3.2. Comparison of assays to determ

3.2. Comparison of assays to determine glucomannan content in KGM samples

Determination of the glucomannan (or reducing sugar) content using the 3,5-DNS (Farhoosh and Riazi, 2007, Lindsay, 1973 and Miller, 1959), phenol–sulphuric acid (Cuesta et al., 2003 and Dubois et al., 1956) and enzymatic (Tekinsen & Guner, 2010) colorimetric assays have been previously reported in the literature. The current study compared the reproducibility and accuracy of these three methods, followed by further validation studies to determine the best assay method for quantification of the glucomannan content of KGM samples.

Both glucose and mannose standard curves were constructed for the 3,5-DNS (Fig. 1) and phenol–sulphuric acid (Fig. 2) colorimetric assays, in order to compare the sensitivity of the assay systems to each sugar. From the gradient of the calibration curves, it was found that mannose has a slightly lower sensitivity compared to glucose in both assay systems. Therefore, a correction factor for mannose sugar, i.e. 1.03 [1/2.6 + (1.6/2.6 × 0.4891/0.4666)] and 1.07 [1/2.6 + (1.6/2.6 × 0.0156/0.0139)] was determined for each method and employed in Eqs. (1) and (2), respectively. These correction factors were derived from the gradient of the constructed standard curves for both sugars and the typical glucose to mannose ratio (1:1.6) reported in KGM ( Maeda et al., 1980 and Shimahara et al., 1975).
Table 1 shows the glucomannan content of both samples as determined by the 3,5-DNS, phenol–sulphuric acid and enzymatic colorimetric assays, ranged from 50.9 to 53.9% (CKF) and 89.9 to 97.9% (LVKF); 45.4 to 59.2% (CKF) and 84.5 to 99.6% (LVKF); and 28.7 to 31.6% (CKF) and 41.1 to 45.4% (LVKF), respectively. There were no significant differences in the mean glucomannan values obtained from each of the 3,5-DNS and enzymatic colorimetric assays between the two occasions, indicating that both assay methods are more reproducible compared to the phenol–sulphuric acid colorimetric assay. Cuesta et al. (2003) has previously reported that the reproducibility of the phenol–sulphuric acid assay is highly dependent on the modality of sulphuric acid addition, either directly over the liquid surface or over the side of the tube. Furthermore, the speed of acid addition has also been shown to be critical. Saha and Brewer (1994) demonstrated that rapid addition of acid generates sufficient heat to break all the glycosidic bonds in complex carbohydrates. Clearly, the reproducibility of this method is an issue given the difficulty in the precise addition of the acid to produce consistent results, as shown in the current study, which was performed according to Dubois's protocol.
In terms of accuracy, the glucomannan contents of both CKF and LVKF determined by the 3,5-DNS and phenol–sulphuric acid assays were in reasonable agreement to the previously reported values for both samples (49–60% and >98%, respectively), compared to the enzymatic colorimetric assay which yielded a considerable lower result for LVKF (∼43%), despite its high reproducibility. As mentioned in Section 2.4.3, an error for the FEV value involved in the final calculation of KGM content using the glucomannan assay kit was encountered in the current study. If the incorrect FEV value (i.e. 250 ml), as cited in the kit instruction booklet was applied to our data, the resultant glucomannan content will be 2.5 fold (i.e. around 100%) higher than the current results. The reason for the low results obtained using this assay kit is unclear, and it is possible that the enzymatic reactions involved were incomplete, and therefore, further studies are needed to investigate and optimise the experimental conditions employed in this assay method.

