ablation to obtain stages I–IV ovar

ablation to obtain stages I–IV ovaries (N = 32). The gonadosomatic
index (GSI, ovarianweight/body weight × 100) of each shrimpwas calculated.
Ovarian developmental stages of wild broodstock were classified
by conventional histology (Qiu et al., 2005) and divided to
previtellogenic (stage I, N = 10 and 6, average GSI = 0.93 ± 0.36 and
average GSI=1.26±0.37% for intact and eyestalk-ablated broodstock,
respectively), vitellogenic (stage II, N = 7 and 5, average GSI = 2.40 ±
0.58 and average GSI=3.21±0.42%), late vitellogenic (stage III, N=7
and 10, average GSI=5.14±0.59 and average GSI=4.94±0.31%) and
mature (stage IV, N=10 and 11, average GSI=10.47±1.68 and average
GSI= 7.71 ± 1.46%) stages, respectively.
To examine the effects of 5-HT on the expression of PmXbp1, domesticated
18-month-old P. monodon broodstock maintained at the
BMC were sampled and acclimated for 7 days to the laboratory conditions
(28–30 °C and 15 ppt seawater under natural daylight) in
1000-liter fish tanks. Eight groups of female shrimp (average body
weight = 106.80 ± 21.42 g and average GSI = 0.84 ± 0.14%)
were injected intramuscularly into the first abdominal segment
with 5-HT (50 μg/g body weight, N = 4 for each group). Specimens
were collected at 0, 1, 3, 6, 12, 24, 48 and 72 h post injection (hpi).
Shrimp injected with 0.85% saline solution (at 0 hpt, N=4)were included
as the vehicle control (VC).
2.2.2. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)
Expression of PmXbp1185 in ovaries and testes of cultured juveniles
and wild broodstock (N = 5 for each group) were analyzed by RTPCR.
EF-1α500 (F: 5′-ATGGTTGTCAACTTTGCCCC-3′ and R: 5′-TTGACC
TCCTTGATCACACC-3′)was included as the positive control. The thermal
profiles were 94 °C for 3 min followed by 25 cycles of denaturation at
94 °C for 45 s, annealing at 58 °C for 45 s and extension at 72 °C for
1min. The final extension was carried out at 72 °C for 7min. The amplification
product was electrophoretically analyzed by 1.8% agarose gels
and visualizedwith a UV transilluminator after ethidiumbromide staining
(Sambrook and Russell, 2001).
2.2.3. Expression profiles of PmXbp1185 during ovarian development of
intact and eyestalk-ablated P. monodon
PmXbp1185 and the internal control, EF-1α214 (F: 5′-GTCTTCCCCTTC
AGGACGTC-3′ and R: 5′-CTTTACAGACACGTTCTTCACGTTG-3′) were
amplified and electrophoretically analyzed. The gel-eluted product of
each gene was ligated with pGEM-T Easy vector and transformed into
E. coli JM109 following standard protocols (Sambrook and Russell,
2001). Plasmid DNA was extracted and sequenced for both directions.
Standard curves representing 103–108 copies of cloned PmXbp1185
and EF-1α214 in triplicate, were constructed. The expression level of
PmXbp1185 and EF-1α214 in ovaries of each broodstock shrimpwere amplified
in a 10 μL reaction volume containing 5 μL of 2× LightCycler 480
SYBR Green I Master (Roche), 50 ng the first strand cDNA template,
0.2 μM each primer. The thermal profile for quantitative real-time PCR
was 95 °C for 10 min followed by 40 cycles of 95 °C for 30 s, 58 °C for
30 s and 72 °C for 30 s. Quantitative real-time PCR of each specimen
was carried out in duplicate.
