- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
(a). Binding characteristics of ฮิว
(a). Binding characteristics of ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล
antibody clone 20E5 on PHA-stimulated ฮิวเมน CD134 expressing CD4 โพซิทีฟ T ลิมโฟไซต์
PHA-stimulated (at 10 i.tg/mL for 1 day; see above) ฮิวเมน CD134
expressing T ลิมโฟไซต์ were generated. Cells were harvested and put at 1-2x106
15 cells/mL in ice chilled PBS/BSA/NaN3. Cells were incubated with 0, 0.007, 0.02,
0.07, 0.2, 0.6, 1.9, 5.6, 16.7, 50.0 pig/mL ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134
antibody clone 20E5 for 30 minutes at 4°C. After extensive washing in
PBS/BSA/NaN3, cells were subsequently incubated with 1:50 diluted FITC-
conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน IgG4 antibodies (Sigma) for 30 minutes at 4°C. After 20 extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells were incubated with 1:10 diluted PE-
conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD4 antibody (BD Biosciences) for 30 minutes at
4°C. After extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells were fixed in 2%
formaldehyde in PBS/BSA/NaN3 for 30 minutes at 4°C. Binding of antibodies was
measured using โฟลไซโตเมทรี (FACSCalibur; BD Biosciences).
25 ไคเมริก ฮิวเมน IgG4x แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 saturated
ฮิวเมน CD134 surface molecules on PHA-stimulated CD4P°sitive T ลิมโฟไซต์ at approximately 5.0-10.0 p.g/mL (data not shown). Half maximal binding was
observed at 1.0 i.ig/mL for ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 (data not shown).
30
(b). Binding of ไคเมริก ฮิวเมน IgG4x แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล
antibody clone 20E5 on PHA-stimulated ฮิวเมน CD134 expressing CD4 โพซิทีฟ and CD8 โพซิทีฟ T ลิมโฟไซต์
PHA-stimulated (at 10 p,g/mL for 1 day; see above) ฮิวเมน CD134
expressing T ลิมโฟไซต์ were generated. Cells were harvested and put at 1-2x106 cells/mL in ice-chilled PBS/BSA/NaN3. Cells were incubated with หรือ without 20.0 ptg/mL ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 for 30
5 minutes at 4°C. After extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells were
subsequently incubated for 30 minutes at 4°C with 1:200 diluted PE-conjugated goat แอนติ-ฮิวเมน IgG (Fcy specific) antibodies (Jackson ImmunoResearch) for 30 minutes at 4°C. After extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells were incubated
with 1:10 diluted FITC-conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD4 antibody (BD
10 Biosciences) หรือ with 1:10 diluted FITC-conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD8
antibody (BD Biosciences) to detect T ลิมโฟไซต์ subpopulations. After extensive washing in PBS/BSA/Nan, cells were fixed in 2% formaldehyde in PBS/BSA/NaN3 for 30 minutes at 4°C. Binding of antibodies was measured using โฟลไซโตเมทรี (FACSCalibur; BD Biosciences).
15 ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5
demonstrated โพซิทีฟ staining on the PHA-activated ฮิวเมน CD4โพซิทีฟ T
ลิมโฟไซต์ subpopulation, and low โพซิทีฟ staining on the PHA-activated ฮิวเมน CD8โพซิทีฟ T ลิมโฟไซต์ subpopulation (data not shown).
20 (c). Binding of ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody
clone 20E5 on แอนติ-ฮิวเมน CD3/แอนติ-ฮิวเมน CD28 antibody stimulator beads-
stimulated ฮิวเมน CD134 expressing CD4 โพซิทีฟ and CD8 โพซิทีฟ T
ลิมโฟไซต์
ฮิวเมน peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy donors 25 (informed consent) were isolated by density centrifugation on Lymphoprep (1.077
g/mL; Nycomed). Subsequently, 1x106 PBMC/mL in RPMI-1640 culture medium
(Gibco) containing 10% fetal calf serum (Bodinco) and 50 lig/mL เจนทาไมซิน (Gibco)
were stimulated with mouse anti ฮิวเมน CD3/mouse แอนติ-ฮิวเมน CD28 antibody
stimulator beads (CD3/CD28 beads; Invitrogen) at 1 bead/4 cells in the absence หรือ 30 presence of 25 U/mL รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน อินเตอร์ลิวคิน-2 (PeproTech) at 37°C/5%
CO2 for 1 day. After culture, PBMC were harvested and put at 1-2x106 cells/mL in
ice-chilled PBS/BSA/NaN3. Cells were incubated with หรือ without 20.0 gg/mL
ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 for 30 minutes at
4°C. After extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells were subsequently incubated
with 1:200 diluted PE-conjugated goat แอนติ-ฮิวเมน IgG (Fcy specific) antibodies
(Jackson ImmunoResearch) for 30 minutes at 4°C. After extensive washing in
PBS/BSA/NaN3, cells were incubated for 30 minutes at 4°C with 1:10 diluted FITC-
5 conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD4 antibody (BD Biosciences) หรือ with 1:10 diluted
FITC-conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD8 antibody (BD Biosciences) to detect T
ลิมโฟไซต์ subpopulations. After extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells were
fixed in 2% formaldehyde in PBS/BSA/NaN3 for 30 minutes at 4°C. Binding of
antibodies was measured using โฟลไซโตเมทรี (FACSCalibur; BD Biosciences).
10 As shown in รูป 14, ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody
clone 20E5 demonstrated โพซิทีฟ staining on the CD3/CD28 beads-activated
ฮิวเมน CD4P°sitive T ลิมโฟไซต์ subpopulation, and low โพซิทีฟ staining on the
CD3/CD28 beads-activated ฮิวเมน CD8P°sitive T ลิมโฟไซต์ subpopulation. No
apparent effect was observed using รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน IL-2 supplement.
15
Example 7. Biological characterization of ไคเมริก ฮิวเมน IgG4/kappa แอนติ-
ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 20E5
(a). การเพิ่มจำนวน of T ลิมโฟไซต์ ที่แสดงออก ฮิวเมน CD134 ที่กระตุ้นด้วย PHA after 20 treatment with ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody
clone 20E5
PHA-stimulated (10 p.g/mL for 1 day; see above) ฮิวเมน CD134 expressing T
ลิมโฟไซต์ were generated. Cells were harvested and suspended at 2x106
cells/mL in RPMI culture medium (Gibco) containing 10% fetal calf serum
25 (Bodinco) and 50 pg/mL เจนทาไมซิน (Gibco). Cells were seeded at 0.1x106 cells/100
gL/well (i.e., 1x106 cells/mL) in 96-wells flat bottom plates (Corning), and were
exposed to 25.0 lig/mL ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone
20E5 หรือ to 25.0 p,g/mL control ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD40 antibody (PG102;
Pangenetics), หรือ to 1.0 lig/mL โพลีฮิสทิดีน-tagged รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน OX4OL (in 30 the presence of 1:5 molar ratio mouse แอนติ-โพลีฮิสทิดีน antibody; R&D Systems)
at 37°C/5% CO2 for 6 days. After 6 days, cell การเพิ่มจำนวน was measured using the
colorimetric (BrdU incorporation) Cell การเพิ่มจำนวน ELISATM (Roche) and an
ELISA reader (BioRad) at A450 nm.
As shown in รูป 15 (ค่าเฉลี่ย ± SD), ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน
CD134 antibody clone 20E5 (hu20E5) and ฮิวเมน OX4OL induced การเพิ่มจำนวน in
T ลิมโฟไซต์ ที่แสดงออก ฮิวเมน CD134 ที่กระตุ้นด้วย PHA . Non-treated (medium
only) หรือ treatment with control ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD40 antibody (huIgG4) 5 did not demonstrate any effect on PHA stimulated ฮิวเมน CD134 expressing T
ลิมโฟไซต์ การเพิ่มจำนวน.
(b). การเพิ่มจำนวน of T ลิมโฟไซต์ ที่แสดงออก ฮิวเมน CD134 ที่กระตุ้นด้วย PHA
after treatment with ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล
10 antibody clone 20E5 in combination with รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน OX4OL
PHA-stimulated (10 lig/mL for 1 day; see above) ฮิวเมน CD134 expressing T
ลิมโฟไซต์ were generated. Cells were harvested and suspended at 2x106 cells/mL
in RPMI culture medium (Gibco) containing 10% fetal calf serum (Bodinco) and 50
lig/mL เจนทาไมซิน (Gibco). Cells were seeded at 0.1x106cells/100 4/well (i.e.,
15 1x106 cells/mL) in 96-wells flat-bottom plates (Corning), and were exposed to 0,
0.025, 0.25, 2.5, หรือ 25.0 figimL ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody
clone 20E5, or/and in combination with 0, 0.01, 0.1, หรือ 1.0 ftg/mL โพลีฮิสทิดีน-
tagged รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน OX4OL (in the presence of 1:5 molar ratio mouse แอนติ-
โพลีฮิสทิดีน antibody; R&D Systems) at 37°C/5% CO2 for 6 days. After 6 days, cell 20 การเพิ่มจำนวน was measured using the colorimetric (BrdU incorporation) Cell
การเพิ่มจำนวน ELISATM (Roche) and an ELISA reader (BioRad) at A450 nm.
As shown in รูป 16 (ค่าเฉลี่ย ± SD), ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน
CD134 antibody clone 20E5 (hu20E5) and ฮิวเมน OX4OL dose-dependently
induced การเพิ่มจำนวน in T ลิมโฟไซต์ ที่แสดงออก ฮิวเมน CD134 ที่กระตุ้นด้วย PHA . 25 ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 donor-
dependently induced การเพิ่มจำนวน at either 2.5 and 25 gg/mL (donor 1) หรือ at 0.25,
2.5, and 25 pg/mL (donor 2). In addition, ฮิวเมน OX4OL donor dependently induced การเพิ่มจำนวน at either 0.1 and 1.0 pg/mL (donor 1) หรือ at 0.01, 0.1, and 1.0 figimL (donor 2).
30 As shown in รูป 17 (ค่าเฉลี่ย ± SD), the combination of ไคเมริก ฮิวเมน
IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134
antibody clone 20E5 on PHA-stimulated ฮิวเมน CD134 expressing CD4 โพซิทีฟ T ลิมโฟไซต์
PHA-stimulated (at 10 i.tg/mL for 1 day; see above) ฮิวเมน CD134
expressing T ลิมโฟไซต์ were generated. Cells were harvested and put at 1-2x106
15 cells/mL in ice chilled PBS/BSA/NaN3. Cells were incubated with 0, 0.007, 0.02,
0.07, 0.2, 0.6, 1.9, 5.6, 16.7, 50.0 pig/mL ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134
antibody clone 20E5 for 30 minutes at 4°C. After extensive washing in
PBS/BSA/NaN3, cells were subsequently incubated with 1:50 diluted FITC-
conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน IgG4 antibodies (Sigma) for 30 minutes at 4°C. After 20 extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells were incubated with 1:10 diluted PE-
conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD4 antibody (BD Biosciences) for 30 minutes at
4°C. After extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells were fixed in 2%
formaldehyde in PBS/BSA/NaN3 for 30 minutes at 4°C. Binding of antibodies was
measured using โฟลไซโตเมทรี (FACSCalibur; BD Biosciences).
25 ไคเมริก ฮิวเมน IgG4x แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 saturated
ฮิวเมน CD134 surface molecules on PHA-stimulated CD4P°sitive T ลิมโฟไซต์ at approximately 5.0-10.0 p.g/mL (data not shown). Half maximal binding was
observed at 1.0 i.ig/mL for ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 (data not shown).
30
(b). Binding of ไคเมริก ฮิวเมน IgG4x แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล
antibody clone 20E5 on PHA-stimulated ฮิวเมน CD134 expressing CD4 โพซิทีฟ and CD8 โพซิทีฟ T ลิมโฟไซต์
PHA-stimulated (at 10 p,g/mL for 1 day; see above) ฮิวเมน CD134
expressing T ลิมโฟไซต์ were generated. Cells were harvested and put at 1-2x106 cells/mL in ice-chilled PBS/BSA/NaN3. Cells were incubated with หรือ without 20.0 ptg/mL ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 for 30
5 minutes at 4°C. After extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells were
subsequently incubated for 30 minutes at 4°C with 1:200 diluted PE-conjugated goat แอนติ-ฮิวเมน IgG (Fcy specific) antibodies (Jackson ImmunoResearch) for 30 minutes at 4°C. After extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells were incubated
with 1:10 diluted FITC-conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD4 antibody (BD
10 Biosciences) หรือ with 1:10 diluted FITC-conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD8
antibody (BD Biosciences) to detect T ลิมโฟไซต์ subpopulations. After extensive washing in PBS/BSA/Nan, cells were fixed in 2% formaldehyde in PBS/BSA/NaN3 for 30 minutes at 4°C. Binding of antibodies was measured using โฟลไซโตเมทรี (FACSCalibur; BD Biosciences).
15 ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5
demonstrated โพซิทีฟ staining on the PHA-activated ฮิวเมน CD4โพซิทีฟ T
ลิมโฟไซต์ subpopulation, and low โพซิทีฟ staining on the PHA-activated ฮิวเมน CD8โพซิทีฟ T ลิมโฟไซต์ subpopulation (data not shown).
20 (c). Binding of ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody
clone 20E5 on แอนติ-ฮิวเมน CD3/แอนติ-ฮิวเมน CD28 antibody stimulator beads-
stimulated ฮิวเมน CD134 expressing CD4 โพซิทีฟ and CD8 โพซิทีฟ T
ลิมโฟไซต์
ฮิวเมน peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy donors 25 (informed consent) were isolated by density centrifugation on Lymphoprep (1.077
g/mL; Nycomed). Subsequently, 1x106 PBMC/mL in RPMI-1640 culture medium
(Gibco) containing 10% fetal calf serum (Bodinco) and 50 lig/mL เจนทาไมซิน (Gibco)
were stimulated with mouse anti ฮิวเมน CD3/mouse แอนติ-ฮิวเมน CD28 antibody
stimulator beads (CD3/CD28 beads; Invitrogen) at 1 bead/4 cells in the absence หรือ 30 presence of 25 U/mL รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน อินเตอร์ลิวคิน-2 (PeproTech) at 37°C/5%
CO2 for 1 day. After culture, PBMC were harvested and put at 1-2x106 cells/mL in
ice-chilled PBS/BSA/NaN3. Cells were incubated with หรือ without 20.0 gg/mL
ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 for 30 minutes at
4°C. After extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells were subsequently incubated
with 1:200 diluted PE-conjugated goat แอนติ-ฮิวเมน IgG (Fcy specific) antibodies
(Jackson ImmunoResearch) for 30 minutes at 4°C. After extensive washing in
PBS/BSA/NaN3, cells were incubated for 30 minutes at 4°C with 1:10 diluted FITC-
5 conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD4 antibody (BD Biosciences) หรือ with 1:10 diluted
FITC-conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD8 antibody (BD Biosciences) to detect T
ลิมโฟไซต์ subpopulations. After extensive washing in PBS/BSA/NaN3, cells were
fixed in 2% formaldehyde in PBS/BSA/NaN3 for 30 minutes at 4°C. Binding of
antibodies was measured using โฟลไซโตเมทรี (FACSCalibur; BD Biosciences).
10 As shown in รูป 14, ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody
clone 20E5 demonstrated โพซิทีฟ staining on the CD3/CD28 beads-activated
ฮิวเมน CD4P°sitive T ลิมโฟไซต์ subpopulation, and low โพซิทีฟ staining on the
CD3/CD28 beads-activated ฮิวเมน CD8P°sitive T ลิมโฟไซต์ subpopulation. No
apparent effect was observed using รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน IL-2 supplement.
15
Example 7. Biological characterization of ไคเมริก ฮิวเมน IgG4/kappa แอนติ-
ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 20E5
(a). การเพิ่มจำนวน of T ลิมโฟไซต์ ที่แสดงออก ฮิวเมน CD134 ที่กระตุ้นด้วย PHA after 20 treatment with ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody
clone 20E5
PHA-stimulated (10 p.g/mL for 1 day; see above) ฮิวเมน CD134 expressing T
ลิมโฟไซต์ were generated. Cells were harvested and suspended at 2x106
cells/mL in RPMI culture medium (Gibco) containing 10% fetal calf serum
25 (Bodinco) and 50 pg/mL เจนทาไมซิน (Gibco). Cells were seeded at 0.1x106 cells/100
gL/well (i.e., 1x106 cells/mL) in 96-wells flat bottom plates (Corning), and were
exposed to 25.0 lig/mL ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone
20E5 หรือ to 25.0 p,g/mL control ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD40 antibody (PG102;
Pangenetics), หรือ to 1.0 lig/mL โพลีฮิสทิดีน-tagged รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน OX4OL (in 30 the presence of 1:5 molar ratio mouse แอนติ-โพลีฮิสทิดีน antibody; R&D Systems)
at 37°C/5% CO2 for 6 days. After 6 days, cell การเพิ่มจำนวน was measured using the
colorimetric (BrdU incorporation) Cell การเพิ่มจำนวน ELISATM (Roche) and an
ELISA reader (BioRad) at A450 nm.
As shown in รูป 15 (ค่าเฉลี่ย ± SD), ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน
CD134 antibody clone 20E5 (hu20E5) and ฮิวเมน OX4OL induced การเพิ่มจำนวน in
T ลิมโฟไซต์ ที่แสดงออก ฮิวเมน CD134 ที่กระตุ้นด้วย PHA . Non-treated (medium
only) หรือ treatment with control ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD40 antibody (huIgG4) 5 did not demonstrate any effect on PHA stimulated ฮิวเมน CD134 expressing T
ลิมโฟไซต์ การเพิ่มจำนวน.
(b). การเพิ่มจำนวน of T ลิมโฟไซต์ ที่แสดงออก ฮิวเมน CD134 ที่กระตุ้นด้วย PHA
after treatment with ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล
10 antibody clone 20E5 in combination with รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน OX4OL
PHA-stimulated (10 lig/mL for 1 day; see above) ฮิวเมน CD134 expressing T
ลิมโฟไซต์ were generated. Cells were harvested and suspended at 2x106 cells/mL
in RPMI culture medium (Gibco) containing 10% fetal calf serum (Bodinco) and 50
lig/mL เจนทาไมซิน (Gibco). Cells were seeded at 0.1x106cells/100 4/well (i.e.,
15 1x106 cells/mL) in 96-wells flat-bottom plates (Corning), and were exposed to 0,
0.025, 0.25, 2.5, หรือ 25.0 figimL ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody
clone 20E5, or/and in combination with 0, 0.01, 0.1, หรือ 1.0 ftg/mL โพลีฮิสทิดีน-
tagged รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน OX4OL (in the presence of 1:5 molar ratio mouse แอนติ-
โพลีฮิสทิดีน antibody; R&D Systems) at 37°C/5% CO2 for 6 days. After 6 days, cell 20 การเพิ่มจำนวน was measured using the colorimetric (BrdU incorporation) Cell
การเพิ่มจำนวน ELISATM (Roche) and an ELISA reader (BioRad) at A450 nm.
As shown in รูป 16 (ค่าเฉลี่ย ± SD), ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน
CD134 antibody clone 20E5 (hu20E5) and ฮิวเมน OX4OL dose-dependently
induced การเพิ่มจำนวน in T ลิมโฟไซต์ ที่แสดงออก ฮิวเมน CD134 ที่กระตุ้นด้วย PHA . 25 ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 donor-
dependently induced การเพิ่มจำนวน at either 2.5 and 25 gg/mL (donor 1) หรือ at 0.25,
2.5, and 25 pg/mL (donor 2). In addition, ฮิวเมน OX4OL donor dependently induced การเพิ่มจำนวน at either 0.1 and 1.0 pg/mL (donor 1) หรือ at 0.01, 0.1, and 1.0 figimL (donor 2).
