2.8. Oxidant status assaysGlutathio

2.8. Oxidant status assays
Glutathione peroxidase (GPx) activity was determined spectrophotometrically
according to previously described[24]. The following solutions were pipetted into a
cuvette: 0.1 ml of homogenate and 0.8 ml of 100 mM potassium phosphate buffer, pH
7.0. The potassium phosphate buffer consisted of 1 mM EDTA, 1 mM NaN3, 0.2 mM
NADPH, 1 U/ml GSH reductase and 1 mM GSH. This mixture was preincubated for 5 min
at 37°C. Thereafter, the overall reaction was initiated by adding 0.1 ml of 2.5 mM H2O2.
Enzyme activity was calculated by the change of the absorbance value at 340 nm for 5
min. The corresponding non-enzymatic reaction rate was assayed by replacing the
homogenate sample with potassium phosphate buffer. GPx activity was expressed as
nanomoles of NADPH per minute per milligram of protein.
The glutathione reductase (GR) assay monitored the oxidation of NADPH
consumed in the reduction of glutathione disulfide (GSSG) by measuring the change
in absorbance at 340 nm, as previously described [25]. The following solutions were
pipetted into a 1-cm spectrophotometric cuvette: 0.1 ml of homogenate and 0.9 ml of
0.10 M phosphate buffer, pH 7.0, containing 1 mM MgCl2●6H2O, 50 mM GSSG and 0.1
mM NADPH. This mixture was preincubated for 5 min at 37°C. GR activity was
calculated by the change of the absorbance value at 340 nm for 5 min; GR activity was
expressed as nanomoles of NADPH per minute per milligram of protein.
GlutathioneS-transferase (GST) activity was measured according to a previously
described method [26], with a slight modification. One hundred microliters of
homogenate was incubated with 880μl of potassium phosphate buffer (100 mM, pH
6.5, containing 1 mM GSH) and mixed well with 20μl of 1-chloro-2,4-dinitrobenzene
(CDNB). GST activity was calculated by the change in the absorbance value at 340 nm
for 3 min and was expressed as nanomoles of CDNB-GSH conjugate formatted per
minute per milligram protein

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.8. อนุมูลอิสระสถานะ assaysกำหนดกิจกรรม peroxidase (GPx) กลูตาไธโอน spectrophotometricallyตามเคยอธิบายไว้ [24] วิธีแก้ไขปัญหาต่อไปนี้ถูก pipetted ในการcuvette: 0.1 ml ของ homogenate และ 0.8 ml 100 มม.โพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH7.0.โพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ประกอบด้วย 1 mM EDTA, 1 mM NaN3, 0.2 mMNADPH, GSH U/ml reductase และ 1 มม. GSH 1 ส่วนผสมนี้ถูก preincubated ใน 5 นาทีที่ 37 องศาเซลเซียส หลังจากนั้น ปฏิกิริยาโดยรวมเป็นจุดเริ่มต้น โดยการเพิ่ม 0.1 มล. 2.5 มม. H2O2เอนไซม์ถูกคำนวณจากการเปลี่ยนแปลงของค่า absorbance ที่ 340 nm สำหรับ 5นาที อัตราปฏิกิริยาไม่เอนไซม์ในระบบที่เกี่ยวข้องถูก assayed โดยแทนตัวอย่าง homogenate กับโพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ กิจกรรม GPx ถูกแสดงเป็นnanomoles ของ NADPH ต่อนาทีต่อ milligram โปรตีนออกซิเดชันของ NADPH ตรวจสอบวิเคราะห์ reductase (GR) กลูตาไธโอนใช้ในการลดของกลูตาไธโอนไดซัลไฟด์ (GSSG) โดยการวัดการเปลี่ยนแปลงใน absorbance ที่ 340 nm อธิบายว่า ก่อนหน้านี้ [25] มีแก้ไขปัญหาต่อไปนี้pipetted ลงใน cuvette spectrophotometric 1 ซม.: 0.1 ml ของ homogenate และ 0.9 ml ของ0.10 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.0, MgCl2●6H2O 1 มม. 50 มม. GSSG และ 0.1มม. NADPH ส่วนผสมนี้ถูก preincubated ใน 5 นาทีที่ 37 องศาเซลเซียส มีกิจกรรม GRคำนวณจากการเปลี่ยนแปลงของค่า absorbance ที่ 340 nm สำหรับ 5 นาที มีกิจกรรม GRแสดงเป็น nanomoles ของ NADPH ต่อนาทีต่อ milligram โปรตีนGlutathioneS-transferase (GST) activity was measured according to a previouslydescribed method [26], with a slight modification. One hundred microliters ofhomogenate was incubated with 880μl of potassium phosphate buffer (100 mM, pH6.5, containing 1 mM GSH) and mixed well with 20μl of 1-chloro-2,4-dinitrobenzene(CDNB). GST activity was calculated by the change in the absorbance value at 340 nmfor 3 min and was expressed as nanomoles of CDNB-GSH conjugate formatted perminute per milligram protein

