Modified microorganism for improved

Modified microorganism for improved production of alanine

This application claims priority to European Patent application 13182425.2 filed on
30.08.2013, which is incorporated herein by reference in its entirety. 5
The การประดิษฐ์นี้ relates to a modified microorganism from the family of Pasteurellaceae having an increased expression and/or increased activity of the enzyme alanine dehydrogenase that is encoded by the alaD-gene, to a method for producing alanine and to the use of modified microorganisms.
10
Amino acids are organic compounds with a carboxy-group and an amino-group. The most important amino acids are the alpha-amino acids where the amino group is located next to the carboxy group. Proteins are based on alpha-amino acids. Nine of the alpha-amino acids
are essential amino acids which can not be produced by mammals and needs to be 15 supplied with feed and food. L-alanine can be produced by fermentation with Coryneform
bacterias (Hermann, 2003: Industrial production of amino acids by Coryneform bacteria, J.
of Biotechnol, 104, 155-172.) or E.coli. (Zhang et al, Production of L-alanine by
metabolically engineered Escheria coli. (2007) Appl. Microbiol Biotechnol., 77:355-366). L-
Alanine is used in the pharmaceutical industry, veternar medicine and sweetner.
20
Alanin has drawn considerable interest because it has been used as an additive in the food, feed and pharmaceutical industries.

The industrial production of alanine by E.coli strains is applicable for chemical products. E. 25 coli is containing lipopolysachharide which can elicit strong immune responses. Therefore
use of E. coli to prepare material for human consumption and or pharmaceutical
applications such as infusion solutions is somewhat disfavoured. It is therefore preferred to
use bacterial strains for the production of feed and food products which are not derived from
a former human-pathogenic organism. Such an organism is the non-pathogenic genus
30 Basfia.

The industrial production of alanine by Coryneform bacterias is less efficient because
Corynebacterium is not capable to grow under anaerobic conditions and has a very low
productivity of alanin per g of biomass. Yamamoto et al. Applied and environmental 35 microbiology;78(12);4447-4457 show that aerobically grown cells which grow to high
density and are subsequently upconcentrated by a factor of 8,3 which are then
anaerobically incubated with glucose. However, since the two different phases for the
growth and production of alanine are needed in C. glutamicum the process is complex and
technically challenging.
40
Uhlenbusch, et al. (Applied and Environmental Microbiology Volume: 57 1360-1366, 1991) show that the organisms Zymomonas mobilis is capable of producing alanine after



PF 75583
2
transformation with and overexpression of an alanine dehydrogenase, however with low effeciency in only to two amounts (7,5g/I in 25h). It was fOund that a competition between alanine synthesis and ethanol production occurred. Production of alanine was also shown in
recombinant Lactococcus lactis, however yield productivity and usibility was found to be 5 limited (Nature Biotechnology, Volume: 17, 588-592, 1999).
One drawback in some organisms like lactococcus lactis is that alanine can be degraded to unwanted side products such as diacetyl and acetoin which decrease the yield (Journal of Applied Microbiology, Volume: 104, 171-177, 2008).
10
It is an object of the การประดิษฐ์นี้ to provide microorganisms which can be used for the fermentative production of alanine which ทททคือ lack the above disadvantages.
A contribution to achieving the above mentioned aim is provided by a modified 15 microorganism of the family of Pasteurellaceae having, compared to its wildtype, an
increased expression and/or activity of the enzyme that is encoded by the alanine
dehydrogenase gene. The alanine dehydrogenase gene is hereinafter also referred to as
alaD-gene.

20 Surprisingly, it has been discovered that an increase of the expression and/or activity of the
enzyme that is encoded by the a/aD-gene results in a recombinant Pasteurellaceae-strain that, compared to the corresponding microorganism in which the expression and/or activity of this enzyme has not been increased, is characterized by an increased yield of alanine. In contrast thereto W02009/024294 Basfia succinici producens is described producing
25 succinic acid.