30 As shown in รูป 17 (ค่าเฉลี่ย ± SD), the combination of ไคเมริก ฮิวเมน
IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134
0/5000
(ก) การเข้าเล่มลักษณะของฮิวเมน CD134 แอนติ-ฮิวเมน IgG4K โมโนโคลนอล20E5 โคลนแอนติบอดีในถูกกระตุ้นผาฮิวเมน CD134 แสดง CD4 โพซิทีฟ T ลิมโฟไซต์ถูกกระตุ้นผา (ที่ i.tg/mL 10 1 วัน ดูข้างต้น) ฮิวเมน CD134T ลิมโฟไซต์กำลังถูกสร้างขึ้น เก็บเกี่ยวผลผลิต และใส่ 1-2 x 106 เซลล์เซลล์ 15 mL น้ำแข็งแช่ PBS บีเอส เอ/NaN3 เซลล์ถูก incubated 0, 0.007, 0.020.07, 0.2, 0.6, 1.9, 5.6, 16.7, 50.0 หมู/mL ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD134แอนติบอดี 20E5 โคลน 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากซักผ้าอย่างละเอียดในPBS/บี เอส เอ/NaN3 เซลล์ได้มา incubated กับ 1:50 ยกเว้น FITC -เมาส์ที่กลวงแอนติฮิวเมน IgG4 แอนตี้ (ซิกมา) 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจาก 20 อย่างละเอียดซักผ้าใน PBS บีเอส เอ/NaN3 เซลล์ถูก incubated กับ 1:10 ทำให้ PE - แอนติบอดี CD4 แอนติ-ฮิวเมนเมาส์กลวง (เวลาออก BD) 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากซักผ้าอย่างละเอียดใน PBS บีเอส เอ/NaN3 เซลล์ที่ถาวรใน 2% ฟอร์มาลดีไฮด์ใน PBS บีเอส เอ/NaN3 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส รวมแอนตี้ได้ วัดโดยใช้โฟลไซโตเมทรี (FACSCalibur BD เวลาออก)25 ไคเมริกฮิวเมน IgG4x แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 อิ่มตัวโมเลกุลผิวของ CD134 ฮิวเมนบนผาถูกกระตุ้น CD4P ° sitive T ลิมโฟไซต์ที่ประมาณ 5.0-10.0 p.g/mL (ข้อมูลไม่แสดง) ผูกครึ่งสูงสุดได้ สังเกตที่ i.ig/mL 1.0 สำหรับไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 (ข้อมูลไม่แสดง)30(ข) การมัดไคเมริกฮิวเมน IgG4x แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล20E5 โคลนแอนติบอดีในถูกกระตุ้นผาฮิวเมน CD134 แสดง CD4 โพซิทีฟ และ CD8 โพซิทีฟ T ลิมโฟไซต์ถูกกระตุ้นผา (ที่ 10 p, g/mL 1 วัน ดูข้างต้น) ฮิวเมน CD134T ลิมโฟไซต์กำลังถูกสร้างขึ้น เซลล์เก็บเกี่ยว และ 1-2 x 106 เซลล์/มล.ในน้ำแข็งแช่ PBS/บี เอส เอ/NaN3 เซลล์มี incubated มีหรือไม่มี 20.0 ptg/mL ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 สำหรับ 305 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากซักผ้าอย่างละเอียดใน PBS บีเอส เอ/NaN3 เซลล์ได้incubated 30 นาทีที่ 4° C มี 1: 200 ทำให้แพะ PE กลวงแอนติฮิวเมน IgG (เฉพาะ Fcy) แอนตี้ (Jackson ImmunoResearch) 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียสในเวลาต่อมา หลังจากซักผ้าอย่างละเอียดใน PBS บีเอส เอ/NaN3 เซลล์ถูก incubatedกับ 1:10 ทำให้เมาส์ FITC กลวงแอนติฮิวเมน CD4 แอนติบอดี (BDเวลาออก 10) หรือกับ 1:10 ทำให้เมาส์ FITC กลวงแอนติ-ฮิวเมน CD8แอนติบอดี (เวลาออก BD) สืบ T ลิมโฟไซต์ subpopulations หลังจากซักผ้าอย่างละเอียดใน PBS บีเอสเอ/น่าน เซลล์ที่ถาวรในฟอร์มาลดีไฮด์ 2% ใน PBS บีเอส เอ/NaN3 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส รวมแอนตี้ถูกวัดโดยใช้โฟลไซโตเมทรี (FACSCalibur BD เวลาออก)15 ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5ย้อมสีบนเรียกผาฮิวเมน CD4โพซิทีฟ T โพซิทีฟสาธิตลิมโฟไซต์ subpopulation และโพซิทีฟต่ำย้อมสีบนเรียกผาฮิวเมน CD8โพซิทีฟ T ลิมโฟไซต์ subpopulation (ข้อมูลไม่แสดง)20 (c) รวมไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดี20E5 โคลนบนแอนติ-ฮิวเมน CD28 CD3 แอนติ-ฮิวเมนแอนติบอดีเครื่องกระตุ้นเม็ด--ฮิวเมน CD134 กำลังถูกกระตุ้น CD4 โพซิทีฟ และ CD8 โพซิทีฟ T ลิมโฟไซต์ฮิวเมนพ่วง mononuclear เม็ดเลือด (PBMC) จากผู้บริจาคเพื่อสุขภาพ 25 (แจ้งความยินยอม) ได้แบ่งแยก centrifugation ความหนาแน่นบน Lymphoprep (1.077 g/mL Nycomed) ในเวลาต่อมา 1 x 106 PBMC/mL ใน RPMI 1640 วัฒนธรรม ลูกและทารกในครรภ์ (Gibco) ที่มี 10% ซีรั่ม (Bodinco) และ 50 มล./lig เจนทาไมซิน (Gibco) มีขาวกระตุ้น ด้วยเมาส์ต่อต้านแอนติบอดีฮิวเมน CD3/เมาส์ แอนติฮิวเมน CD28 เครื่องกระตุ้นลูกปัด (ลูกปัด CD3/CD28 Invitrogen) ที่ลูกปัด 1/4 เซลล์ในสถานะ 30 หรือขาด 25 U/mL รีคอมบิแนนต์ฮิวเมนอินเตอร์ลิวคิน-2 (PeproTech) 37°C/5% CO2 1 วัน หลังจากวัฒนธรรม PBMC ได้เก็บเกี่ยว และ 1-2 x 106 เซลล์/มิลลิลิตรใน แช่น้ำแข็ง PBS/บี เอส เอ/NaN3 เซลล์มี incubated มีหรือไม่มี gg 20.0 มิลลิลิตร ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 30 นาทีที่4 องศาเซลเซียส หลังจากซักผ้าอย่างละเอียดใน PBS บีเอส เอ/NaN3 เซลล์ได้มา incubated กับ 1: 200 ทำให้แอนตี้แพะ PE กลวงแอนติฮิวเมน IgG (เฉพาะ Fcy) (Jackson ImmunoResearch) 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากซักผ้าอย่างละเอียดใน PBS/บี เอส เอ/NaN3 เซลล์ถูก incubated สำหรับ 30 นาทีที่ 4° C มี 1:10 ทำให้ FITC-เมาส์ 5 กลวงแอนติ-ฮิวเมนหรือ CD4 แอนติบอดี (เวลาออก BD) กับ 1:10 ทำให้ แอนติบอดี CD8 แอนติ-ฮิวเมนเมาส์ FITC กลวง (เวลาออก BD) ตรวจพบ T ลิมโฟไซต์ subpopulations หลังจากซักผ้าอย่างละเอียดใน PBS บีเอส เอ/NaN3 เซลล์ได้ ถาวรในฟอร์มาลดีไฮด์ 2% ใน PBS บีเอส เอ/NaN3 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส การมัด แอนตี้ถูกวัดโดยใช้โฟลไซโตเมทรี (FACSCalibur BD เวลาออก)10 ดังแสดงในรูป 14 ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดี20E5 โคลนสาธิตโพซิทีฟย้อมสีบน CD3/CD28 ที่เรียกใช้งานลูกปัดฮิวเมน CD4P ° sitive T ลิมโฟไซต์ subpopulation และโพซิทีฟต่ำย้อมสีในการ CD3/CD28 เรียกลูกปัดฮิวเมน CD8P ° sitive T ลิมโฟไซต์ subpopulation ไม่ใช่ ชัดเจนถูกตรวจสอบโดยใช้อาหารเสริมรีคอมบิแนนต์ฮิวเมน IL-2 15ตัวอย่างที่ 7 คุณสมบัติทางชีวภาพของไคเมริกฮิวเมน IgG4/แค ปปาแอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5(ก) . การเพิ่มจำนวน T ลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน CD134 ที่กระตุ้นด้วยผาหลัง 20 รักษาด้วยไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดี 20E5 โคลนถูกกระตุ้นผา (p.g/mL 10 1 วัน ดูข้างต้น) แสดง CD134 ฮิวเมน T ลิมโฟไซต์ถูกสร้างขึ้น เก็บเกี่ยว และหยุดชั่วคราว ณ 2 x 106 เซลล์ เซลล์/มล.ใน RPMI วัฒนธรรม (Gibco) ประกอบด้วย 10% ลูกครรภ์เซรั่ม 25 (Bodinco) และเจนทาไมซิน pg/mL 50 (Gibco) เซลล์ถูก seeded 0.1x106 เซลล์/100 gL/ดี (เช่น 1 x 106 เซลล์/มล.) ในบ่อ 96 แบนแผ่นล่าง (คอร์นทำ), และได้ สัมผัสกับ 25.0 lig/mL ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน หรือ 20E5 การ 25.0 p, g/mL ควบคุมฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD40 แอนติบอดี (PG102 Pangenetics), หรือการ lig 1.0 mL แท็กโพลีฮิสทิดีนรีคอมบิแนนต์ฮิวเมน OX4OL (ใน 30 ของ 1:5 อัตราส่วนสบเมาส์แอนติบอดีแอนติ-โพลีฮิสทิดีน R & D ระบบ) ที่ 37°C/5% CO2 6 วัน หลังจากวันที่ 6 การเพิ่มจำนวนเซลล์ถูกวัดโดยใช้การ เทียบเคียง (BrdU ประสาน) เซลล์การเพิ่มจำนวน ELISATM (Roche) และ ELISA (BioRad) อ่านที่ A450 nmดังแสดงในรูปที่ 15 (ค่าเฉลี่ย± SD), ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมนCD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 (hu20E5) และฮิวเมน OX4OL ทำให้เกิดการเพิ่มจำนวนใน T ลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมนที่กระตุ้นด้วย CD134 ผา (ไม่ถือว่าปานกลาง เท่านั้น) หรือรักษา ด้วยควบคุมฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD40 แอนติบอดี (huIgG4) 5 ไม่ไม่แสดงผลใด ๆ บนผาถูกกระตุ้นฮิวเมน CD134 แสดง T ลิมโฟไซต์การเพิ่มจำนวน(ข) . การเพิ่มจำนวน T ลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน CD134 ที่กระตุ้นด้วยผา หลังจากรักษาด้วยไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล แอนติบอดีที่ 10 โคลน 20E5 ร่วมกับรีคอมบิแนนต์ฮิวเมน OX4OL ถูกกระตุ้นผา (lig 10 mL 1 วัน ดูข้างต้น) แสดง CD134 ฮิวเมน Tลิมโฟไซต์ถูกสร้างขึ้น เซลล์เก็บเกี่ยว และหยุดชั่วคราว ณ 2 x 106 เซลล์/มล. ใน RPMI วัฒนธรรม (Gibco) ประกอบด้วย 50 และ 10% ลูกครรภ์เซรั่ม (Bodinco) เจนทาไมซิน lig/mL (Gibco) เซลล์ถูก seeded ที่ 0.1x106cells/100 4/ดี (เช่น 15 1 x 106 เซลล์/มล.) ในจานแบนด้านล่าง 96-บ่อ (คอร์นทำ), และได้สัมผัสกับ 00.025, 0.25, 2.5 หรือ 25.0 figimL ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดี 20E5 โคลน หรือ / และร่วมกับ 0, 0.01, 0.1 หรือ 1.0 ftg/มล โพลีฮิสทิดีน - tagged รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน OX4OL (in the presence of 1:5 molar ratio mouse แอนติ- โพลีฮิสทิดีน antibody; R&D Systems) at 37°C/5% CO2 for 6 days. After 6 days, cell 20 การเพิ่มจำนวน was measured using the colorimetric (BrdU incorporation) Cell การเพิ่มจำนวน ELISATM (Roche) and an ELISA reader (BioRad) at A450 nm.As shown in รูป 16 (ค่าเฉลี่ย ± SD), ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมนCD134 antibody clone 20E5 (hu20E5) and ฮิวเมน OX4OL dose-dependentlyinduced การเพิ่มจำนวน in T ลิมโฟไซต์ ที่แสดงออก ฮิวเมน CD134 ที่กระตุ้นด้วย PHA . 25 ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 donor- dependently induced การเพิ่มจำนวน at either 2.5 and 25 gg/mL (donor 1) หรือ at 0.25,2.5, and 25 pg/mL (donor 2). In addition, ฮิวเมน OX4OL donor dependently induced การเพิ่มจำนวน at either 0.1 and 1.0 pg/mL (donor 1) หรือ at 0.01, 0.1, and 1.0 figimL (donor 2).30 As shown in รูป 17 (ค่าเฉลี่ย ± SD), the combination of ไคเมริก ฮิวเมนIgG4K แอนติฮิวเมน CD134
การแปล กรุณารอสักครู่..
(ก) ผูกพันลักษณะของฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล
20E5 โคลนแอนติบอดีใน PHA กระตุ้นฮิวเมน CD134 แสดง CD4 โพซิทีฟทีลิมโฟไซต์
PHA กระตุ้น (10 i.tg มิลลิลิตร / 1 วันดูด้านบน) ฮิวเมน CD134
แสดงทีลิมโฟไซต์ถูกสร้างขึ้น เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวและใส่ที่ 1-2x106
15 เซลล์ / มิลลิลิตรในน้ำแข็งแช่เย็นพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ที่ถูกบ่มกับ 0, 0.007, 0.02,
0.07, 0.2, 0.6, 1.9, 5.6, 16.7, 50.0 หมู / mL ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมน CD134
แอนติบอดีโคลน 20E5 30 นาทีที่ 4 ° ซี หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ถูกบ่มต่อมา 01:50 เจือจาง FITC- ผันเมาส์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี IgG4 (ซิกม่า) เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส หลังจาก 20 กว้างขวางซักผ้าในพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ถูกบ่มกับ 1:10 เจือจาง PE- เมาส์ผันแอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD4 (BD ชีววิทยาศาสตร์) เป็นเวลา 30 นาทีที่4 ° C หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ได้รับการแก้ไขใน 2% ดีไฮด์ในพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 30 นาทีที่ 4 ° C ผูกพันของแอนติบอดีถูกวัดโดยใช้โฟลไซโตเมทรี (FACSCalibur; BD ชีววิทยาศาสตร์). 25 ไคเมริกฮิวเมน IgG4x แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 อิ่มตัวฮิวเมนCD134 โมเลกุลบนพื้นผิว PHA กระตุ้น CD4P ° sitive ทีลิมโฟไซต์ที่ประมาณ 5.0-10.0 pg / มิลลิลิตร (ไม่ได้แสดงข้อมูล) ครึ่งสูงสุดผูกพันได้รับการตั้งข้อสังเกตที่ 1.0 i.ig / มิลลิลิตรสำหรับไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ -. ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 (ไม่ได้แสดงข้อมูล) 30 (ข) ผูกพันของไคเมริกฮิวเมน IgG4x แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล20E5 โคลนแอนติบอดีใน PHA กระตุ้นฮิวเมน CD134 แสดง CD4 โพซิทีฟและ CD8 โพซิทีฟทีลิมโฟไซต์PHA -stimulated (10 พี, กรัม / มิลลิลิตร 1 วันดูด้านบน) ฮิวเมน CD134 แสดงทีลิมโฟไซต์ถูกสร้างขึ้น เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวและใส่ที่ 1-2x106 เซลล์ / มิลลิลิตรในพีบีเอสน้ำแข็งแช่เย็น / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ที่ถูกบ่มกับหรือโดยไม่ต้อง PTG 20.0 มิลลิลิตร / ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 30 5 นาทีที่ 4 ° C หลังจากที่กว้างขวางซักผ้าในพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ถูกบ่มต่อมาเป็นเวลา30 นาทีที่ 4 ° C 1: 200 ปรับลดแพะ PE-ผันแอนติ - ฮิวเมน IgG (FCY เฉพาะ) แอนติบอดี (แจ็คสัน ImmunoResearch) เป็นเวลา 30 นาที ที่ 4 ° C หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ถูกบ่มกับ1:10 เจือจางเมาส์ FITC-ผันแอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD4 (BD 10 ชีววิทยาศาสตร์) หรือที่มีการปรับลด 01:10 เมาส์ FITC-ผันแอนติ - ฮิวเมน CD8 แอนติบอดี (BD ชีววิทยาศาสตร์) ในการตรวจสอบทีลิมโฟไซต์ประชากร หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / น่านเซลล์ได้รับการแก้ไขในไฮด์ 2% ในพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 30 นาทีที่ 4 ° C ผูกพันของแอนติบอดีถูกวัดโดยใช้โฟลไซโตเมทรี (FACSCalibur; BD ชีววิทยาศาสตร์). 15 ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 แสดงให้เห็นโพซิทีฟการย้อมสีใน PHA เปิดใช้งานฮิ วเมน CD4 โพซิทีฟทีลิมโฟไซต์subpopulation และต่ำโพซิทีฟการย้อมสีใน PHA เปิดใช้งานฮิวเมน CD8 โพซิทีฟทีลิมโฟไซต์ subpopulation (ไม่ได้แสดงข้อมูล). 20 (ค) . ผูกพันของไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดี20E5 โคลนบนแอนติ - ฮิวเมน CD3 / แอนติ - ฮิวเมน CD28 กระตุ้นแอนติบอดี beads- กระตุ้นฮิวเมน CD134 แสดง CD4 โพซิทีฟและ CD8 โพซิทีฟทีลิมโฟไซต์ฮิวเมนต่อพ่วงเซลล์โมโนนิวเคลียร์ในเลือด(PBMC) จากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดี 25 (ความยินยอม) ที่แยกได้โดยการหมุนเหวี่ยงหนาแน่นใน Lymphoprep (1.077 กรัม / มิลลิลิตร; Nycomed ) ต่อมา 1x106 PBMC / มิลลิลิตรในอาหารเลี้ยงเชื้อ RPMI-1640 (Gibco) ที่มีซีรั่มน่องทารกในครรภ์ 10% (Bodinco) และ 50 lig / mL เจนทาไมซิน (Gibco) ถูกกระตุ้นด้วยเมาส์ต่อต้านฮิวเมน CD3 / เมาส์แอน ติ - ฮิวเมน CD28 แอนติบอดีลูกปัดกระตุ้น(CD3 ลูกปัด / CD28; Invitrogen) ณ วันที่ 1 ลูกปัด / 4 เซลล์ในกรณีที่ไม่มีหรือ 30 การปรากฏตัวของ 25 U / มิลลิลิตรรีคอมบิแนนต์ฮิวเมนอินเตอร์ลิวคิน -2 ( PeproTech) ที่ 37 ° C / 5% CO2 1 วัน หลังจากวัฒนธรรม PBMC ถูกเก็บเกี่ยวและใส่ที่ 1-2x106 เซลล์ / มิลลิลิตรในพีบีเอสน้ำแข็งแช่เย็น/ บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ที่ถูกบ่มกับหรือโดยไม่ต้อง GG 20.0 มิลลิลิตร / ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 30 นาทีที่4 ° C หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ถูกบ่มต่อมา1: 200 ปรับลดแพะ PE-ผันแอนติ - ฮิวเมน IgG (FCY เฉพาะ) แอนติบอดี(แจ็คสัน ImmunoResearch) เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ถูกบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่ 4 ° C ที่มีการปรับลด 01:10 FITC- 5 เมาส์ผันแอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD4 (BD ชีววิทยาศาสตร์) หรือที่มีการปรับลด 01:10 FITC เมาส์ -conjugated แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD8 (BD