Twenty-five whole guts were used fo

Twenty-five whole guts were used for DNA extraction (Qiagen
DNeasy Blood and Tissue Kit; Valencia, CA). The V3 hypervariable
region of the 16S rRNA genewas amplified using universal primers:
U341F-CCTACGGGRSGCAGCAG and U519RGWATTACCGCGGCKGCAG
(modified from: Wang and Qian, 2009).
Pools of 6 PCR reactions (20mL/reaction ¼ 120 mL total) per treatment
per colony were created and concentrated using a standard
sodium acetate/ethanol DNA precipitation protocol. The resulting
~180 bp fragments were then cloned into the pGEM-T easy vector
using the pGEM-T easy Vector System I (Madison, WI). White colonies
were PCR-screened for inserts using GoTaq Green Master Mix
(Promega; Madison, WI) and standard M13 primers (Table S1).
Clones containing the correct-sized insert were grown individually
overnight in LB broth with ampicillin to make glycerol stocks for
future sequencing. Ninety-six clones were picked for each treatment/
colony. In total, 1536 clones were sequenced.
Deep-well glycerol plates were inoculated from individual clone
glycerol stocks and submitted for high-throughput Sanger
sequencing by the Purdue University Genomics Core Facility.
Resulting sequences were trimmed and compared to NCBI's
nucleotide sequence database to ascertain clone identity. Sequences
were then compared across the treatment groups and
replicates to identify unique sequences. An unexpected artifact of
using degenerate 16S rDNA primers was the amplification of host
18s rDNA. As a result, the clone library from each treatment contained
clones identifying as host. These host sequences were
filtered out leaving only prokaryotic clones in the library for subsequent
analyses. A total of 379 unique sequences were identified
from an entire library of 1475 clones across all five treatments
groups.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ใช้สำหรับการสกัดดีเอ็นเอ (Qiagen กึ๋นทั้งยี่สิบห้าDNeasy เลือดและเนื้อเยื่อชุด Valencia, CA) V3 hypervariableภูมิภาค 16S rRNA genewas ขยายโดยใช้ไพรเมอร์สากล:U341F-CCTACGGGRSGCAGCAG และ U519RGWATTACCGCGGCKGCAG(จาก: วังและเคียน 2009)กลุ่ม 6 PCR ปฏิกิริยา (20mL/ปฏิกิริยา รวมมล ¼ 120) ต่อการรักษาต่ออาณานิคมสร้างขึ้น และเข้มข้นโดยใช้มาตรฐานโซเดียม acetate/เอ ทานอลดีเอ็นเอฝนโพรโทคอลการ การส่งผลบางส่วนของ bp ~ 180 ถูกแล้วโคลนเป็นเวกเตอร์กลาย pGEM Tโดยใช้ระบบ pGEM T ง่ายเวกเตอร์ (เมดิสัน WI) ของฉัน อาณานิคมสีขาวถูกฉาย PCR สำหรับแทรกใช้ผสมหลักสีเขียว GoTaq(Promega เมดิสัน WI) และไพรเมอร์ M13 มาตรฐาน (ตาราง S1)โคลนที่ประกอบด้วยแทรกแก้ไขขนาดได้เติบโตขึ้นทีละนอนในซุปปอนด์กับแอมพิซิลลินเพื่อให้กลีเซอรหุ้นลำดับในอนาคต ไนน์ตี้ซิกซ์โคลนได้รับการรักษาแต่ละ /โคโลนี 1536 โคลนถูกเรียงลำดับทั้งหมดแผ่นบาดาลกลีเซอรถูก inoculated จากโคลนแต่ละกลีเซอรสะท้อน และส่ง Sanger อัตราความเร็วสูงจัดลำดับ โดยอำนวยความสะดวกหลัก Genomics มหาวิทยาลัยเพอร์ดูลำดับที่ได้ถูกตัด และเปรียบเทียบกับของ NCBIฐานข้อมูลลำดับนิวคลีโอไทด์จะตรวจตัวโคลน ลำดับได้แล้วเปรียบเทียบระหว่างกลุ่มบำบัด และเหมือนกับการระบุลำดับเฉพาะ สิ่งประดิษฐ์ไม่คาดคิดของใช้ไพรเมอร์ degenerate 16S rDNA ถูกขยายของโฮสต์18s rDNA ดัง รีโคลนจากทรีตเมนท์อยู่โคลนที่ระบุเป็นโฮสต์ ลำดับโฮสต์เหล่านี้ได้กรองออกออกจากโคลน prokaryotic เฉพาะในไลบรารีในเวลาต่อมาวิเคราะห์ มีระบุจำนวนเฉพาะลำดับ 379จากการไลบรารีทั้งหมด 1475 โคลนทั้งรักษาทั้งหมด 5กลุ่ม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ยี่สิบห้ากล้าทั้งหมดถูกนำมาใช้ในการสกัดดีเอ็นเอ (Qiagen
DNeasy เลือดและเนื้อเยื่อชุด; วาเลนเซีย, CA) hypervariable V3
พื้นที่ของ 16S rRNA genewas ขยายโดยใช้ไพรเมอร์สากล:
U341F-CCTACGGGRSGCAGCAG และ U519RGWATTACCGCGGCKGCAG
(แก้ไขจาก: วังและ Qian 2009).
สระว่ายน้ำ 6 ปฏิกิริยา PCR (20 มล / ปฏิกิริยา¼ 120 มิลลิลิตรรวม)
ต่อการรักษาต่ออาณานิคมที่ถูกสร้างขึ้นและเข้มข้นโดยใช้มาตรฐาน
acetate โซเดียม / เอทานอลโพรโทคอตกตะกอนดีเอ็นเอ ผล
~ 180 bp เศษถูกโคลนจากนั้นเข้าสู่ pGEM-T
เวกเตอร์ง่ายใช้pGEM-T ง่ายระบบเวกเตอร์ฉัน (Madison, WI) โคโลนีสีขาวถูก PCR-คัดกรองแทรกใช้ GoTaq กรีนโทผสม. (Promega; Madison, WI) และไพรเมอร์ M13 มาตรฐาน (ตาราง S1) โคลนนิ่งที่มีแทรกที่ถูกต้องขนาดปลูกเป็นรายบุคคลค้างคืนในน้ำซุป LB กับ ampicillin ที่จะทำให้หุ้นกลีเซอรอลสำหรับ ลำดับในอนาคต โคลนเก้าสิบหกถูกเลือกสำหรับการรักษาแต่ละ / อาณานิคม รวม 1536 โคลนมีลำดับขั้นตอน. ลึกดีแผ่นกลีเซอรอลถูกเชื้อจากบุคคลโคลนหุ้นกลีเซอรอลและส่งเพื่อส่งผ่านสูงแซงเจอร์ลำดับโดยมหาวิทยาลัยเพอร์ดูฟังก์ชั่นหลักของสิ่งอำนวยความสะดวก. ลำดับส่งผลให้ถูกตัดและเมื่อเทียบกับ NCBI ของฐานข้อมูลลำดับเบสเพื่อยืนยันโคลนตัวตน ลำดับนั้นถูกนำมาเปรียบเทียบในกลุ่มการรักษาและการลอกเลียนแบบเพื่อระบุลำดับที่ไม่ซ้ำกัน สิ่งประดิษฐ์ที่ไม่คาดคิดของการใช้ไพรเมอร์เลว 16S rDNA เป็นเครื่องขยายเสียงของโฮสต์ 18s rDNA เป็นผลให้ห้องสมุดโคลนจากการรักษาแต่ละที่มีโคลนระบุเป็นเจ้าภาพ เหล่านี้วนเวียนโฮสต์ถูกกรองออกโคลนออกจากนิวเคลียสเฉพาะในห้องสมุดที่ตามมาสำหรับการวิเคราะห์ รวม 379 ลำดับที่ไม่ซ้ำกันถูกระบุจากห้องสมุดทั้งหมดของ1475 โคลนทั่วทั้งห้าการรักษากลุ่ม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ยี่สิบห้าทั้งกล้าใช้สำหรับการสกัดดีเอ็นเอ ( QIAGEN
dneasy เลือดและชุด เนื้อเยื่อ วาเลนเซีย , แคลิฟอร์เนีย ) และ V3
ภูมิภาคของ 16S rRNA ออก genewas ขยายใช้ไพรเมอร์ที่เป็นสากล และ u519rgwattaccgcggckgcag

u341f-cctacgggrsgcagcag ( ดัดแปลงจาก : วังและ Qian , 2009 ) .
สระว่ายน้ำของปฏิกิริยา PCR ( 6 หลอด / ปฏิกิริยา¼ 120 ml รวมการรักษา
) ต่อต่ออาณานิคมสร้างขึ้นและเข้มข้นโดยใช้มาตรฐาน
โซเดียมอะซิเตต / เอทานอลโปรโตคอลการตกตะกอน DNA ผล
~ 180 BP ชิ้นส่วนถูกโคลนเข้าไปใน pgem-t ง่ายเวกเตอร์เวกเตอร์ pgem-t
ใช้ง่ายระบบ ( Madison , WI ) อาณานิคมผิวขาว
ถูกแทรกโดยใช้ PCR จาก gotaq สีเขียวต้นแบบผสม
( promega ; Madison , WI ) และไพรเมอร์ M13 มาตรฐาน ( ตาราง S1 ) .
โคลนที่มีขนาดถูกต้องแทรกปลูกแบบค้างคืนใน LB broth ที่มี ampicillin

รอลหุ้นเพื่อให้ลำดับต่อไป เก้าสิบหกโคลนที่ถูกเลือกสำหรับแต่ละการรักษา /
อาณานิคม ทั้งหมด 1536 โคลนคือลำดับเบสลึกดี กลีเซอรอล แผ่นปลูกเชื้อ

รอลและโคลนจากแต่ละหุ้นและช่วย
แซงเกอร์จัดลำดับโดยมหาวิทยาลัยเพอร์ดูในลำดับซึ่งเป็นหลักสิ่งอำนวยความสะดวก
ฝอย และเปรียบเทียบกับลำดับนิวคลีโอไทด์ของ ncbi
ฐานข้อมูลเพื่อให้โคลนของตัวตน ลำดับ
แล้วเทียบข้ามกลุ่มเพื่อระบุลำดับ
ซ้ำและไม่ซ้ำกัน วัตถุที่ไม่คาดคิดของ
ใช้ทราม 16S rDNA ไพรเมอร์เป็นแบบโฮสต์
18S rDNA . ผลโคลนห้องสมุดจากการรักษาแต่ละที่มีอยู่
โคลนระบุเป็นเจ้าภาพ ลำดับโฮสต์เหล่านี้
กรองออกเหลือเพียงโคลนโพรคาริโอติกในห้องสมุดสำหรับการวิเคราะห์ที่ตามมา

รวม 379 ลำดับเฉพาะระบุ
จากห้องสมุดทั้งหมด 843 โคลนทุกห้ารักษา
กลุ่ม