2.3. Determination of the role of PmXbp1 in growth
2.3.1. Experimental animals
For determination of the functional involvement of PmXbp1 in growth,
domesticated 3-month-old juveniles (SNP3A sample established from
one female and two males) of P. monodon cultured at the BMC
were randomly collected (the average body weight and total
length = 11.80 ± 3.88 g and 11.23 ± 1.20 cm, N = 350). Pleopods
of each shrimp were dissected out and kept at −20 °C. In addition,
the hepatopancreas of each shrimp was dissected out and placed
in liquid N2 before being transferred to a −80 °C freezer.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

จี้รับขั้นรังไข่ – IV (N = 32) การ gonadosomaticดัชนี (GSI, ovarianweight/ร่าง กายน้ำหนัก× 100) ของแต่ละ shrimpwas คำนวณมีจัดขั้นตอนการพัฒนารังไข่ของพันธุ์ป่าของพ่อแม่โดยปกติมิญชวิทยา (คู et al., 2005) และถูกแบ่งไปprevitellogenic (ระยะที่ I, N = 10 และ 6, GSI เฉลี่ย = 0.93 ± 0.36 และGSI=1.26±0.37% เฉลี่ยสำหรับสูตรเหมือนเดิม และ eyestalk ablatedตามลำดับ), vitellogenic (ระยะ II, N = 7 และ 5, GSI เฉลี่ย = 2.40 ±0.58 และค่าเฉลี่ย GSI=3.21±0.42%), vitellogenic (ขั้นตอนปลาย III, N = 7และ GSI เฉลี่ย 10 = 5.14±0.59 และเฉลี่ย GSI=4.94±0.31%) และผู้ใหญ่ (ระยะที่ IV, N = 10 และ 11, GSI เฉลี่ย = 10.47±1.68 และค่าเฉลี่ยGSI = 7.71 ± 1.46%) ระยะ ตามลำดับตรวจสอบผลกระทบของเอชที 5 ในนิพจน์ของ PmXbp1, domesticatedอายุ 18 เดือน P. monodon สูตรคงที่BMC ได้ความ และ acclimated สำหรับเงื่อนไขปฏิบัติ 7 วัน(28-30 ° C และ 15 ppt ทะเลภายใต้แสงธรรมชาติ) ในถัง 1000 ลิตรปลา กุ้งนาง (เฉลี่ยร่างกาย 8 กลุ่มน้ำหนัก = 106.80 ± 21.42 g และ GSI เฉลี่ย = 0.84 ± 0.14%)มีราชเป็นส่วนท้องแรกกับเอชที 5 (50 น้ำหนักตัว μg/g, N = 4 สำหรับแต่ละกลุ่ม) ไว้เป็นตัวอย่างถูกรวบรวมไว้ที่ 0, 1, 3, 6, 12, 24, 48 และ 72 h ลงฉีด (hpi)ฉีด ด้วย 0.85% น้ำเกลือ (ที่ 0 hpt, N = 4) กุ้งได้รวมเป็นรถควบคุม (VC)2.2.2 การย้อนกลับปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส transcription (RT-PCR)ค่าของ PmXbp1185 ในรังไข่และลิ้ม juveniles อ่างและป่าสูตร (N = 5 สำหรับแต่ละกลุ่ม) ได้วิเคราะห์ โดย RTPCREF-1α500 (F: 5′-ATGGTTGTCAACTTTGCCCC-3′ และ R: 5′-TTGACCTCCTTGATCACACC-3′) ถูกรวมเป็นตัวควบคุมค่าบวก ความร้อนโพรไฟล์ถูก 94 ° C สำหรับ 3 นาทีตาม ด้วยรอบ 25 ของ denaturation ที่94 ° C สำหรับ 45 s การอบเหนียวที่ 58 ° C s 45 และ 72 ° C สำหรับ1 นาที ส่วนขยายสุดท้ายได้ดำเนินที่ 