ชีววิทยาศาสตร์) ในการตรวจสอบทีลิมโฟไซต์ประชากร หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ได้รับการแก้ไขในไฮด์2% ในพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 30 นาทีที่ 4 ° C ผูกพันของแอนติบอดีที่ได้รับการวัดโดยใช้โฟลไซโตเมทรี. (FACSCalibur; BD ชีววิทยาศาสตร์) 10 ดังแสดงในรูปที่ 14 ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลน 20E5 แสดงให้เห็นโพซิทีฟการย้อมสี ใน CD3 / CD28 เปิดใช้งานลูกปัดฮิวเมนCD4P ° sitive ทีลิมโฟไซต์ subpopulation และต่ำโพซิทีฟในการย้อมสีCD3 / CD28 เม็ดเปิดใช้งานฮิวเมน CD8P ° sitive ทีลิมโฟไซต์ subpopulation ไม่มีผลกระทบที่เห็นได้ชัดก็สังเกตเห็นโดยใช้รีคอมบิแนนต์ฮิวเมน IL-2 เสริม. 15 ตัวอย่าง 7. ลักษณะทางชีวภาพของไคเมริกฮิวเมน IgG4 / คัปปาแอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5 (ก) การเพิ่มจำนวนของ บริษัท ทีลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน CD134 ที่กระตุ้นด้วย PHA หลังจาก 20 รักษาด้วยไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน20E5 PHA กระตุ้น (10 pg / มิลลิลิตร 1 วันดูด้านบน) ฮิวเมน CD134 แสดงทีลิมโฟไซต์ถูกสร้างขึ้น เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวและระงับที่ 2x106 cells / มิลลิลิตรในอาหารเลี้ยงเชื้อ RPMI (Gibco) ที่มี 10% ซีรั่มของทารกในครรภ์ลูกวัว25 (Bodinco) และ 50 pg / มิลลิลิตรเจนทาไมซิน (Gibco) เซลล์ที่ถูกเมล็ดที่ 0.1x106 cells / 100 gL / ดี (เช่น 1x106 cells / มิลลิลิตร) ใน 96 หลุมจานก้นแบน (Corning) และได้รับการสัมผัสกับ25.0 lig / mL ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 หรือ 25.0 พี, กรัม / มิลลิลิตรควบคุมฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD40 (PG102; Pangenetics) หรือ 1.0 lig / mL โพลีฮิสทิดีน -tagged รีคอมบิแนนต์ฮิวเมน OX4OL (ใน 30 การปรากฏตัวของ 1: 5 อัตราส่วนโดยโมลเมาส์แอนติ - โพลีฮิสทิดีนแอนติบอดี้; R & D Systems) ที่ 37 ° C / CO2 5% เป็นเวลา 6 วัน หลังจากที่ 6 วัน, มือถือการเพิ่มจำนวนวัดโดยใช้สี(รวมตัว BrdU) เซลล์การเพิ่มจำนวน ELISATM (Roche) และอ่านวิธีELISA (BioRad) ที่นาโนเมตร A450. ดังแสดงในรูปที่ 15 (ค่าเฉลี่ย± SD) ไคเม ริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลนCD134 20E5 (hu20E5) และฮิวเมน OX4OL เหนี่ยวนำให้เกิดการเพิ่มจำนวนในทีลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมนCD134 ที่กระตุ้นด้วย PHA ไม่ได้รับการรักษา (กลางเท่านั้น) หรือการรักษาด้วยการควบคุมฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD40 (huIgG4) 5 ไม่ได้แสดงให้เห็นถึงผลกระทบต่อการกระตุ้น PHA ฮิวเมน CD134 แสดงทีลิมโฟไซต์การเพิ่มจำนวน(ข) การเพิ่มจำนวนของ บริษัท ทีลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน CD134 ที่กระตุ้นด้วย PHA หลังการรักษาด้วยไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล10 แอนติบอดี 20E5 โคลนร่วมกับรีคอม บิแนนต์ฮิวเมน OX4OL PHA กระตุ้น (10 lig / มิลลิลิตร 1 วันดูด้านบน) ฮิวเมน CD134 แสดงทีลิมโฟไซต์ถูกสร้างขึ้น เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวและระงับที่ 2x106 cells / มิลลิลิตรในอาหารเลี้ยงเชื้อRPMI (Gibco) ที่มี 10% ซีรั่มของทารกในครรภ์ลูกวัว (Bodinco) และ 50 lig / mL เจนทาไมซิน (Gibco) เซลล์ที่ถูกเมล็ดที่ 0.1x106cells / 100 4 / ดี (เช่น15 1x106 cells / มิลลิลิตร) ใน 96 หลุมจานแบนด้านล่าง (Corning) และได้สัมผัสกับ 0, 0.025, 0.25, 2.5, 25.0 หรือ figimL ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลน 20E5, และ / หรือร่วมกับ 0, 0.01, 0.1, หรือ 1.0 FTG / mL โพลีฮิสทิดีน - แท็กรีคอมบิแนนต์ฮิว เมน OX4OL (ในที่ที่ 1: 5 เมาส์อัตราส่วนโดยโมลแอนติ - โพลีฮิสทิดีนแอนติบอดี้; R & D Systems) ที่ 37 ° C / CO2 5% เป็นเวลา 6 วัน หลังจากที่ 6 วัน, มือถือ 20 การเพิ่มจำนวนได้รับการวัดโดยใช้สี (การรวมตัว BrdU) เซลล์การเพิ่มจำนวนELISATM (Roche) และอ่านวิธี ELISA (BioRad) ที่นาโนเมตร A450. ดังแสดงในรูปที่ 16 (ค่าเฉลี่ย± SD) ไค เมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลนCD134 20E5 (hu20E5) และฮิวเมน OX4OL ยา dependently เหนี่ยวนำให้เกิดการเพิ่มจำนวนในทีลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน CD134 ที่กระตุ้นด้วย PHA 25 ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 donor- เหนี่ยวนำให้เกิด dependently การเพิ่มจำนวนที่ทั้ง 2.5 และ 25 GG / มิลลิลิตร (ผู้บริจาค 1) หรือที่ 0.25, 2.5 และ 25 pg / มิลลิลิตร ( ผู้บริจาค 2) นอกจากนี้ฮิวเมน OX4OL บริจาคเหนี่ยวนำให้เกิด dependently การเพิ่มจำนวนที่ทั้ง 0.1 และ 1.0 pg / มิลลิลิตร (ผู้บริจาค 1) หรือที่ 0.01, 0.1, และ 1.0 figimL (ผู้บริจาค 2). 30 ดังแสดงในรูปที่ 17 (ค่าเฉลี่ย± SD ) การรวมกันของไคเมริกฮิวเมนIgG4K แอนติ - ฮิวเมน CD134
20E5 โคลนแอนติบอดีใน PHA กระตุ้นฮิวเมน CD134 แสดง CD4 โพซิทีฟทีลิมโฟไซต์
PHA กระตุ้น (10 i.tg มิลลิลิตร / 1 วันดูด้านบน) ฮิวเมน CD134
แสดงทีลิมโฟไซต์ถูกสร้างขึ้น เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวและใส่ที่ 1-2x106
15 เซลล์ / มิลลิลิตรในน้ำแข็งแช่เย็นพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ที่ถูกบ่มกับ 0, 0.007, 0.02,
0.07, 0.2, 0.6, 1.9, 5.6, 16.7, 50.0 หมู / mL ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมน CD134
แอนติบอดีโคลน 20E5 30 นาทีที่ 4 ° ซี หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ถูกบ่มต่อมา 01:50 เจือจาง FITC- ผันเมาส์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี IgG4 (ซิกม่า) เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส หลังจาก 20 กว้างขวางซักผ้าในพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ถูกบ่มกับ 1:10 เจือจาง PE- เมาส์ผันแอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD4 (BD ชีววิทยาศาสตร์) เป็นเวลา 30 นาทีที่4 ° C หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ได้รับการแก้ไขใน 2% ดีไฮด์ในพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 30 นาทีที่ 4 ° C ผูกพันของแอนติบอดีถูกวัดโดยใช้โฟลไซโตเมทรี (FACSCalibur; BD ชีววิทยาศาสตร์). 25 ไคเมริกฮิวเมน IgG4x แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 อิ่มตัวฮิวเมนCD134 โมเลกุลบนพื้นผิว PHA กระตุ้น CD4P ° sitive ทีลิมโฟไซต์ที่ประมาณ 5.0-10.0 pg / มิลลิลิตร (ไม่ได้แสดงข้อมูล) ครึ่งสูงสุดผูกพันได้รับการตั้งข้อสังเกตที่ 1.0 i.ig / มิลลิลิตรสำหรับไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ -. ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 (ไม่ได้แสดงข้อมูล) 30 (ข) ผูกพันของไคเมริกฮิวเมน IgG4x แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล20E5 โคลนแอนติบอดีใน PHA กระตุ้นฮิวเมน CD134 แสดง CD4 โพซิทีฟและ CD8 โพซิทีฟทีลิมโฟไซต์PHA -stimulated (10 พี, กรัม / มิลลิลิตร 1 วันดูด้านบน) ฮิวเมน CD134 แสดงทีลิมโฟไซต์ถูกสร้างขึ้น เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวและใส่ที่ 1-2x106 เซลล์ / มิลลิลิตรในพีบีเอสน้ำแข็งแช่เย็น / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ที่ถูกบ่มกับหรือโดยไม่ต้อง PTG 20.0 มิลลิลิตร / ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 30 5 นาทีที่ 4 ° C หลังจากที่กว้างขวางซักผ้าในพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ถูกบ่มต่อมาเป็นเวลา30 นาทีที่ 4 ° C 1: 200 ปรับลดแพะ PE-ผันแอนติ - ฮิวเมน IgG (FCY เฉพาะ) แอนติบอดี (แจ็คสัน ImmunoResearch) เป็นเวลา 30 นาที ที่ 4 ° C หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ถูกบ่มกับ1:10 เจือจางเมาส์ FITC-ผันแอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD4 (BD 10 ชีววิทยาศาสตร์) หรือที่มีการปรับลด 01:10 เมาส์ FITC-ผันแอนติ - ฮิวเมน CD8 แอนติบอดี (BD ชีววิทยาศาสตร์) ในการตรวจสอบทีลิมโฟไซต์ประชากร หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / น่านเซลล์ได้รับการแก้ไขในไฮด์ 2% ในพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 30 นาทีที่ 4 ° C ผูกพันของแอนติบอดีถูกวัดโดยใช้โฟลไซโตเมทรี (FACSCalibur; BD ชีววิทยาศาสตร์). 