Based upon the analysis as mentioned above, it was hence concluded that the 3,5-DNS colorimetric assay was the most reproducible and accurate among the three methods used and further validation studies were performed subsequently to investigate its accuracy and precision in more depth. A plot of mean absorbance against the NKF concentrations, as shown in Fig. 3, was linearly dependent on the concentration in the range from 0.5 to 12.5 mg/ml with a correlation coefficient of 0.997 and RSD ranging from 0.6 to 10.2% (Table 2). These data demonstrate a high precision of results obtained using the 3,5-DNS colorimetric assay. Moreover, the overall recoveries for glucomannan were found to be between 97 and 103% across the three spiking levels (250, 500 and 750 μg/g) of starch, with RSD ranged from 5.6 to 8.1%. From these data, it was confirmed that the 3,5-DNS colorimetric assay was the method of choice both in terms of reproducibility, accuracy and precision for the determination of the glucomannan content of KGM samples in the later stages of the study.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3.2. การเปรียบเทียบ assays เพื่อกำหนดเนื้อหา glucomannan ในตัวอย่าง KGMเนื้อหาของการ glucomannan (หรือลดน้ำตาล) ใช้ DNS 3.5 (Farhoosh และ Riazi, 2007, Lindsay, 1973 และมิลเลอร์ 1959), ฟีนอล – ซัลฟูริกกรด (Cuesta et al. 2003 และ Dubois et al. 1956) และเอนไซม์ (Tekinsen & Guner, 2010) assays สีมีการรายงานก่อนหน้านี้ในวรรณคดี การศึกษาปัจจุบันเปรียบเทียบการแสดงและความถูกต้องของวิธีการทั้งสาม ตาม ด้วยสอบศึกษาต่อเพื่อกำหนดวิธีการทดสอบที่ดีที่สุดสำหรับด้านเนื้อหา glucomannan KGM อย่างกลูโคสและ mannose กราฟมาตรฐานถูกสร้างขึ้นสำหรับ 3.5-DNS (1 รูป) และกรดฟีนอล – ซัลฟุริก (รูป 2) เคียง assays เพื่อเปรียบเทียบความไวของระบบทดสอบน้ำตาลแต่ละ จากการไล่ระดับโค้งเทียบ พบ mannose ที่มีความไวต่ำเล็กน้อยเมื่อเทียบกับกลูโคสในระบบทดสอบทั้งสอง ดังนั้น ปัจจัยแก้ไขน้ำตาล mannose, 1.03 เช่น [1/2.6 + (1.6/2.6 × 0.4891/0.4666)] และ 1.07 [1/2.6 + (1.6/2.6 × 0.0156/0.0139)] ถูกกำหนดสำหรับแต่ละวิธี และใน Eqs (1) และ (2), ตามลำดับ แก้ไขปัจจัยเหล่านี้ได้มาจากการไล่ระดับสีของกราฟมาตรฐานสร้างน้ำตาลและกลูโคสปกติอัตรา mannose (1:1.6) รายงานใน KGM (Maeda et al. 1980 และชิมาฮาร่า et al. 1975)ตารางที่ 1 แสดง glucomannan ทั้งสองอย่างตามที่กำหนด 3.5-DNS ฟีนอล – ซัลฟูริกกรด และเอนไซม์เคียง assays อยู่ในช่วงจาก 50.9 53.9% (CKF) และ 89.9 97.9% (LVKF); 45.4 59.2% (CKF) และ 84.5 99.6% (LVKF); และ 28.7 31.6% (CKF) และ 41.1 ถึง 45.4% (LVKF), ตามลำดับ มีสำคัญไม่มีความแตกต่างของค่าเฉลี่ย glucomannan ได้จาก 3.5-DNS และเอนไซม์เคียง assays ระหว่างโอกาสสอง ระบุว่า ทั้ง assay วิธีจะจำลองมากขึ้นเมื่อเทียบกับทดสอบสีกรดซัลฟิวริกฟีนอล Cuesta et al. (2003) ก่อนหน้านี้มีรายงาน reproducibility ของทดสอบกรดฟีนอล – ซัลฟิวริกพึ่งของนอกจากนี้กรดซัลฟุริก สูง เหนือผิวของเหลวโดยตรง หรือ ผ่านด้านข้างของหลอด นอกจากนี้ ความเร็วของกรดยังได้การแสดงที่มีความสำคัญ บริษัทสหและเบียร์ (1994) แสดงให้เห็นว่า เพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วของกรดสร้างความร้อนเพียงพอจะทำลายพันธะ glycosidic ทั้งคาร์โบไฮเดรตที่ซับซ้อน อย่างชัดเจน reproducibility ของวิธีนี้คือ ปัญหารับความยากลำบากในการเพิ่มกรดเพื่อให้ได้ผลลัพธ์สอดคล้อง แม่นยำดังที่ปรากฏในการศึกษาปัจจุบัน ซึ่งทำตามของ Dubois โพรโทคอลในแง่ของความถูกต้อง เนื้อหา glucomannan CKF และ LVKF กำหนด DNS 3.5 และ assays กรดฟีนอล – ซัลฟุริกได้ในข้อตกลงที่เหมาะสมกับค่าที่รายงานไปก่อนหน้านี้สำหรับตัวอย่างทั้งสอง (49 – 60% และ > 98% ตามลำดับ), เมื่อเทียบกับการทดสอบสีเอนไซม์ซึ่งผลผลต่ำมากสำหรับ LVKF (∼43%), แม้ มีความสามารถสูง ขึ้น ดังกล่าวในส่วน 2.4.3 เกิดข้อผิดพลาดเกี่ยวข้องในการคำนวณขั้นสุดท้ายของเนื้อหา KGM ที่ใช้โดยใช้ชุดทดสอบ glucomannan ค่า FEV ในการศึกษาปัจจุบัน ถ้าไม่ถูกต้องค่า FEV (เช่น 250 มิลลิลิตร), เป็นอ้างอิงในคู่มือชุดกับข้อมูลของเรา glucomannan ผลลัพธ์เนื้อหาจะพับ 2.5 (เช่นประมาณ 100%) สูงกว่าผลลัพธ์ปัจจุบัน เหตุผลสำหรับผลลัพธ์ต่ำได้โดยใช้ชุดทดสอบนี้ไม่ชัดเจน และเป็นไปได้ว่า ปฏิกิริยาเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องไม่สมบูรณ์ และดังนั้น ศึกษาต่อจะต้องตรวจสอบ และปรับปรุงเงื่อนไขการทดลองที่ใช้ในการทดสอบวิธีนี้Based upon the analysis as mentioned above, it was hence concluded that the 3,5-DNS colorimetric assay was the most reproducible and accurate among the three methods used and further validation studies were performed subsequently to investigate its accuracy and precision in more depth. A plot of mean absorbance against the NKF concentrations, as shown in Fig. 3, was linearly dependent on the concentration in the range from 0.5 to 12.5 mg/ml with a correlation coefficient of 0.997 and RSD ranging from 0.6 to 10.2% (Table 2). These data demonstrate a high precision of results obtained using the 3,5-DNS colorimetric assay. Moreover, the overall recoveries for glucomannan were found to be between 97 and 103% across the three spiking levels (250, 500 and 750 μg/g) of starch, with RSD ranged from 5.6 to 8.1%. From these data, it was confirmed that the 3,5-DNS colorimetric assay was the method of choice both in terms of reproducibility, accuracy and precision for the determination of the glucomannan content of KGM samples in the later stages of the study.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3.2 การเปรียบเทียบการตรวจเพื่อตรวจสอบเนื้อหาในตัวอย่าง glucomannan KGM การกำหนด glucomannan (หรือลดน้ำตาล) เนื้อหาโดยใช้ 3,5-DNS (Farhoosh และ Riazi 2007, Lindsay, ปี 1973 และมิลเลอร์, 1959), กรดซัลฟูริกฟีนอล (Cuesta et al., 2003 และบัว et al., 1956) และเอนไซม์ (Tekinsen และ Guner 2010) การตรวจสีได้รับการรายงานก่อนหน้านี้ในวรรณคดี การศึกษาในปัจจุบันเมื่อเทียบกับการทำสำเนาและความถูกต้องของทั้งสามวิธีตามด้วยการศึกษาการตรวจสอบต่อไปเพื่อกำหนดวิธีการทดสอบที่ดีที่สุดสำหรับปริมาณของเนื้อหาที่ glucomannan ตัวอย่าง KGM. ทั้งกลูโคสและแมนโนสโค้งมาตรฐานที่ถูกสร้างขึ้นสำหรับ 3,5-DNS ( รูปที่. 1) และกรดซัลฟูริกฟีนอล (รูปที่. 2) การตรวจสีในการสั่งซื้อเพื่อเปรียบเทียบความไวของระบบทดสอบเพื่อน้ำตาลแต่ละ จากการไล่ระดับสีของเส้นโค้งการสอบเทียบที่พบว่าแมนโนสมีความไวลดลงเล็กน้อยเมื่อเทียบกับระดับน้ำตาลทั้งในระบบการทดสอบ ดังนั้นปัจจัยการแก้ไขสำหรับน้ำตาลแมนโนสคือ 1.03 [1 / 2.6 + (1.6 / 2.6 × 0.4891 / 0.4666)] และ 1.07 [1 / 2.6 + (1.6 / 2.6 × 0.0156 / 0.0139)] ถูกกำหนดสำหรับแต่ละวิธีและการจ้างงาน ใน EQS (1) และ (2) ตามลำดับ ปัจจัยการแก้ไขเหล่านี้ได้มาจากการไล่ระดับของการสร้างเส้นโค้งมาตรฐานทั้งน้ำตาลและน้ำตาลกลูโคสทั่วไปอัตราส่วนแมนโนส (1: 1.6) (.. ดะ et al, 1980 และ Shimahara, et al, 1975). รายงานใน KGM ตารางที่ 1 แสดงให้เห็นว่า เนื้อหา glucomannan ของกลุ่มตัวอย่างทั้งสองที่กำหนดโดย 3,5-DNS กรดซัลฟูริกฟีนอลและการตรวจสีเอนไซม์อยู่ในช่วง 50.9-53.9% (CKF) และ 89.9-97.9% (LVKF); 45.4-59.2% (CKF) และ 84.5-99.6% (LVKF); และ 28.7-31.6% (CKF) และ 41.1-45.4% (LVKF) ตามลำดับ ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในค่าเฉลี่ย glucomannan ที่ได้รับจากแต่ละ 3,5-DNS และการตรวจเอนไซม์สีระหว่างสองครั้งก็แสดงให้เห็นว่าทั้งสองวิธีการทดสอบมีความสามารถทำซ้ำได้มากขึ้นเมื่อเทียบกับกรดซัลฟูริกฟีนอลทดสอบสี Cuesta et al, (2003) มีรายงานก่อนหน้านี้ว่าการทำสำเนาของการทดสอบกรดซัลฟูริกฟีนอลจะสูงขึ้นอยู่กับกิริยาของการเติมกรดซัลฟูริกทั้งโดยตรงผ่านพื้นผิวของเหลวหรือด้านข้างของหลอด นอกจากนี้ความเร็วของการเติมกรดยังได้แสดงให้เห็นว่ามีความสำคัญ เครือสหพัฒน์และบรูเออร์ (1994) แสดงให้เห็นว่านอกจากนี้อย่างรวดเร็วของกรดสร้างความร้อนเพียงพอที่จะทำลายทุก glycosidic พันธบัตรในคาร์โบไฮเดรตที่ซับซ้อน เห็นได้ชัดว่าการทำสำเนาของวิธีการนี้เป็นเรื่องที่ได้รับความยากลำบากในการเพิ่มความแม่นยำของกรดในการผลิตผลลัพธ์ที่สอดคล้องกันดังแสดงในการศึกษาในปัจจุบันซึ่งได้รับการดำเนินการตามโปรโตคอลบัวของ. ในแง่ของความถูกต้องเนื้อหา glucomannan ของทั้งสอง CKF และ LVKF กำหนดโดย 3,5-DNS และฟีนอลซัลฟูริกกรดตรวจอยู่ในข้อตกลงที่เหมาะสมกับค่ารายงานก่อนหน้านี้สำหรับตัวอย่างทั้งสอง (49-60% และ> 98% ตามลำดับ) เมื่อเทียบกับการทดสอบสีเอนไซม์ซึ่งให้ผล ผลที่ต่ำกว่ามากสำหรับการ LVKF (~43%) แม้จะมีการทำซ้ำสูง ตามที่ระบุไว้ในข้อ 2.4.3 ข้อผิดพลาดสำหรับค่า FEV มีส่วนร่วมในการคำนวณสุดท้ายของเนื้อหา KGM ใช้ทดสอบ glucomannan ชุดที่ถูกพบในการศึกษาในปัจจุบัน ถ้าค่า FEV ไม่ถูกต้อง (เช่น 250 มล.) ในกรณีที่คำสั่งหนังสือชุดถูกนำไปใช้ข้อมูลของเราเนื้อหา glucomannan ผลลัพธ์จะเป็น 2.5 เท่า (คือประมาณ 100%) สูงกว่าผลในปัจจุบัน เหตุผลเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ต่ำที่ได้รับโดยใช้ชุดทดสอบนี้ก็ไม่มีความชัดเจนและเป็นไปได้ว่าปฏิกิริยาของเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการไม่สมบูรณ์และดังนั้นการศึกษาเพิ่มเติมที่จำเป็นในการตรวจสอบและเพิ่มประสิทธิภาพการเงื่อนไขการทดลองใช้ในการวิธีการทดสอบนี้. ขึ้นอยู่กับการวิเคราะห์ ดังกล่าวข้างต้นจึงสรุปด้วยเหตุว่า 3,5-DNS ทดสอบสีเป็นส่วนใหญ่ทำซ้ำและถูกต้องในสามวิธีการที่ใช้และการศึกษาตรวจสอบต่อไปต่อมาได้ดำเนินการในการตรวจสอบความถูกต้องและความแม่นยำในเชิงลึกเพิ่มเติม พล็อตของการดูดกลืนแสงเฉลี่ยกับความเข้มข้น NKF ดังแสดงในรูปที่ 3 เป็นเส้นตรงขึ้นอยู่กับความเข้มข้นในช่วง 0.5-12.5 mg / ml มีค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของ 0.997 และ RSD ตั้งแต่ 0.6-10.2% (ตารางที่ 2) ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นถึงความแม่นยำสูงของผลที่ได้รับใช้ 3,5-DNS ทดสอบสี นอกจากนี้การฟื้นตัวโดยรวมสำหรับ glucomannan พบว่าอยู่ระหว่าง 97 และ 103% ในสามระดับ spiking (250, 500 และ 750 ไมโครกรัม / กรัม) แป้งกับ RSD อยู่ในช่วง 5.6-8.1% จากข้อมูลเหล่านี้จะได้รับการยืนยันว่าการทดสอบสี 3,5-DNS เป็นวิธีการเลือกทั้งในแง่ของการทำสำเนาถูกต้องและความแม่นยำในการกำหนดเนื้อหา glucomannan ตัวอย่าง KGM ในขั้นตอนต่อมาของการศึกษา