We prehybridise and then hybridise

We prehybridise and then hybridise the membrane in
50% deionised formamide (Sigma), 5 × Denhardt’s reagent, 5 × SSPE, 1% sodium dodecyl sulphate (SDS) and 150 µg/ml
homomix (denatured yeast transfer RNA; Ref. 4), in a heatsealed plastic bag for at least 1 hour at 42◦C. Homomix is
used as a blocking agent and we find it more effective in reducing background than salmon sperm DNA. It is prepared
using 5 g of type VI torula yeast RNA (Sigma), to which
22 ml of distilled water and 3 ml 5 M potassium hydroxide
are added. The solution is incubated overnight at 37◦C with
shaking and then neutralized with a small amount of 1 M
hydrochloric acid, followed by two phenol-chloroform extractions. The denatured RNA is recovered either by freeze
drying or precipitation using 1/10 volume of 3 M sodium
acetate (pH 5.4) and 2.5 volumes of ethanol, at −20◦C for
1 hour, followed by centrifugation. Homomix should be
stored at −20◦C and dissolved in distilled water at 50 mg/ml
prior to use. After prehybridisation, the prehybridisation
solution is then removed and replaced with fresh solution containing a denatured radiolabelled probe. Probes
should be labelled to high specific activity by random priming (Ref. 5). We use a ‘kit’ version of this method [Quick
PrimeTM (Pharmacia)], according to the manufacturers instructions.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เรา prehybridise และ hybridise เมมเบรนในแล้ว50% deionised formamide (ซิกมา), 5 × Denhardt ของรีเอเจนต์ 5 × SSPE, 1% โซเดียมซัลเฟต dodecyl (SDS) และไมโครกรัมเป็นเครื่อง 150 mlhomomix (denatured ยีสต์ทีอาร์เอ็นเอ อ้างอิง 4), ในถุงพลาสติก heatsealed ที่ 42◦C อย่างน้อย 1 ชั่วโมง Homomix เป็นใช้เป็นตัวแทนการบล็อคและเราพบว่ามีประสิทธิภาพในการลดพื้นหลังกว่าอสุจิปลาแซลมอนดีเอ็นเอ เป็นเตรียมใช้ 5 กรัมยีสต์ torula VI ชนิดอาร์เอ็นเอ (ซิกมา), ที่22 ml ของกลั่นน้ำและมล 3 5 M โพแทสเซียมไฮดรอกไซด์บวก การแก้ปัญหาคือ incubated ค้างคืนที่ 37◦C ด้วยสั่นแล้ว neutralized ที่น้อยม. 1กรดไฮโดรคลอริก ตามสกัดวางคลอโรฟอร์ม 2 อาร์เอ็นเอ denatured ควบคุมหรือ โดยการแช่แข็งแห้งหรือฝนโดยใช้เสียง 1/10 ของ 3 M โซเดียมacetate (pH 5.4) และเอทานอล ที่ −20◦C ในปริมาณ 2.51 ชั่วโมง ตาม centrifugation Homomix ควรเก็บไว้ที่ −20◦C และละลายในน้ำกลั่นที่ 50 mg/mlก่อนที่จะใช้ หลังจาก prehybridisation, prehybridisation ที่โซลูชันมีแล้วเอาออก และแทนที่ ด้วยโซลูชันที่ประกอบด้วยการโพรบ radiolabelled denatured สด คลิปปากตะเข้ควรสามารถ labelled สูงเฉพาะกิจกรรม โดยสุ่มด้วย (อ้างอิงที่ 5) เราใช้รุ่น 'ชุด' วิธีนี้ [ด่วนPrimeTM (Pharmacia)], ตามคำแนะนำของผู้ผลิต