15 ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 แสดงให้เห็นโพซิทีฟการย้อมสีใน PHA เปิดใช้งานฮิ วเมน CD4 โพซิทีฟทีลิมโฟไซต์subpopulation และต่ำโพซิทีฟการย้อมสีใน PHA เปิดใช้งานฮิวเมน CD8 โพซิทีฟทีลิมโฟไซต์ subpopulation (ไม่ได้แสดงข้อมูล). 20 (ค) . ผูกพันของไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดี20E5 โคลนบนแอนติ - ฮิวเมน CD3 / แอนติ - ฮิวเมน CD28 กระตุ้นแอนติบอดี beads- กระตุ้นฮิวเมน CD134 แสดง CD4 โพซิทีฟและ CD8 โพซิทีฟทีลิมโฟไซต์ฮิวเมนต่อพ่วงเซลล์โมโนนิวเคลียร์ในเลือด(PBMC) จากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดี 25 (ความยินยอม) ที่แยกได้โดยการหมุนเหวี่ยงหนาแน่นใน Lymphoprep (1.077 กรัม / มิลลิลิตร; Nycomed ) ต่อมา 1x106 PBMC / มิลลิลิตรในอาหารเลี้ยงเชื้อ RPMI-1640 (Gibco) ที่มีซีรั่มน่องทารกในครรภ์ 10% (Bodinco) และ 50 lig / mL เจนทาไมซิน (Gibco) ถูกกระตุ้นด้วยเมาส์ต่อต้านฮิวเมน CD3 / เมาส์แอน ติ - ฮิวเมน CD28 แอนติบอดีลูกปัดกระตุ้น(CD3 ลูกปัด / CD28; Invitrogen) ณ วันที่ 1 ลูกปัด / 4 เซลล์ในกรณีที่ไม่มีหรือ 30 การปรากฏตัวของ 25 U / มิลลิลิตรรีคอมบิแนนต์ฮิวเมนอินเตอร์ลิวคิน -2 ( PeproTech) ที่ 37 ° C / 5% CO2 1 วัน หลังจากวัฒนธรรม PBMC ถูกเก็บเกี่ยวและใส่ที่ 1-2x106 เซลล์ / มิลลิลิตรในพีบีเอสน้ำแข็งแช่เย็น/ บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ที่ถูกบ่มกับหรือโดยไม่ต้อง GG 20.0 มิลลิลิตร / ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 30 นาทีที่4 ° C หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ถูกบ่มต่อมา1: 200 ปรับลดแพะ PE-ผันแอนติ - ฮิวเมน IgG (FCY เฉพาะ) แอนติบอดี(แจ็คสัน ImmunoResearch) เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ถูกบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่ 4 ° C ที่มีการปรับลด 01:10 FITC- 5 เมาส์ผันแอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD4 (BD ชีววิทยาศาสตร์) หรือที่มีการปรับลด 01:10 FITC เมาส์ -conjugated แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD8 (BD ชีววิทยาศาสตร์) ในการตรวจสอบทีลิมโฟไซต์ประชากร หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ได้รับการแก้ไขในไฮด์2% ในพีบีเอส / บีเอสเอ / NaN3 30 นาทีที่ 4 ° C ผูกพันของแอนติบอดีที่ได้รับการวัดโดยใช้โฟลไซโตเมทรี. (FACSCalibur; BD ชีววิทยาศาสตร์) 10 ดังแสดงในรูปที่ 14 ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลน 20E5 แสดงให้เห็นโพซิทีฟการย้อมสี ใน CD3 / CD28 เปิดใช้งานลูกปัดฮิวเมนCD4P ° sitive ทีลิมโฟไซต์ subpopulation และต่ำโพซิทีฟในการย้อมสีCD3 / CD28 เม็ดเปิดใช้งานฮิวเมน CD8P ° sitive ทีลิมโฟไซต์ subpopulation ไม่มีผลกระทบที่เห็นได้ชัดก็สังเกตเห็นโดยใช้รีคอมบิแนนต์ฮิวเมน IL-2 เสริม. 15 ตัวอย่าง 7. ลักษณะทางชีวภาพของไคเมริกฮิวเมน IgG4 / คัปปาแอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5 (ก) การเพิ่มจำนวนของ บริษัท ทีลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน CD134 ที่กระตุ้นด้วย PHA หลังจาก 20 รักษาด้วยไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน20E5 PHA กระตุ้น (10 pg / มิลลิลิตร 1 วันดูด้านบน) ฮิวเมน CD134 แสดงทีลิมโฟไซต์ถูกสร้างขึ้น เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวและระงับที่ 2x106 cells / มิลลิลิตรในอาหารเลี้ยงเชื้อ RPMI (Gibco) ที่มี 10% ซีรั่มของทารกในครรภ์ลูกวัว25 (Bodinco) และ 50 pg / มิลลิลิตรเจนทาไมซิน (Gibco) เซลล์ที่ถูกเมล็ดที่ 0.1x106 cells / 100 gL / ดี (เช่น 1x106 cells / มิลลิลิตร) ใน 96 หลุมจานก้นแบน (Corning) และได้รับการสัมผัสกับ25.0 lig / mL ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 หรือ 25.0 พี, กรัม / มิลลิลิตรควบคุมฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD40 (PG102; Pangenetics) หรือ 1.0 lig / mL โพลีฮิสทิดีน -tagged รีคอมบิแนนต์ฮิวเมน OX4OL (ใน 30 การปรากฏตัวของ 1: 5 อัตราส่วนโดยโมลเมาส์แอนติ - โพลีฮิสทิดีนแอนติบอดี้; R & D Systems) ที่ 37 ° C / CO2 5% เป็นเวลา 6 วัน หลังจากที่ 6 วัน, มือถือการเพิ่มจำนวนวัดโดยใช้สี(รวมตัว BrdU) เซลล์การเพิ่มจำนวน ELISATM (Roche) และอ่านวิธีELISA (BioRad) ที่นาโนเมตร A450. ดังแสดงในรูปที่ 15 (ค่าเฉลี่ย± SD) ไคเม ริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลนCD134 20E5 (hu20E5) และฮิวเมน OX4OL เหนี่ยวนำให้เกิดการเพิ่มจำนวนในทีลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมนCD134 ที่กระตุ้นด้วย PHA ไม่ได้รับการรักษา (กลางเท่านั้น) หรือการรักษาด้วยการควบคุมฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD40 (huIgG4) 5 ไม่ได้แสดงให้เห็นถึงผลกระทบต่อการกระตุ้น PHA ฮิวเมน CD134 แสดงทีลิมโฟไซต์การเพิ่มจำนวน(ข) การเพิ่มจำนวนของ บริษัท ทีลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน CD134 ที่กระตุ้นด้วย PHA หลังการรักษาด้วยไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล10 แอนติบอดี 20E5 โคลนร่วมกับรีคอม บิแนนต์ฮิวเมน OX4OL PHA กระตุ้น (10 lig / มิลลิลิตร 1 วันดูด้านบน) ฮิวเมน CD134 แสดงทีลิมโฟไซต์ถูกสร้างขึ้น เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวและระงับที่ 2x106 cells / มิลลิลิตรในอาหารเลี้ยงเชื้อRPMI (Gibco) ที่มี 10% ซีรั่มของทารกในครรภ์ลูกวัว (Bodinco) และ 50 lig / mL เจนทาไมซิน (Gibco) เซลล์ที่ถูกเมล็ดที่ 0.1x106cells / 100 4 / ดี (เช่น15 1x106 cells / มิลลิลิตร) ใน 96 หลุมจานแบนด้านล่าง (Corning) และได้สัมผัสกับ 0, 0.025, 0.25, 2.5, 25.0 หรือ figimL ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลน 20E5, และ / หรือร่วมกับ 0, 0.01, 0.1, หรือ 1.0 FTG / mL โพลีฮิสทิดีน - แท็กรีคอมบิแนนต์ฮิว เมน OX4OL (ในที่ที่ 1: 5 เมาส์อัตราส่วนโดยโมลแอนติ - โพลีฮิสทิดีนแอนติบอดี้; R & D Systems) ที่ 37 ° C / CO2 5% เป็นเวลา 6 วัน หลังจากที่ 6 วัน, มือถือ 20 การเพิ่มจำนวนได้รับการวัดโดยใช้สี (การรวมตัว BrdU) เซลล์การเพิ่มจำนวนELISATM (Roche) และอ่านวิธี ELISA (BioRad) ที่นาโนเมตร A450. ดังแสดงในรูปที่ 16 (ค่าเฉลี่ย± SD) ไค เมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลนCD134 20E5 (hu20E5) และฮิวเมน OX4OL ยา dependently เหนี่ยวนำให้เกิดการเพิ่มจำนวนในทีลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน CD134 ที่กระตุ้นด้วย PHA 25 ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 donor- เหนี่ยวนำให้เกิด dependently การเพิ่มจำนวนที่ทั้ง 2.5 และ 25 GG / มิลลิลิตร (ผู้บริจาค 1) หรือที่ 0.25, 2.5 และ 25 pg / มิลลิลิตร ( ผู้บริจาค 2) นอกจากนี้ฮิวเมน OX4OL บริจาคเหนี่ยวนำให้เกิด dependently การเพิ่มจำนวนที่ทั้ง 0.1 และ 1.0 pg / มิลลิลิตร (ผู้บริจาค 1) หรือที่ 0.01, 0.1, และ 1.0 figimL (ผู้บริจาค 2). 30 ดังแสดงในรูปที่ 17 (ค่าเฉลี่ย± SD ) การรวมกันของไคเมริกฮิวเมนIgG4K แอนติ - ฮิวเมน CD134
การแปล กรุณารอสักครู่..
