Total genomic DNA was extracted fro

Total genomic DNA was extracted from young leaves of mother and in vitro-propagated D. nobile plants following the method described by Murray and Thomson (1980) with some minor modifications. The quantity and purity of the isolated DNA were checked using a UV spectrophotometer (Perkin-Elmer Lambda 35). The ratio of absorbance at two wavelengths (A260 and A280) was compared with the standard ratio of pure DNA. The quantities of the DNA isolated were found to be optimum for further PCR amplification.

All the PCR reactions containing 40 ng of template DNA, 2 μM each of the four dNTPs, 1 × PCR buffer (10 mM Tris pH 9.0, 50 mM KCl), 2.5 mM of MgCl2, 1 U of Taq polymerase (Bangalore Genei, India) and 20 pmol of primer, were carried out in 25 μl volumes of 0.2 ml microfuge tubes (Dialabs). The reaction programs for RAPD were set at 94 °C for 3 min followed by 45 cycles of 94 °C for 45 s, 36 °C for 30 s, 36 °C for 45 s, and 72 °C for 5 min (Kumar et al., 2013) in a Veritti Thermal Cycler (Applied Biosystems, USA), and for SCoT at 94 °C for 4 min, followed by 35 cycles of 30 s at 94 °C, 1 min at 50 °C and 2 min at 72 °C, with a final extension at 72 °C for 5 min for SCoT (Bhattacharyya et al., 2013). After completion of the amplification, 2.5 μl of 10 × blue dye was added to the samples, and the amplified DNA was analyzed on 1.8% agarose gel in 1 × TAE buffer at 65–70 V for 3–4 h. DNA fragments were visualized under UV light and photographed using the Gel Documentation System (Biostep DH-20, Germany).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

รวม genomic DNA ที่สกัดจากใบอ่อนของแม่ และในหลอดเผยแพร่ไบล์ D. พืชต่อไปนี้อธิบายวิธีการ โดยเมอร์เรย์และทอม (1980) กับปรับเปลี่ยนบางอย่างเล็กน้อย ปริมาณและความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอที่แยกได้มีการตรวจสอบใช้แบบ UV เครื่องทดสอบกรดด่าง (35 แลมบ์ดาเพอร์เอลเมอ) อัตราส่วนของ absorbance ที่ความยาวคลื่นที่สอง (A260 และ A280) ได้เปรียบเทียบกับอัตราส่วนของดีเอ็นเอบริสุทธิ์มาตรฐาน พบปริมาณของดีเอ็นเอที่แยกต่างหากเพื่อให้เหมาะสมสำหรับการเพิ่มเติมขยาย PCRปฏิกิริยา PCR ทั้งหมดที่ประกอบด้วย 40 ng ของแม่แบบดีเอ็นเอ 2 μM ละของสี่ dNTPs บัฟเฟอร์ PCR 1 × (10 มม.ทริสเรทติ้ง pH 9.0, 50 mM KCl), 2.5 mM 1 U Taq พอลิเมอเรส (Genei บังกาลอร์ อินเดีย) MgCl2 และ pmol 20 พื้น ได้ดำเนินการจำนวนมาก μl 25 หลอด microfuge 0.2 ml (Dialabs) มีตั้งโปรแกรมปฏิกิริยาการอาร์เอพีดีที่ 94 ° C สำหรับตามวงจร 45 ของ 94 ° C สำหรับ 45 นาที 3 s, 36 ° C สำหรับ 30 s, 36 ° C การ 45 s, 72 ° C 5 นาที (Kumar et al., 2013) ในการ Veritti ความร้อน Cycler (ใช้ Biosystems สหรัฐอเมริกา), และสกอตแลนด์ที่ 94 ° C สำหรับ 4 นาที ตาม ด้วยรอบ 35 30 s ที่ 94 ° C , 1 นาที ที่ 50 ° C และ นาทีที่ 72 ° C ขยายสุดท้ายที่ 72 ° C สำหรับ 5 นาทีในสกอตแลนด์ (Bhattacharyya et al., 2013) 2 หลังจากเสร็จสิ้นการขยาย μl 2.5 ของสีย้อมได้เพิ่มตัวอย่าง และดีเอ็นเอเอาต์ถูกวิเคราะห์ใน 1.8% agarose เจลในบัฟเฟอร์เต้ 1 ×ที่ 65 – 70 V สำหรับชิ้นส่วนดีเอ็นเอ 3 – 4 h. × 10 มี visualized ภายใต้แสง UV และถ่ายภาพโดยใช้เจเอกสารประกอบระบบ (Biostep DH-20 เยอรมนี)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ดีเอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดจากใบอ่อนของแม่และในหลอดทดลอง-ขยายพันธุ์พืชดีบิเล่ต่อไปนี้วิธีการที่อธิบายโดยเมอร์เรและทอมสัน (1980) มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อยบางอย่าง ปริมาณและความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอที่แยกได้ถูกตรวจสอบโดยใช้ spectrophotometer ยูวี (เพอร์กินเอลเมอแลมบ์ดา 35) อัตราส่วนของการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นที่สอง (A260 และ A280) เมื่อเทียบกับอัตราส่วนมาตรฐานของดีเอ็นเอบริสุทธิ์ ปริมาณของดีเอ็นเอที่แยกพบว่ามีการที่เหมาะสมในการขยาย PCR ต่อไป. ทุกปฏิกิริยา PCR ที่มี 40 นาโนกรัมดีเอ็นเอแม่แบบ 2 ไมครอนแต่ละสี่ dNTPs 1 ×บัฟเฟอร์ PCR (10 มิลลิทริสพีเอช 9.0, 50 มิลลิ KCl) 2.5 มิลลิของ MgCl2 1 U ของโพลิเมอร์ Taq (บังกาลอร์ Genei, อินเดีย) และ 20 pmol ของไพรเมอร์ได้ดำเนินการใน 25 ไมโครลิตรปริมาณ 0.2 มล. หลอด microfuge (Dialabs) โปรแกรมปฏิกิริยาสำหรับ RAPD ถูกตั้งไว้ที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 นาทีตามด้วย 45 รอบของ 94 ° C เป็นเวลา 45 วินาที, 36 ° C เป็นเวลา 30 วินาที, 36 ° C เป็นเวลา 45 วินาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที (มาร์ต al., 2013) ใน Veritti Thermal Cycler (Applied Biosystems, สหรัฐอเมริกา) และสำหรับชาวสกอตที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 4 นาทีตามด้วย 35 รอบของ 30 วินาทีที่ 94 องศาเซลเซียส 1 นาทีที่ 50 องศาเซลเซียสและ 2 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียสมีนามสกุลสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีสำหรับชาวสกอต (Bhattacharyya et al., 2013) หลังจากเสร็จสิ้นการขยาย 2.5 ไมโครลิตร 10 ×ย้อมสีฟ้าถูกบันทึกอยู่ในตัวอย่างและดีเอ็นเอขยายวิเคราะห์บน 1.8% agarose เจลใน 1 ×บัฟเฟอร์ TAE ที่ 65-70 V 3-4 ชั่วโมง ดีเอ็นเอถูกมองเห็นภายใต้แสงยูวีและถ่ายภาพโดยใช้ระบบเอกสารเจล (ที่ Biostep DH-20, เยอรมนี)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