A "wildtype" of a microorganism refers to a microorganism whose genome is present in a
state as before the introduction of a genetic modification of a certain gene, e.g. alaD-gene,
IdhA-gene, pflD-gene, pfIA-gene and/or pckA-gene. The genetic modification may be e.g. 30 an insertion of said gene into the genome as e.g. for alaD-gene. The genetic modification
may be e.g. a deletion of a gene or a part thereof or a point mutation, e.g. IdhA-gene, pflD-
gene, pfIA-gene and/or pckA-gene.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

จุลินทรีย์ปรับปรุงผลิตของอะลานีนโปรแกรมประยุกต์นี้อ้างความสำคัญกับสิทธิบัตรยุโรปประยุกต์ 13182425.2 ยื่นบน30.08.2013 ซึ่งเป็นส่วนประกอบซึ่ง โดยการอ้างอิงทั้งหมด 5การประดิษฐ์นี้เกี่ยวข้องกับจุลินทรีย์ที่ปรับเปลี่ยนจากตระกูล Pasteurellaceae ที่มีค่าเพิ่มขึ้น หรือเพิ่มกิจกรรมของ dehydrogenase อะลานีนเอนไซม์ที่ถูกเข้ารหัส โดย alaD-ยีน และใช้จุลินทรีย์ปรับเปลี่ยนวิธีการผลิตอะลานีน10กรดอะมิโนเป็นสารอินทรีย์กับกลุ่ม carboxy และอะมิโนกลุ่ม กรดอะมิโนสำคัญที่สุดคือ กรดอัลฟาอะมิโนที่มีกลุ่มอะมิโนอยู่กลุ่มที่ carboxy โปรตีนอยู่ในกรดอัลฟาอะมิโน 9 ของกรดอัลฟาอะมิโนมีกรดอะมิโนจำเป็นซึ่งไม่สามารถจะผลิต โดยการเลี้ยงลูกด้วยนม และต้องเป็น 15 ที่มากับอาหารและอาหาร L-อะลานีนสามารถผลิต โดยการหมักกับ Coryneform bacterias (แฮร์มันน์ 2003: ผลิตกรดอะมิโนโดยแบคทีเรีย Coryneform เจ ของ Biotechnol, 104, 155-172) หรือระบบ (Zhang et al ผลิตของอะลานีน L โดย metabolically วิศวกรรม Escheria coli (2007) ใช้ Microbiol Biotechnol. 77:355-366) L- อะลานีนใช้ในอุตสาหกรรมยา ยา veternar และ sweetner 20Alanin ได้ออกสนใจมากเนื่องจากมันถูกใช้เป็นการเสริมในอาหาร อาหารและอุตสาหกรรมยาการผลิตอุตสาหกรรมของอะลานีนโดยสายพันธุ์ระบบจะใช้เคมีภัณฑ์ E. 25 coli จะประกอบด้วย lipopolysachharide ซึ่งสามารถรับการตอบสนองภูมิคุ้มกันแข็งแรงขึ้น ดังนั้น ใช้ในการเตรียมวัสดุสำหรับมนุษย์บริโภคและหรือยา E. coli โปรแกรมประยุกต์เช่นโซลูชั่นคอนกรีตจะค่อนข้าง disfavoured จึงต้องการ ใช้แบคทีเรียสายพันธุ์สำหรับการผลิตผลิตภัณฑ์อาหารและอาหารที่ไม่ได้มาจาก มีชีวิตมนุษย์ pathogenic อดีต ตระกูลนี้ไม่ใช่ pathogenic มีชีวิตดังกล่าว30 Basfiaการผลิตอุตสาหกรรมของอะลานีนโดย Coryneform bacterias มีประสิทธิภาพน้อยเนื่องจาก Corynebacterium ไม่สามารถเจริญเติบโตภายใต้เงื่อนไขที่ไม่ใช้ออกซิเจน และได้ต่ำมาก ผลของ alanin ต่อกรัมของมวลชีวภาพ ยามาโมโตะ et al. ประยุกต์และจุลชีววิทยาสิ่งแวดล้อม 35; 78 (12) 4447-4457 แสดงว่า aerobically