( A ) ผูก ลักษณะของฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอล
แอนติบอดีโคลน 20e5 บนผา กระตุ้นฮิวเมน cd134 แสดง CD4 T
โพซิทีฟลิมโฟไซต์ผากระตุ้น ( 10 i.tg/ml 1 วัน ดูข้างบน ) ฮิวเมน cd134 แสดง T
ลิมโฟไซต์ขึ้น . เซลล์เก็บใส่ใน 1-2x106
15 เซลล์ / มล. ในน้ำแข็งแช่เย็น PBS / เอ / nan3 . เซลล์ที่ถูกบ่มกับ 0 , - 0.02
0.07 , 0.2 , 0.6 , 1.9 , 5.6 , 16.7 , 50.0 หมู / ml ไคเมริกฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134
แอนติบอดีโคลน 20e5 สำหรับ 30 นาทีที่ 4 องศา หลังจากอย่างละเอียดล้าง
PBS / เอ / nan3 เซลล์ จัดการแยก 50 fitc เจือจาง -
และเมาส์แอนติเล็กน้อย - ฮิวเมนแอนติบอดี ( Sigma ) เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศา หลังจากซัก 20 อย่างละเอียดใน PBS / เอ / nan3 เซลล์ถูกบ่มกับเจือจาง 1 : 10 PE -
และเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD4 แอนติบอดี ( BD BIOSCIENCES ) สำหรับ 30 นาทีที่
4 องศา หลังจากอย่างละเอียดใน PBS / เอ / ซักผ้า nan3 เซลล์ที่ได้รับการแก้ไขในฟอร์ม 2 %
ใน PBS / เอ / nan3 เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาข้อผูกพันแอนติบอดีคือ
วัดโดยใช้ โฟลไซโตเมทรี ( facscalibur ; BD BIOSCIENCES ) .
25 ไคเมริกฮิวเมน igg4x แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5 อิ่มตัว
ฮิวเมน cd134 พื้นผิวโมเลกุลบนผา กระตุ้น cd4p ° sitive T ลิมโฟไซต์ประมาณ 5.0-10.0 p.g/ml ( ข้อมูลไม่แสดง ) โดยผูกเป็นครึ่ง
สังเกตที่ 1.0 .IG / ml ไคเมริกฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5 ( ข้อมูลไม่แสดง ) .
3
( B ) ผูกพันของไคเมริกฮิวเมน igg4x แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอล
แอนติบอดีโคลน 20e5 บนผา กระตุ้นฮิวเมน cd134 CD4 CD8 T และแสดงโพซิทีฟโพซิทีฟลิมโฟไซต์
ผากระตุ้น ( 10 p , g / ml เป็นเวลา 1 วันดูด้านบน ) ฮิวเมน cd134 แสดง T
ลิมโฟไซต์ขึ้น . เซลล์เก็บใส่ในเซลล์ 1-2x106 / ml ในน้ำแข็งแช่เย็น PBS / เอ / nan3 . เซลล์ที่ถูกบ่มกับค็อคโดยไม่ 20.0 PTG / ml ไคเมริกฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5 30
5 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศา หลังจากอย่างละเอียดซักใน PBS / เอ /
nan3 เซลล์คือเมื่อบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศา C 1:200 เจือจาง PE และแพะแอนติ - ฮิวเมน IgG ( FCY เฉพาะแอนติบอดี ( แจ็คสัน immunoresearch ) สำหรับ 30 นาทีที่ 4 องศา หลังจากอย่างละเอียดซักใน PBS / เอ / nan3 เซลล์ถูกบ่ม
กับ 1 : 10 fitc เจือจางและเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD4 แอนติบอดี ( BD
10 ชีววิทยา ) ค็อค 1 :10 ดอลลาร์ fitc conjugated เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD8
แอนติบอดี ( BD BIOSCIENCES ) เพื่อตรวจหา T ลิมโฟไซต์แต่ละ . หลังจากอย่างละเอียดซักใน PBS / เอ / น่าน เซลล์ที่ถูกกำหนดในฟอร์มาลดีไฮด์ 2% ใน PBS / เอ / nan3 เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศา ผูกพันและการวัดโฟลไซโตเมทรี ( facscalibur BD BIOSCIENCES
; )15 ไคเมริกฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5
) โพซิทีฟ staining บนผาถ่านฮิวเมน CD4 โพซิทีฟ T
ลิมโฟไซต์ subpopulation และต่ำโพซิทีฟ staining บนผาถ่านฮิวเมน CD8 T ลิมโฟไซต์โพซิทีฟ subpopulation ( ข้อมูลไม่แสดง )
20 ( C )ผูกพันของไคเมริกฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอล 20e5 โคลนแอนติบอดีในแอนติ
- ฮิวเมนทันที / แอนติ - ฮิวเมน cd28 แอนติบอดีกระตุ้นลูกปัด -
กระตุ้นฮิวเมน cd134 CD4 CD8 และแสดงโพซิทีฟโพซิทีฟ T
ลิมโฟไซต์
ฮิวเมนเม็ดเลือดขาวปกติ ( 2 ) เซลล์จากผู้บริจาคมีสุขภาพดี 25 ( ความยินยอม ) แยกตามความหนาแน่นปั่นบน lymphoprep ( 1.077
g / ml ; ) ) ต่อมา 1x106 2 / ml ในอาหารเลี้ยงเชื้อ rpmi-1640
( gibco ) ที่มี 10% เซรั่มของลูกวัว ( bodinco ) และ 50 ยกเจนทาไมซิน ( gibco )
/ มิลลิลิตรถูกกระตุ้นด้วยเมาส์ต่อต้านฮิวเมนทันที / เมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd28 แอนติบอดี
แสนงอนลูกปัด ( ทันที / cd28 ลูกปัด ; Invitrogen ) 1 เม็ด / 4 เซลล์ในการปรากฏตัวของค็อค 30 25 U / ml รีคอมบิแนนต์ฮิวเมนอินเตอร์ลิวคิน - 2 ( peprotech ) ที่อุณหภูมิ 37 องศา C / 5 %
CO2 เป็นเวลา 1 วัน หลังจากที่วัฒนธรรม ขาว เก็บใส่ในเซลล์ / มล. ใน 1-2x106
น้ำแข็งเย็น PBS / เอ / nan3 . เซลล์ที่ถูกบ่มกับค็อคโดยไม่ 20.0 GG / ml
ไคเมริกฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5 สำหรับ 30 นาทีที่
4 องศา หลังจากอย่างละเอียดซักใน PBS / เอ / nan3 เซลล์จัดการบ่ม
กับ 1:200 PE เจือจางและแพะแอนติ - ฮิวเมน IgG antibodies
( FCY เฉพาะ )( แจ็คสัน immunoresearch ) สำหรับ 30 นาทีที่ 4 องศา หลังจากอย่างละเอียดล้าง
PBS / เอ / nan3 เซลล์ถูกบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศา C -
5 fitc เจือจาง 1 : 10 และเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD4 แอนติบอดี ( BD BIOSCIENCES ) ค็อคกับ 10
fitc เจือจางและเมาส์แอนติ - ฮิวเมนการศึกษาแอนติบอดี ( BD BIOSCIENCES ) เพื่อตรวจหา T
ลิมโฟไซต์แต่ละ .หลังจากอย่างละเอียดซักใน PBS / เอ / nan3 เซลล์ถูก
คงที่ในฟอร์มาลดีไฮด์ 2% ใน PBS / เอ / nan3 สำหรับ 30 นาทีที่ 4 ° C (
( วัดโดยใช้โฟลไซโตเมทรี ( facscalibur ; BD BIOSCIENCES ) .
10 ดังแสดงในรูปไคเมริก 14 , ฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134
โคลนแอนติบอดี 20e5 แสดงโพซิทีฟ staining บนทันที / cd28 ลูกปัดงาน
ฮิวเมน cd4p ° sitive T ลิมโฟไซต์ subpopulation และต่ำโพซิทีฟ staining บน
ทันที / cd28 ลูกปัดงานฮิวเมน cd8p ° sitive T ลิมโฟไซต์ subpopulation . ไม่พบการใช้รีคอมบิแนนต์
ปรากฏผลฮิวเมน 2 เสริม
15 ตัวอย่าง 7 สมบัติทางชีวภาพของไคเมริกฮิวเมนเล็กน้อยแอนติ -
/ ป้าฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20e5
( A ) การเพิ่มจำนวน t ลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน cd134 ที่กระตุ้นด้วยผาหลัง 20 การรักษาด้วยไคเมริกฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20e5
ผากระตุ้น ( 10 p.g/ml เป็นเวลา 1 วันดูด้านบน ) ฮิวเมน cd134 แสดง T
ลิมโฟไซต์ขึ้น . เซลล์เก็บชั่วคราวที่ 2x106
เซลล์ / มล. ในวัฒนธรรม RPMI ขนาดกลาง ( gibco ) ที่มี 10% fetal คาล์ฟซีรั่ม
25 ( bodinco ) และ 50 เจนทาไมซิน pg / ml ( gibco ) เซลล์มีเมล็ดที่ 0.1x106 เซลล์ / 100
GL / ดี ( เช่น 1x106 เซลล์ / มิลลิลิตร ) 96 หลุมจานก้นแบน ( คอร์น ) และถูก
ตาก 25
แอนติบอดีโคลน 20e5 บนผา กระตุ้นฮิวเมน cd134 แสดง CD4 T
โพซิทีฟลิมโฟไซต์ผากระตุ้น ( 10 i.tg/ml 1 วัน ดูข้างบน ) ฮิวเมน cd134 แสดง T
ลิมโฟไซต์ขึ้น . เซลล์เก็บใส่ใน 1-2x106
15 เซลล์ / มล. ในน้ำแข็งแช่เย็น PBS / เอ / nan3 . เซลล์ที่ถูกบ่มกับ 0 , - 0.02
0.07 , 0.2 , 0.6 , 1.9 , 5.6 , 16.7 , 50.0 หมู / ml ไคเมริกฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134
แอนติบอดีโคลน 20e5 สำหรับ 30 นาทีที่ 4 องศา หลังจากอย่างละเอียดล้าง
PBS / เอ / nan3 เซลล์ จัดการแยก 50 fitc เจือจาง -
และเมาส์แอนติเล็กน้อย - ฮิวเมนแอนติบอดี ( Sigma ) เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศา หลังจากซัก 20 อย่างละเอียดใน PBS / เอ / nan3 เซลล์ถูกบ่มกับเจือจาง 1 : 10 PE -
และเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD4 แอนติบอดี ( BD BIOSCIENCES ) สำหรับ 30 นาทีที่
4 องศา หลังจากอย่างละเอียดใน PBS / เอ / ซักผ้า nan3 เซลล์ที่ได้รับการแก้ไขในฟอร์ม 2 %
ใน PBS / เอ / nan3 เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาข้อผูกพันแอนติบอดีคือ
วัดโดยใช้ โฟลไซโตเมทรี ( facscalibur ; BD BIOSCIENCES ) .
