้กับโปรตีนกลายพันธุ์ K .
ความถี่กำหนดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้
[ 12 ] บรี fl Y , 10 – 20 ␮กรัมของดีเอ็นเอจากยีนหรือ lacz หนูจึง broblasts ถูกย่อยด้วย - และ lacz นักข่าวเพื่อกู้คืนในลูกปัดแม่เหล็กเคลือบก่อนด้วย lacz / laci โปรตีน .หลังจากล้าง , พลาสมิดมีตัวอย่างด้วย isopropylthio - ␤ - galactoside ( โปรตีน ) และ recircularised กับ T4 ไลเกส . พลาสมิดดีเอ็นเอ electroporated ใน E . coli สายพันธุ์ ( −  ซีเกล , lacz ) ศึกษาการกลายพันธุ์ในแบคทีเรียถูกชุบสองแตกต่างกัน agars ที่มีให้ 5-brom-4-chlor-3-indoxyl - ␤ - d-galactopyranoside ( x-gal ) ) หรือ - ␤ - d-galactopyranoside ( p-gal )เป็นพลาสมิดที่กลายพันธุ์จะเติบโตบนจาน p-gal เลือก การกลายพันธุ์ ความถี่ คำนวณเป็นตัวเลขของมนุษย์กลายพันธุ์ หารด้วยจำนวนทั้งหมดได้พลาสมิด ( จาน x-gal ) คูณด้วยเข้าท่า - กิน
ปัจจัยเจือจางที่กลายพันธุ์จากแผ่น p-gal พลาสมิดที่ถูกโอนไปยัง 150 ␮ล. ปอนด์ขนาดกลาง ใน 96 ดีจานเพาะเลี้ยงเป็นเวลาอย่างน้อย 8 ชั่วโมงก่อนอาณานิคมซึ่งยีน lacz กำหนด ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดจะถูกย่อยด้วยและพร้อม - และชิ้นส่วนถูกแก้ไขบนเจล ( 1 )การเปลี่ยนแปลงอัตราการได้รับการแก้ไขตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้สำหรับกิจกรรมดารา - การสรรหาตามรูปแบบเอนไซม์ [ 13 ] โคลนบวกเป็นลำดับโดยตรงหรือหลังจากมินิเตรียมพลาสมิดดีเอ็นเอโดยใช้ไพรเมอร์ก่อน viously อธิบายซ้อนใน lacz ลำดับ [ 14 ] การกลายพันธุ์เหมือนกันเนื่องจากผู้เผยแพร่ของเซลล์ถูกนับเพียงครั้งเดียว
2.4 .เซลล์เดี่ยว gel electrophoresis ใช้ดาวหางวิเคราะห์ )
ดาวหางวิเคราะห์แสดงภายใต้สภาวะด่างตามที่อธิบายไว้ [ 15 ] บรี fl Y , ฝ้าสไลด์ปลายถูกเคลือบด้วยหนึ่งชั้น 1 % ละลาย ( ปกติ ( นเ มเอ ) ใน PBS ค้างคืนแล้วครอบคลุมกับชั้นที่สองของ 0.5% นเ มเอ แห้ง 5 × 105 Har - อ้อมจึง broblasts ผสม 07 % และจุดหลอมเหลวต่ำ ( ชั้นยังเตรียมสไลด์ การสลายออกไปในความมืดที่ 4 ◦ C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ตามด้วยการคลี่คลายของดีเอ็นเอภายใต้สภาวะด่าง 20 นาที ตัวอย่างคือ 20 นาทีตามด้วยการทำให้เป็นกลาง . หลังจากการอบแห้ง , ภาพนิ่งถูกย้อมด้วยสี 1 ␮ M 4  , 6 - diamidin-2-phenylindol ( dapi )แต่ละจุดข้อมูลจะขึ้นอยู่กับการวิเคราะห์อย่างน้อย 150 ดาวหางต่อรหัสตัวอย่าง การให้คะแนนของดาวหาง และการคำนวณของหางช่วงเวลา ( [ ร้อยละของดีเอ็นเอในหาง ] × [ หางความยาว ] ) แสดงด้วย casp ซอฟต์แวร์