72 ° C ใน 7 นาที ขยายการผลิตภัณฑ์ถูกวิเคราะห์ โดย 1.8% agarose เจ electrophoreticallyและย้อมสี transilluminator visualizedwith UV ที่หลัง ethidiumbromide(Sambrook และรัสเซล 2001)2.2.3 การนิพจน์โพรไฟล์ของ PmXbp1185 ในระหว่างการพัฒนารังไข่ของเหมือนเดิม และ eyestalk ablated P. monodonPmXbp1185 และการควบคุมภายใน EF-1α214 (F: 5′-GTCTTCCCCTTCAGGACGTC-3′ และ R: 5′-CTTTACAGACACGTTCTTCACGTTG-3′) ได้ขยาย และ electrophoretically วิเคราะห์ ผลิตภัณฑ์เจ eluted ของแต่ละยีนควบกับเวกเตอร์กลาย pGEM T และเปลี่ยนเป็นE. coli JM109 ตามโพรโทคอลมาตรฐาน (Sambrook และรัสเซล2001) การสกัด plasmid DNA และเรียงลำดับในทั้งสองทิศทางเส้นโค้งมาตรฐานแทนสำเนา 103-108 PmXbp1185 โคลนและ EF 1α214 ใน triplicate ถูกสร้างขึ้น ระดับการนิพจน์PmXbp1185 และ 1α214 EF ในรังไข่ของแต่ละ shrimpwere สูตรขยายปริมาณปฏิกิริยา 10 μL ประกอบด้วย μL 5 ของ 2 × LightCycler 480SYBR เขียวผมหลัก (Roche), 50 ng แรกสแตรนด์ cDNA ต้น0.2 μM พื้น โพรไฟล์ความร้อนสำหรับ PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ได้ 95 ° C สำหรับ 10 นาทีตาม ด้วยรอบ 40 95 องศาเซลเซียสสำหรับ 30 s, 58 ° C สำหรับ30 s และ 72 ° C สำหรับ 30 s. PCR จริงเชิงปริมาณของแต่ละได้ดำเนินการสำเนา2.3 การกำหนดบทบาทของ PmXbp1 ในการเจริญเติบโต2.3.1 การทดลองสัตว์สำหรับกำหนดการมีส่วนร่วมทำงานของ PmXbp1 ในการเจริญเติบโตบ้านอายุ 3 เดือน juveniles (ตัวอย่าง SNP3A ก่อตั้งขึ้นจากหนึ่งหญิงและสองชาย) ของ P. monodon อ่างที่ BMCถูกสุ่มเก็บรวบรวม (น้ำหนักเฉลี่ยและผลรวมความยาว =± 11.80 3.88 g และ± 11.23 1.20 ซม. N = 350) Pleopodsแต่ละกุ้ง dissected ออก และเก็บไว้ที่ −20 องศาเซลเซียส นอกจากนี้hepatopancreas ของกุ้งแต่ละ dissected ออก และวางใน N2 เหลวก่อนที่จะถูกโอนย้ายไปตู้แช่ −80 ° C

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ที่จะได้รับการผ่าตัดรังไข่ขั้นตอน I-IV (ยังไม่มี = 32) gonadosomatic
ดัชนี (GSI, ovarianweight / น้ำหนักตัว× 100) ของ shrimpwas แต่ละคำนวณ.
ระยะการพัฒนารังไข่ของพ่อแม่พันธุ์ป่าถูกจัดโดยจุลธรรมดา (Qiu et al., 2005) และแบ่งออกเป็น previtellogenic (เวทีผม, N = 10 และ 6 เฉลี่ย GSI = 0.93 ± 0.36 และเฉลี่ยGSI = 1.26 ± 0.37% สำหรับเหมือนเดิมและก้านตา-ระเหยพ่อแม่พันธุ์, ตามลำดับ) vitellogenic (ขั้นตอนที่สอง, N = 7 และ 5 เฉลี่ย GSI = 2.40 ± 0.58 และค่าเฉลี่ย GSI = 3.21 ± 0.42 %) ปลาย vitellogenic (ขั้นตอนที่สาม, N = 7 และ 10 เฉลี่ย GSI = 5.14 ± 0.59 และค่าเฉลี่ย GSI = 4.94 ± 0.31%) และผู้ใหญ่(ขั้นตอนที่สี่, N = 