รวม genomic DNA ที่สกัดจากใบอ่อนของแม่และการเพาะขยายพันธุ์พืช . โนบิเล่ต่อวิธีการอธิบายโดย เมอร์เรย์ และ ทอมสัน ( 1980 ) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อยบาง ปริมาณและความบริสุทธิ์ของแยกดีเอ็นเอถูกใช้ UV Spectrophotometer ( เพอร์กินเอลเมอร์แลมบ์ดา 35 )อัตราส่วนของค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น ( และสอง a260 a280 ) เมื่อเทียบกับอัตราส่วนมาตรฐานของบริสุทธิ์ดีเอ็นเอ ปริมาณของดีเอ็นเอที่แยกได้พบเป็นที่เหมาะสมสำหรับการขยาย PCR ต่อไป

ทั้งหมดโดยปฏิกิริยาที่มี 40 นาโนดีเอ็นเอแม่แบบ 2 μ M แต่ละสี่ dntps บัฟเฟอร์ PCR 1 × ( 10 มม. นอกจากนี้ พีเอช 9.0 , 50 mm . ) , 2.5 มม. ชุด 1 คุณใช้ของทัค genei ( บังกาลอร์ ,อินเดีย ) และ 20 pmol ของไพรเมอร์ พบว่าในμ L ปริมาณ 0.2 มิลลิลิตร 25 microfuge หลอด ( dialabs ) ปฏิกิริยาโดยกำหนดโปรแกรมที่ 94 ° C เป็นเวลา 3 นาที ตามด้วย 45 รอบ 94 ° C 45 S 36 ° C 30 , 36 ° C เป็นเวลา 45 วินาที และ 72 ° C เป็นเวลา 5 นาที ( Kumar et al . , 2013 ) ใน veritti Thermal cycler ( Applied Biosystems , สหรัฐอเมริกา ) และหริภุญชัยที่ 94 ° C เป็นเวลา 4 นาทีตามด้วย 35 รอบ 30 s ที่ 94 ° C , 1 นาทีที่ 50 ° C และ 2 นาทีที่ 72 ° C กับส่วนขยายสุดท้ายที่ 72 ° C เป็นเวลา 5 นาทีสำหรับหริภุญชัย ( bhattacharyya et al . , 2013 ) หลังจากเสร็จสิ้นการเพิ่มปริมาณ 2.5 μ L 10 ×สีฟ้าสีก็เพิ่มจำนวน และแถบดีเอ็นเอถูกใช้ 1.8 % เจลในบัฟเฟอร์เท 1 × 65 - 70 V 3 - 4 ชั่วโมงชิ้นส่วนดีเอ็นเอได้มองเห็นแสงยูวีและถ่ายภาพโดยใช้ระบบเอกสารของเจล ( biostep dh-20 , เยอรมัน )