โตเซลล์ที่เติบโตสูง ความหนาแน่นและต่อ upconcentrated โดยตัวของ 8,3 ที่อยู่แล้ว anaerobically incubated กับกลูโคส อย่างไรก็ตาม ตั้งแต่ 2 ขั้นตอนต่าง ๆ สำหรับการ จำเป็นต่อการเจริญเติบโตและการผลิตของอะลานีนในซี glutamicum กระบวนการมีความซับซ้อน และ ความท้าทายทางเทคนิค40Uhlenbusch, et al. (ประยุกต์และปริมาณจุลชีววิทยาสิ่งแวดล้อม: 57 1360-1366, 1991) แสดงว่า ที่ชีวิต Zymomonas mobilis มีความสามารถในการผลิตอะลานีนหลัง PF 755832แปลงด้วยและ overexpression dehydrogenase เป็นอะลานีน อย่างไรก็ตามกับ effeciency ต่ำในเฉพาะในสองยอด (7, 5 กรัม / ฉันใน 25h) พบว่า การแข่งขันระหว่างอะลานีนสังเคราะห์และเอทานอลการผลิตเกิดขึ้น ผลิตของอะลานีนถูกแสดงในrecombinant Lactococcus lactis อย่างไรก็ตามผลผลิตผลผลิต และ usibility พบจะ จำกัด 5 (เทคโนโลยีชีวภาพธรรมชาติ ปริมาณ: 17, 588-592, 1999)คืนหนึ่งในสิ่งมีชีวิตบางอย่างเช่นอะลานีนที่เป็น lactococcus lactis สามารถเสื่อมโทรมผลิตภัณฑ์ข้างเคียงที่ไม่พึงประสงค์เช่น diacetyl และ acetoin ซึ่งลดลงจากผลตอบแทน (สมุดรายวันของใช้จุลชีววิทยา ปริมาณ: 104, 171-177, 2008)10เป็นวัตถุของการการประดิษฐ์นี้เพื่อให้จุลินทรีย์ที่สามารถใช้สำหรับการผลิต fermentative ของอะลานีนทททคือใดขาดข้อเสียข้างต้นร่วมบรรลุเป้าหมายข้างต้นกล่าวถึงจุดมุ่งหมายโดยจุลินทรีย์ 15 ที่แก้ไขของ Pasteurellaceae มี เมื่อเทียบกับของ wildtype การ เพิ่มนิพจน์และ/หรือกิจกรรมของเอนไซม์ที่ถูกเข้ารหัส โดยอะลานีน dehydrogenase ยีน ยีน dehydrogenase อะลานีนซึ่งต่อไปนี้ยังเรียกว่า alaD-ยีน20 จู่ ๆ ก็พบที่เพิ่มนิพจน์และ/หรือกิจกรรมของการenzyme that is encoded by the a/aD-gene results in a recombinant Pasteurellaceae-strain that, compared to the corresponding microorganism in which the expression and/or activity of this enzyme has not been increased, is characterized by an increased yield of alanine. In contrast thereto W02009/024294 Basfia succinici producens is described producing25 succinic acid.A "wildtype" of a microorganism refers to a microorganism whose genome is present in a state as before the introduction of a genetic modification of a certain gene, e.g. alaD-gene, IdhA-gene, pflD-gene, pfIA-gene and/or pckA-gene. The genetic modification may be e.g. 30 an insertion of said gene into the genome as e.g. for alaD-gene. The genetic modification may be e.g. a deletion of a gene or a part thereof or a point mutation, e.g. IdhA-gene, pflD- gene, pfIA-gene and/or pckA-gene.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