10 และ 11 เฉลี่ย GSI = 10.47 ± 1.68 และค่าเฉลี่ยGSI = 7.71 ± 1.46%) ขั้นตอนตามลำดับ. เพื่อตรวจสอบผลกระทบของ 5-HT ในการแสดงออกของ PmXbp1 ที่บ้าน18 เดือนเก่าพ่อแม่พันธุ์กุ้งกุลาดำการบำรุงรักษาที่บีเอ็มซีได้รับการเก็บตัวอย่างและการปรับตัวเป็นเวลา7 วันกับสภาพห้องปฏิบัติการ(วันที่ 28-30 องศาเซลเซียสและ 15 พีพีทีน้ำทะเลภายใต้แสงธรรมชาติ) ในถังปลา1,000 ลิตร แปดกลุ่มของกุ้งเพศเมีย (ตัวเฉลี่ยน้ำหนัก= 106.80 ± 21.42 กรัมและค่าเฉลี่ย GSI = 0.84 ± 0.14%) ถูกฉีดเข้ากล้ามเนื้อส่วนท้องแรกกับ 5-HT (50 ไมโครกรัม / กรัมน้ำหนักตัว, N = 4 สำหรับแต่ละกลุ่ม) . ชิ้นงานที่ถูกเก็บรวบรวมที่ 0, 1, 3, 6, 12, 24, 48 และ 72 ชั่วโมงฉีดโพสต์ (HPI). กุ้งฉีดน้ำเกลือ 0.85% (ที่ 0 hpt, N = 4) ถูกรวมการควบคุมยานพาหนะ(VC ). 2.2.2 ย้อนกลับถอดความโพลิเมอร์ปฏิกิริยาลูกโซ่ (RT-PCR) การแสดงออกของ PmXbp1185 ในรังไข่และอัณฑะของหนุ่มสาวที่เพาะเลี้ยงและสัตว์ป่าพ่อแม่พันธุ์(ยังไม่มี = 5 สำหรับแต่ละกลุ่ม) ได้รับการวิเคราะห์โดย RTPCR. EF-1α500 (F: 5'-ATGGTTGTCAACTTTGCCCC-3 ' และ R: 5'-TTGACC TCCTTGATCACACC-3) ถูกรวมเป็นควบคุมบวก ระบายความร้อนโปรไฟล์เป็น 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 นาทีตามด้วย 25 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 94 ° C เป็นเวลา 45 วินาที, การอบที่ 58 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 45 และส่วนขยายที่ 72 ° C เป็นเวลา1 นาที ขยายสุดท้ายได้ดำเนินการที่ 72 ° C เป็นเวลา 7 นาที ขยายสินค้าที่ได้รับการวิเคราะห์ electrophoretically 1.8% agarose เจลและvisualizedwith transilluminator UV หลังจากการย้อมสี ethidiumbromide (Sambrook และรัสเซล, 2001). 2.2.3 โปรไฟล์การแสดงออกของ PmXbp1185 ในระหว่างการพัฒนารังไข่ของเหมือนเดิมและก้านตา-ระเหยกุ้งกุลาดำPmXbp1185 และการควบคุมภายใน EF-1α214 (F: 5'-GTCTTCCCCTTC AGGACGTC-3 'และ R: 5'-CTTTACAGACACGTTCTTCACGTTG-3') ได้รับการขยายและวิเคราะห์ electrophoretically ผลิตภัณฑ์เจลชะของยีนแต่ละคนถูกผูกกับ pGEM-T เวกเตอร์ที่ง่ายและเปลี่ยนเป็นอี coli JM109 โปรโตคอลมาตรฐานดังต่อไปนี้ (Sambrook และรัสเซล, 2001) ดีเอ็นเอถูกสกัดและติดใจสำหรับทั้งสองทิศทาง. โค้งมาตรฐานตัวแทน 103-108 สำเนาของ PmXbp1185 โคลนและEF-1α214ในเพิ่มขึ้นสามเท่าถูกสร้างขึ้น ระดับการแสดงออกของPmXbp1185 และ EF-1α214ในรังไข่ของพ่อแม่พันธุ์แต่ละ shrimpwere ขยายในปริมาณปฏิกิริยา10 ไมโครลิตรมี 5 ไมโครลิตรของ 2 × LightCycler 480 SYBR สีเขียวฉันโท (Roche) 50 ng แม่แบบยีนสาระแรก0.2 ไมครอนแต่ละไพรเมอร์ . รายละเอียดความร้อนสำหรับแบบ real-time PCR เชิงปริมาณเป็น95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีตามด้วย 40 รอบของ 95 ° C เป็นเวลา 30 วินาที, 58 ° C เป็นเวลา30 วินาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที เชิงปริมาณแบบ real-time PCR ของแต่ละชิ้นงานที่ได้ดำเนินการในที่ซ้ำกัน. 2.3 การกำหนดบทบาทของ PmXbp1 ในการเจริญเติบโต2.3.1 สัตว์ทดลองสำหรับการตัดสินใจของการมีส่วนร่วมการทำงานของ PmXbp1 ในการเจริญเติบโต, บ้านหนุ่มสาว 3 เดือนเก่า (ตัวอย่าง SNP3A ที่จัดตั้งขึ้นจากผู้หญิงคนหนึ่งและสองเพศ) ของการเพาะเลี้ยงกุ้งกุลาดำที่บีเอ็มซีที่ถูกเก็บรวบรวมแบบสุ่ม(น้ำหนักตัวเฉลี่ยและรวมความยาว= 11.80 ± 3.88 กรัมและ 11.23 ± 1.20 ซม., N = 350) Pleopods ของแต่ละกุ้งถูกชำแหละออกมาและเก็บไว้ที่ -20 ° C นอกจากนี้ตับของแต่ละกุ้งถูกชำแหละออกมาและวางในของเหลวN2 ก่อนที่จะถูกย้ายไปที่ -80 ° C ช่องแช่แข็ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ขั้นตอนการขอรับไอ– IV รังไข่ ( n = 32 ) ดัชนีที่ i
( GSI ovarianweight / , น้ำหนัก× 100 ) ของแต่ละ shrimpwas คำนวณตามขั้นตอนของป่าแม่
รังไข่จำแนก
โดยเนื้อเยื่อปกติ ( Qiu et al . , 2005 ) และแบ่งให้
previtellogenic ( ระยะที่ I , n = 10 และ 6 มีค่าเฉลี่ย = 0.93 ± 0.36 และ
เฉลี่ย GSI = 1.26 ± 037 % เหมือนเดิมและเพื่อเลี้ยง
ablated , ตามลำดับ ) vitellogenic ( ระยะที่ 2 , n = 7 และ 5 มีค่าเฉลี่ย = 2.40 ±
0.58 และมีค่าเฉลี่ย = 3.21 ± 0.42 % ) , สาย vitellogenic ( ระยะที่ III , n =
7 และ 10 มีค่า GSI = 5.14 ± 0.59 และมีค่าเฉลี่ย = 4.94 ± 0.31 % ) และผู้ใหญ่ ( ขั้นตอนที่ 4
, n = 10 และ 11 โดย GSI = 10.47 ± 1.68 และเฉลี่ย
GSI = 7.71 ± 1.46 %
) ขั้นตอนตามลำดับเพื่อศึกษาผลของตัวรับ 5-HT ในการแสดงออกของ pmxbp1 โดดเด่น
18 เดือนเก่าเลี้ยงกุ้งกุลาดำยังคงที่
BMC จำนวนแบบ 7 วัน และให้เงื่อนไขปฏิบัติการ
( 28 – 30 ° C และ 15 ppt น้ำทะเลภายใต้แสงธรรมชาติ )
1 , 000 ลิตร ปลาถัง แปดกลุ่มกุ้งตัวเมีย ( ตัวเฉลี่ยน้ำหนัก =
106.80 ± 21.42 กรัม และร้อยละ 0.84 ± 0.14 GSI = เฉลี่ย )
ฉีดทางช่องท้องเป็นครั้งแรกส่วน
ด้วย 5-HT ( 50 μ g / g น้ำหนัก , n = 4 สำหรับแต่ละกลุ่ม ) การเก็บรวบรวมตัวอย่าง
0 , 1 , 3 , 6 , 12 , 24 , 48 และ 72 ชั่วโมงหลังการฉีด ( HPI )
กุ้งฉีดสารละลาย น้ำเกลือ 0.85 % ( ที่ 0 HPT , n = 4 ) รวม
เป็นตัวควบคุมยานพาหนะ ( VC )
2.2.2 . ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสแบบย้อนกลับ ( RT-PCR )
การแสดงออกของรังไข่และอัณฑะ pmxbp1185 ในการเลี้ยงหอย และป่าแม่
( n = 5 สำหรับแต่ละกลุ่ม ) วิเคราะห์ข้อมูลโดย rtpcr .