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เรา prehybridise แล้ว hybridise เมมเบรนใน
50% deionised formamide (ซิกม่า) 5 ×น้ำยา Denhardt ของ 5 × SSPE โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต 1% (SDS) และ 150 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร
homomix (โอนยีสต์เอทิลแอลกอฮอล์ RNA; Ref. 4) ในถุงพลาสติก heatsealed เป็นเวลาอย่างน้อย 1 ชั่วโมงที่42◦C Homomix
ถูกใช้เป็นตัวแทนการปิดกั้นและเราพบว่ามันมีประสิทธิภาพมากขึ้นในการลดพื้นหลังกว่าดีเอ็นเอของอสุจิปลาแซลมอน มันจะถูกจัดเตรียมโดยใช้ 5 กรัมประเภท VI torula ยีสต์อาร์เอ็นเอ (ซิกม่า) ที่ 22 ml ของน้ำกลั่นและ 3 มล. 5 เอ็มไฮดรอกไซโพแทสเซียมที่มีการเพิ่ม การแก้ปัญหาคือบ่มค้างคืนที่37◦Cกับสั่นและเป็นกลางแล้วมีจำนวนน้อย 1 M กรดไฮโดรคลอตามด้วยสองสกัดสารฟีนอลคลอโรฟอร์ม RNA เอทิลแอลกอฮอล์มีการกู้คืนทั้งโดยการแช่แข็งอบแห้งหรือการเร่งรัดการใช้1/10 ปริมาณของ 3 เอ็มโซเดียมอะซิเตท (pH 5.4) และ 2.5 ปริมาณเอทานอลที่-20◦Cสำหรับ 1 ชั่วโมงตามด้วยการหมุนเหวี่ยง Homomix ควรจะเก็บไว้ที่-20◦Cและละลายในน้ำกลั่นที่50 mg / ml ก่อนที่จะใช้ หลังจาก prehybridisation, prehybridisation การแก้ปัญหาจะถูกลบออกแล้วและแทนที่ด้วยวิธีการแก้ปัญหาที่สดใหม่ที่มีการสอบสวน radiolabelled เอทิลแอลกอฮอล์ พร็อบควรจะระบุว่ากิจกรรมสูงโดยเฉพาะรองพื้นแบบสุ่ม (Ref. 5) เราใช้รุ่น 'ชุด' ของวิธีการนี้ [ด่วนPrimeTM (Pharmacia)] ตามคำแนะนำของผู้ผลิต

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เรา prehybridise แล้ว hybridise เมมเบรนใน
50% deionised ฟอร์มาไมด์ ( Sigma ) 5 × denhardt รีเอเจนต์ , 5 × sspe 1% โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต ( SDS ) และ 150 µ g / ml
homomix ( โอนยีสต์ใช้ RNA ; ) 4 ) ในถุงพลาสติก heatsealed อย่างน้อย 1 ชั่วโมง ที่ 42 ◦ C homomix คือ
ใช้เป็นสารบล็อก และเราพบว่ามันมีประสิทธิภาพมากในการลดพื้นกว่าปลาแซลมอนดีเอ็นเอของอสุจิ มันเตรียม
ใช้ 5 กรัม ยีสต์ชนิด 6 ทอรูลา RNA ( Sigma ) ซึ่ง
22 มล. น้ำกลั่นและ 3 ml 5 M โพแทสเซียมไฮดรอกไซด์
จะถูกเพิ่ม การแก้ปัญหาคือบ่มค้างคืนที่ 37 ◦ C
สั่นแล้วก็เป็นกลางกับจำนวนเล็ก ๆของกรดไฮโดรคลอริค 1 M
ตามด้วยสองสกัดคลอโรฟอร์ม ฟีนอล ยีนเกิดได้ทั้งโดยแช่แข็ง
ทำให้แห้งหรือการตกตะกอนโดยใช้ 1 / 10 ปริมาณของโซเดียมอะซีเตท
3 M ( pH 5.4 ) และ 2.5 ปริมาณเอทานอลที่ 20 −◦ C
1 ชั่วโมง ตามด้วยการปั่นเหวี่ยง homomix ควรจะ
อุณหภูมิ− 20 ◦ C และละลายในน้ำกลั่นที่ 50 mg / ml
ก่อนที่จะใช้ หลังจาก prehybridisation , prehybridisation
การแก้ปัญหาแล้วลบออกและแทนที่ด้วยสดโซลูชั่นที่มีใช้ radiolabelled สอบสวนและควรระบุกิจกรรมที่เฉพาะเจาะจง
สูงโดยการไล่ลม ( อ้างอิงที่ 5 ) เราใช้ ' ชุด ' รุ่นของวิธีการนี้
primetm ( มุ่งมั่น ) [ ด่วน ] , ตามที่ผู้ผลิตแนะนำ