จุลินทรีย์ดัดแปลงสำหรับการผลิตที่ดีขึ้นของอะลานีนโปรแกรมนี้อ้างความสำคัญกับการประยุกต์ใช้สิทธิบัตรยุโรป 13,182,425.2 ฟ้องใน 2013/08/30 ซึ่งจะนำมารวมไว้โดยอ้างอิงอย่างครบถ้วน 5 การประดิษฐ์นี้เกี่ยวข้องกับจุลินทรีย์ที่มีการปรับเปลี่ยนจากครอบครัวของ Pasteurellaceae มีการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นและ / หรือกิจกรรมที่เพิ่มขึ้นของ dehydrogenase อะลานีนเอนไซม์ที่มีการเข้ารหัสโดย alaD ยีนเพื่อให้วิธีการในการผลิตอะลานีนและการใช้งานของการปรับเปลี่ยน จุลินทรีย์. 10 กรดอะมิโนเป็นสารอินทรีย์ที่มี Carboxy กลุ่มและกลุ่มอะมิโน กรดอะมิโนที่สำคัญที่สุดคือกรดอัลฟาอะมิโนที่กลุ่มอะมิโนที่ตั้งอยู่ติดกับกลุ่ม Carboxy โปรตีนที่อยู่บนพื้นฐานของกรดอัลฟาอะมิโน เก้าของกรดอัลฟาอะมิโนที่มีกรดอะมิโนที่ไม่สามารถเลี้ยงลูกด้วยนมที่ผลิตโดยและจะต้องมี 15 มาพร้อมกับอาหารและอาหาร L-อะลานีนสามารถผลิตได้โดยการหมักด้วย Coryneform แบคทีเรีย (แฮร์มันน์, 2003: การผลิตภาคอุตสาหกรรมของกรดอะมิโนจากเชื้อแบคทีเรีย Coryneform เจของBiotechnol, 104, 155-172.) หรืออีโคไล (Zhang et al, การผลิตของ L-โดยอะลานีน. เมตาบอลิวิศวกรรม coli Escheria (2007) Appl Microbiol Biotechnol 77:.. 355-366) L- Alanine ถูกนำมาใช้ในอุตสาหกรรมยา, veternar แพทย์และ sweetner. 20 Alanin ได้รับความสนใจเป็นอย่างมากเพราะมันถูกนำมาใช้เป็นสารเติมแต่งในอาหารอาหารและอุตสาหกรรมยา. การผลิตภาคอุตสาหกรรมของอะลานีนโดยสายพันธุ์อีโคไลมีผลบังคับใช้ สำหรับผลิตภัณฑ์เคมี อีโคไลที่ 25 จะมี lipopolysachharide ซึ่งสามารถล้วงเอาการตอบสนองภูมิคุ้มกันแข็งแรง ดังนั้นการใช้เชื้อ E. coli ในการจัดเตรียมวัสดุสำหรับการบริโภคของมนุษย์และยาหรือการใช้งานเช่นการแก้ปัญหายาค่อนข้างdisfavoured มันจึงเป็นที่ต้องการที่จะใช้แบคทีเรียสายพันธุ์สำหรับการผลิตอาหารและผลิตภัณฑ์อาหารที่ไม่ได้มาจากอดีตชีวิตของมนุษย์ก่อให้เกิดโรค ดังกล่าวเป็นสิ่งมีชีวิตชนิดที่ไม่ทำให้เกิดโรค30 Basfia. การผลิตภาคอุตสาหกรรมของอะลานีนโดย Coryneform แบคทีเรียที่มีประสิทธิภาพน้อยลงเพราะCorynebacterium จะไม่สามารถที่จะเติบโตภายใต้เงื่อนไขการใช้ออกซิเจนและมีต่ำมากผลผลิตของalanin ต่อกรัมของชีวมวล ยามาโมโตะ, et al ประยุกต์และสิ่งแวดล้อม 35 จุลชีววิทยา; 78 (12); 4447-4457 แสดงให้เห็นว่าเซลล์ที่ปลูก aerobically ซึ่งเติบโตสูงความหนาแน่นและมีการupconcentrated ต่อมาโดยปัจจัยที่ 8,3 ซึ่งจะแล้วบ่มแบบไม่ใช้อากาศที่มีน้ำตาลกลูโคส แต่เนื่องจากทั้งสองขั้นตอนที่แตกต่างกันสำหรับการเจริญเติบโตและการผลิตอะลานีนที่มีความจำเป็นใน C. glutamicum กระบวนการที่ซับซ้อนและความท้าทายทางเทคนิค. 40 Uhlenbusch, et ​​al (ประยุกต์และปริมาณจุลชีววิทยาสิ่งแวดล้อม: 57 1360-1366, 1991) แสดงให้เห็นว่าสิ่งมีชีวิต Zymomonas mobilis ที่มีความสามารถในการผลิตอะลานีนหลังจากPF 75583 2 การเปลี่ยนแปลงกับการแสดงออกของอะลานีนดีไฮโดรจี แต่มีประสิทธิภาพการอยู่ในระดับต่ำเพียงสองจำนวน (7, 5g / I ใน 25H) พบว่าการแข่งขันระหว่างการสังเคราะห์อะลานีนและเอทานอลการผลิตที่เกิดขึ้น การผลิตอะลานีนยังถูกนำมาแสดงในlactis Lactococcus recombinant แต่ผลผลิตและผลผลิต usibility พบว่ามี 5 จำกัด (เนเจอร์เทคโนโลยีชีวภาพระดับเสียง: 17 588-592, 1999). คืนหนึ่งในสิ่งมีชีวิตเช่น Lactococcus lactis คืออะลานีนสามารถ เสื่อมโทรมกับผลิตภัณฑ์ด้านที่ไม่พึงประสงค์เช่น diacetyl และ acetoin ซึ่งลดลงผลผลิต (วารสารจุลชีววิทยาประยุกต์เล่ม: 104, 171-177, 2008). 10 มันเป็นวัตถุของการประดิษฐ์นี้เพื่อให้จุลินทรีย์ที่สามารถนำมาใช้สำหรับการที่ การผลิตหมักของอะลานีนซึ่งทททคือไม่มีข้อเสียดังกล่าวข้างต้น. ผลงานเพื่อให้บรรลุจุดมุ่งหมายดังกล่าวข้างต้นจะให้บริการโดยจุลินทรีย์ที่ 15 แก้ไขของครอบครัว Pasteurellaceae มีเมื่อเทียบกับ wildtype ของการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นและ/ หรือกิจกรรมของเอนไซม์ ที่มีการเข้ารหัสโดยอะลานีนยีนdehydrogenase ยีน dehydrogenase อะลานีนซึ่งต่อไปนี้จะเรียกว่าalaD ยีน. 20 น่าแปลกที่จะได้รับการค้นพบว่าการเพิ่มขึ้นของการแสดงออกและ / หรือการทำงานของเอนไซม์ที่ถูกเข้ารหัสโดยที่ผล/ โฆษณายีนใน Pasteurellaceae- recombinant สายพันธุ์ที่เมื่อเทียบกับจุลินทรีย์ที่สอดคล้องกันในการแสดงออกและ / หรือการทำงานของเอนไซม์นี้ไม่ได้รับเพิ่มขึ้นโดดเด่นด้วยอัตราผลตอบแทนที่เพิ่มขึ้นของอะลานีน ในทางตรงกันข้ามการขออนุญาต W02009 / 024,294 Basfia succinici producens จะอธิบายการผลิต25 กรดซั. A "wildtype" ของจุลินทรีย์หมายถึงจุลินทรีย์ที่มีจีโนมที่มีอยู่ในรัฐก่อนที่จะนำการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมของยีนบางอย่างเช่นalaD- ยีนIdhA-ยีน pflD-ยีน pfIA ยีนและ / หรือ pckA ยีน การปรับเปลี่ยนพันธุกรรมอาจจะเช่น 30 แทรกของยีนดังกล่าวลงในจีโนมเป็นเช่นสำหรับ alaD-ยีน การปรับเปลี่ยนพันธุกรรมอาจจะเช่นการลบของยีนหรือบางส่วนดังกล่าวหรือการกลายพันธุ์จุดเช่น IdhA-ยีน pflD- ยีน pfIA ยีนและ / หรือ pckA ยีน