ef-1 α 500 ( f : 5 ’ - ’ atggttgtcaactttgcccc-3 และ R : 5 ’ - ’ ttgacc
tccttgatcacacc-3 ) ถูกรวมเป็นตัวควบคุมบวก โปรไฟล์ร้อน
เท่ากับ 94 °องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 นาที ตามด้วย 25 รอบ ที่ 94 ° C (
45 วินาทีขนาด 58 องศา C เป็นเวลา 45 และส่วนขยายที่ 72 ° C
1min นามสกุลสุดท้ายถูกดำเนินการที่ 72 ° C (
7min ผลิตภัณฑ์ถูก electrophoretically วิเคราะห์ 1.8% , และยูวีเจล
visualizedwith transilluminator หลังจาก ethidiumbromide staining
( sambrook และ Russell , 2001 ) .
2.2.3 . แสดงโปรไฟล์ของ pmxbp1185 ในระหว่างการพัฒนารังไข่ของ
เหมือนเดิมและ Other ablated Pกุ้งกุลาดำ
pmxbp1185 และการควบคุมภายใน ef-1 α 214 ( f : 5 ’ - ’ gtcttccccttc
aggacgtc-3 และ R : 5 ’ - ’ ctttacagacacgttcttcacgttg-3 )
อัตรา และ electrophoretically วิเคราะห์ เจลตัวอย่างผลิตภัณฑ์ของแต่ละยีนที่ถูกผูกด้วย

pgem-t เวกเตอร์ง่ายและแปลงเป็น E . coli ที่มีดังต่อไปนี้โปรโตคอลมาตรฐาน ( sambrook และรัสเซลล์
2001 )พลาสมิดดีเอ็นเอ และลำดับสำหรับทั้งสองทิศทาง .
มาตรฐานเส้นโค้งแทน 103 –ของโคลนและ pmxbp1185
ef-1 α 214 ทั้งสามใบ , 108 เล่ม ถูกสร้างขึ้น ระดับการแสดงออกของ pmxbp1185 ef-1
และα 214 ในรังไข่ของแม่ของแต่ละ shrimpwere
ใน 10 μ L ปฏิกิริยาปริมาณที่มี 5 μ L 2 × lightcycler 480
SYBR สีเขียวต้นแบบ ( โรช )เกลียวดีเอ็นเอแม่แบบแรก 50 ng , m
2 μแต่ละรองพื้น ข้อมูลเชิงปริมาณแบบเรียลไทม์พีซีอาร์
ความร้อน 95 องศา C นาน 10 นาที ตามด้วย 40 รอบ 95 องศา C 30 s 58 องศา C
30 และ 72 ° C เป็นเวลา 30 วินาที ปริมาณ เวลา เทคนิคของแต่ละตัวอย่างถูกหามออกในซ้ำ
.
2.3 การกำหนดบทบาทของ pmxbp1 ในการเจริญเติบโต
2.3.1 .
สัตว์ทดลองสำหรับการมีส่วนร่วมในการทำงานของ pmxbp1 การเจริญเติบโต
โดดเด่น 3-month-old และ snp3a ตัวอย่างขึ้นจาก
หนึ่งหญิงและชาย 2 คน ) ของกุ้งกุลาดำ เลี้ยงที่ BMC
สุ่ม ( น้ำหนักตัวเฉลี่ยและความยาวรวม
= 11.80 ± 3.88 กรัม และ 11.23 ± 1.20 ซม. , N = 350 ) pleopods
แต่ละกุ้งถูกตัดออก และเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 20 ° C −นอกจากนี้
ในตับและตับอ่อนของกุ้ง ผ่าแต่ละออกและวางไว้ในไนโตรเจนเหลว
ก่อนที่จะถูกโอนไปยัง บริษัท เวสเทิร์น 80 ° C ช่องแช่แข็ง