25 ไคเมริกฮิวเมน igg4x แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5 อิ่มตัว
ฮิวเมน cd134 พื้นผิวโมเลกุลบนผา กระตุ้น cd4p ° sitive T ลิมโฟไซต์ประมาณ 5.0-10.0 p.g/ml ( ข้อมูลไม่แสดง ) โดยผูกเป็นครึ่ง
สังเกตที่ 1.0 .IG / ml ไคเมริกฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5 ( ข้อมูลไม่แสดง ) .
3
( B ) ผูกพันของไคเมริกฮิวเมน igg4x แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอล
แอนติบอดีโคลน 20e5 บนผา กระตุ้นฮิวเมน cd134 CD4 CD8 T และแสดงโพซิทีฟโพซิทีฟลิมโฟไซต์
ผากระตุ้น ( 10 p , g / ml เป็นเวลา 1 วันดูด้านบน ) ฮิวเมน cd134 แสดง T
ลิมโฟไซต์ขึ้น . เซลล์เก็บใส่ในเซลล์ 1-2x106 / ml ในน้ำแข็งแช่เย็น PBS / เอ / nan3 . เซลล์ที่ถูกบ่มกับค็อคโดยไม่ 20.0 PTG / ml ไคเมริกฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5 30
5 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศา หลังจากอย่างละเอียดซักใน PBS / เอ /
nan3 เซลล์คือเมื่อบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศา C 1:200 เจือจาง PE และแพะแอนติ - ฮิวเมน IgG ( FCY เฉพาะแอนติบอดี ( แจ็คสัน immunoresearch ) สำหรับ 30 นาทีที่ 4 องศา หลังจากอย่างละเอียดซักใน PBS / เอ / nan3 เซลล์ถูกบ่ม
กับ 1 : 10 fitc เจือจางและเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD4 แอนติบอดี ( BD
10 ชีววิทยา ) ค็อค 1 :10 ดอลลาร์ fitc conjugated เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD8
แอนติบอดี ( BD BIOSCIENCES ) เพื่อตรวจหา T ลิมโฟไซต์แต่ละ . หลังจากอย่างละเอียดซักใน PBS / เอ / น่าน เซลล์ที่ถูกกำหนดในฟอร์มาลดีไฮด์ 2% ใน PBS / เอ / nan3 เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศา ผูกพันและการวัดโฟลไซโตเมทรี ( facscalibur BD BIOSCIENCES
; )15 ไคเมริกฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5
) โพซิทีฟ staining บนผาถ่านฮิวเมน CD4 โพซิทีฟ T
ลิมโฟไซต์ subpopulation และต่ำโพซิทีฟ staining บนผาถ่านฮิวเมน CD8 T ลิมโฟไซต์โพซิทีฟ subpopulation ( ข้อมูลไม่แสดง )
20 ( C )ผูกพันของไคเมริกฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอล 20e5 โคลนแอนติบอดีในแอนติ
- ฮิวเมนทันที / แอนติ - ฮิวเมน cd28 แอนติบอดีกระตุ้นลูกปัด -
กระตุ้นฮิวเมน cd134 CD4 CD8 และแสดงโพซิทีฟโพซิทีฟ T
ลิมโฟไซต์
ฮิวเมนเม็ดเลือดขาวปกติ ( 2 ) เซลล์จากผู้บริจาคมีสุขภาพดี 25 ( ความยินยอม ) แยกตามความหนาแน่นปั่นบน lymphoprep ( 1.077
g / ml ; ) ) ต่อมา 1x106 2 / ml ในอาหารเลี้ยงเชื้อ rpmi-1640
( gibco ) ที่มี 10% เซรั่มของลูกวัว ( bodinco ) และ 50 ยกเจนทาไมซิน ( gibco )
/ มิลลิลิตรถูกกระตุ้นด้วยเมาส์ต่อต้านฮิวเมนทันที / เมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd28 แอนติบอดี
แสนงอนลูกปัด ( ทันที / cd28 ลูกปัด ; Invitrogen ) 1 เม็ด / 4 เซลล์ในการปรากฏตัวของค็อค 30 25 U / ml รีคอมบิแนนต์ฮิวเมนอินเตอร์ลิวคิน - 2 ( peprotech ) ที่อุณหภูมิ 37 องศา C / 5 %
CO2 เป็นเวลา 1 วัน หลังจากที่วัฒนธรรม ขาว เก็บใส่ในเซลล์ / มล. ใน 1-2x106
น้ำแข็งเย็น PBS / เอ / nan3 . เซลล์ที่ถูกบ่มกับค็อคโดยไม่ 20.0 GG / ml
ไคเมริกฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5 สำหรับ 30 นาทีที่
4 องศา หลังจากอย่างละเอียดซักใน PBS / เอ / nan3 เซลล์จัดการบ่ม
กับ 1:200 PE เจือจางและแพะแอนติ - ฮิวเมน IgG antibodies
( FCY เฉพาะ )( แจ็คสัน immunoresearch ) สำหรับ 30 นาทีที่ 4 องศา หลังจากอย่างละเอียดล้าง
PBS / เอ / nan3 เซลล์ถูกบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศา C -
5 fitc เจือจาง 1 : 10 และเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD4 แอนติบอดี ( BD BIOSCIENCES ) ค็อคกับ 10
fitc เจือจางและเมาส์แอนติ - ฮิวเมนการศึกษาแอนติบอดี ( BD BIOSCIENCES ) เพื่อตรวจหา T
ลิมโฟไซต์แต่ละ .หลังจากอย่างละเอียดซักใน PBS / เอ / nan3 เซลล์ถูก
คงที่ในฟอร์มาลดีไฮด์ 2% ใน PBS / เอ / nan3 สำหรับ 30 นาทีที่ 4 ° C (
( วัดโดยใช้โฟลไซโตเมทรี ( facscalibur ; BD BIOSCIENCES ) .
10 ดังแสดงในรูปไคเมริก 14 , ฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134
โคลนแอนติบอดี 20e5 แสดงโพซิทีฟ staining บนทันที / cd28 ลูกปัดงาน
ฮิวเมน cd4p ° sitive T ลิมโฟไซต์ subpopulation และต่ำโพซิทีฟ staining บน
ทันที / cd28 ลูกปัดงานฮิวเมน cd8p ° sitive T ลิมโฟไซต์ subpopulation . ไม่พบการใช้รีคอมบิแนนต์
ปรากฏผลฮิวเมน 2 เสริม
15 ตัวอย่าง 7 สมบัติทางชีวภาพของไคเมริกฮิวเมนเล็กน้อยแอนติ -
/ ป้าฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20e5
( A ) การเพิ่มจำนวน t ลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน cd134 ที่กระตุ้นด้วยผาหลัง 20 การรักษาด้วยไคเมริกฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20e5
ผากระตุ้น ( 10 p.g/ml เป็นเวลา 1 วันดูด้านบน ) ฮิวเมน cd134 แสดง T
ลิมโฟไซต์ขึ้น . เซลล์เก็บชั่วคราวที่ 2x106
เซลล์ / มล. ในวัฒนธรรม RPMI ขนาดกลาง ( gibco ) ที่มี 10% fetal คาล์ฟซีรั่ม
25 ( bodinco ) และ 50 เจนทาไมซิน pg / ml ( gibco ) เซลล์มีเมล็ดที่ 0.1x106 เซลล์ / 100
GL / ดี ( เช่น 1x106 เซลล์ / มิลลิลิตร ) 96 หลุมจานก้นแบน ( คอร์น ) และถูก
ตาก 25
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- ก๋วยเตี๋ยวไข่ยิ้ม
- • If possible, use blast chiller or tumb
- เมื่อเราได้รังไหมแล้วนำรังไหมมาต้มเพื่อเ
- There's a hill by the sea, On the hill t
- หรือหากสรุปรายงานผิดพลาด
- A fish pushes itself forward by moving i
- ชื่อจริงtichawin
- in his book A. New Approach to Industrl4
- Hello. We are IMCGAMES TOS Team.We will
- 2)เพื่อการดำเนินการให้สอดคล้องกับกฎหมายท
- was used for the preparation of the stan
- บุคลิกภาพ
- การเริ่มต้นจากพื้นฐานด้วยการสร้างความผูก
- Continued subduction along Asia's margin
- ระมัดระวัง
- ยุ่งอยาก
- ฉันอยู่ในทีมสโมสรที่มีชื่อเสียงของประเทศ
- Two points can be made here; firsdy that
- My duties are check A.T.A. CARNET about
- Prevented by Hib vaccine
- อินโดนีเซียมีประชากรที่พูดภาษาต่างๆ มากก
- Prevented by Hib vaccine
- ฉันมีสุนัขหนึ่งตัว
- ขออภัยในความไม่สะดวกขอแจ้งให้ทราบว่า ขณะ