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.8 สถานะอนุมูลอิสระตรวจกลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเด (GPx) กิจกรรม spectrophotometrically ถูกกำหนดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า[24] โซลูชั่นดังต่อไปนี้ปิเปตเป็นcuvette: 0.1 มิลลิลิตร homogenate 0.8 มล. และ 100 มิลลิโพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ค่า pH 7.0 บัฟเฟอร์ฟอสเฟตโพแทสเซียมประกอบด้วย 1 มิลลิ EDTA, 1 มิลลิ NaN3 0.2 มิลลิNADPH 1 U / ml reductase GSH และ 1 มิลลิ GSH ส่วนผสมนี้ถูก preincubated เวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิ37 องศาเซลเซียส หลังจากนั้นปฏิกิริยาโดยรวมได้ริเริ่มขึ้นโดยการเพิ่ม 0.1 มล. 2.5 มิลลิ H2O2. กิจกรรมเอนไซม์ที่คำนวณได้จากการเปลี่ยนแปลงมูลค่าการดูดกลืนแสงที่ 340 นาโนเมตรที่เป็นเวลา 5 นาที ที่สอดคล้องกันที่ไม่ใช่เอนไซม์ปฏิกิริยาได้รับการวิเคราะห์จากอัตราการเปลี่ยนตัวอย่าง homogenate ด้วยโพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ กิจกรรม GPx ถูกแสดงเป็นnanomoles ของ NADPH ต่อนาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีน. reductase กลูตาไธโอน (GR) การทดสอบการตรวจสอบการเกิดออกซิเดชันของ NADPH บริโภคในการลดลงของกลูตาไธโอนซัลไฟด์ (GSSG) โดยการวัดการเปลี่ยนแปลงในการดูดกลืนแสงที่340 นาโนเมตรตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [25] โซลูชั่นดังต่อไปนี้ปิเปตเป็น cuvette สเปก 1 ซม: 0.1 มิลลิลิตร homogenate และ 0.9 มิลลิลิตร 0.10 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ค่า pH 7.0 ที่มี 1 มิลลิ MgCl2 ● 6H2O 50 มิลลิ GSSG และ 0.1 มิลลิ NADPH ส่วนผสมนี้ถูก preincubated เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส กิจกรรม GR ถูกคำนวณจากการเปลี่ยนแปลงของค่าการดูดกลืนแสงที่340 นาโนเมตรเป็นเวลา 5 นาที; กิจกรรม GR ถูกแสดงเป็นnanomoles ของ NADPH ต่อนาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีน. GlutathioneS-transferase (GST) กิจกรรมวัดตามที่ก่อนหน้านี้วิธีการที่อธิบายไว้[26] โดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย หนึ่งร้อย microliters ของhomogenate ถูกบ่มกับ880μlของบัฟเฟอร์ฟอสเฟตโพแทสเซียม (100 มิลลิค่า pH 6.5 ที่มี 1 มิลลิ GSH) และผสมกันได้ดีกับ20μl 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) กิจกรรม GST ที่คำนวณได้จากการเปลี่ยนแปลงของค่าการดูดกลืนแสงที่ 340 นาโนเมตรเป็นเวลา3 นาทีและได้รับการแสดงเป็นของ nanomoles ผัน CDNB-GSH รูปแบบต่อนาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.8 . สามารถตรวจสถานะ
กลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส ( GPX ) กำหนดกิจกรรมนี้
ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า [ 24 ] โซลูชั่นต่อไปนี้ pipetted เป็น
พิทยาพล : 0.1 มิลลิลิตรปริมาณ 0.8 มิลลิลิตร และ 100 มิลลิโมลาร์โพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ พีเอช
7.0 . โพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย 1 mM EDTA , nan3 1 มิลลิเมตร nadph 0.2 mm
1 U / ml เอนไซม์ GSH และ GSH 1 มิลลิเมตรส่วนผสมนี้ preincubated สำหรับ 5 นาทีที่ 37 ° C
หลังจากนั้นปฏิกิริยาโดยรวมได้ริเริ่มขึ้น โดยการเพิ่ม 0.1 มิลลิลิตร H2O2 2.5 mm .
กิจกรรมเอนไซม์ได้คำนวณการเปลี่ยนแปลงของค่าการดูดกลืนแสงที่ 340 nm สำหรับ 5 นาทีที่ไม่ใช่เอนไซม์
อัตราการเกิดปฏิกิริยาซีรั่มโดยแทนที่
อนตัวอย่างโพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ กิจกรรมจะแสดงเป็น
GPXnanomoles ของ nadph ต่อนาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีน กลูต้าไธโอนรีดักเทส ( GR )
3
nadph การออกซิเดชันของการบริโภคในการลดลงของกลูต้าไธโอน ไดซัลไฟด์ ( gssg ) โดยวัดการดูดกลืนแสงที่เปลี่ยนแปลง
ใน 340 nm , ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 25 ] โซลูชั่นต่อไปนี้
pipetted เป็น 1-cm ) พิทยาพล : 0.1 มิลลิลิตรปริมาณ 0.9 ml
010 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ พีเอช 7.0 , มี 1 ชุด● 6h2o gssg mm , 50 mm และ nadph
0.1 มิลลิเมตร ส่วนผสมนี้ preincubated เป็นเวลา 5 นาทีที่ 37 องศา แต่กิจกรรม
) โดยการเปลี่ยนแปลงของค่าการดูดกลืนแสงที่ 340 nm สำหรับ 5 นาที ; กิจกรรม GR คือ
แสดงเป็น nanomoles ของ nadph ต่อนาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีน
glutathiones ทรานสเฟอเรส ( GST ) กิจกรรมวัดตาม
ครั้งก่อนอธิบายวิธี [ 26 ] , กับการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย หนึ่งร้อยตัวเลขของ
อนคือแยก 880 μลิตรโพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ( 100 มม. M
6.5 , มี 1 มม. GSH ) และเข้ากันกับ 20 μ l 1-chloro-2,4-dinitrobenzene
( cdnb ) กิจกรรม GST ได้คำนวณการเปลี่ยนแปลงในค่าการดูดกลืนแสงที่ 340 nm
3 นาที และถูกแสดงเป็น nanomoles ของ cdnb-gsh ผันรูปแบบต่อ

นาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีน