2.3. Preparation of samples and sta

2.3. Preparation of samples and standards
Saponin-enriched extracts were prepared following the protocol of
Gurfinkel & Rao (2001) with slight modifications. 10 g of milled powder
was extracted in methanol (40 mL) for 4 h at 50 °C with gentle agitation
in a water bath. Every 30 min, the suspensions were thoroughly mixed.
The saponin-containing methanol extracts were filtered and the sample
residue was washed with additional methanol, obtaining a final volume
of 50 mL. Afterwards, a clean-up procedure was performed to separate
the saponins from accompanying compounds (e.g. sugar, proteins). To
this end, a 10 mL aliquot of the methanol extract was mixed in a 1:2
ratio with 0.4 M ammonium sulfate and the solution was left on a shaker
for at least 20 h. The resulting precipitate containing the non-saponin
constituents was removed by centrifugation (3.225 ×g, 30 min) at
room temperature. The precipitate was washed with a 1:2 (v/v) mixture
of methanol and 0.4 M ammonium sulfate, centrifuged and the supernatants
were combined (total volume 20 mL). Subsequently, the saponinrich
extracts were evaporated to dryness under a stream of gaseous
nitrogen. The dried residue was dissolved in 5 mL of double distilled
water (ddH2O) and mixed thoroughly. To get as pure saponin fractions
as possible further sample preparation by solid phase extraction (SPE)
was required. For this purpose Chromabond C18 polypropylene
columns (500 mg adsorbent, 6 mL, Macherey–Nagel GmbH & Co. KG)
were pre-conditioned with methanol (6 mL) and equilibrated with
ddH2O (6 mL). The sample (5 mL) was slowly passed through the
column, whereby the saponins are retained by the adsorbent. The
cartridge was washed with a mixture of ddH2O and methanol (95:5,
v/v, 3 mL). The purification and fractionation of saponins was carried
out in five steps (fractions I–V, 3 mL) with a methanol–water gradient
with an alkaline pH by adding 17% ammonia solution. The different
fractions collected were evaporated under a stream of nitrogen and
brought to a defined volume depending on the saponin concentration
in each fraction and the type of sample (hulls or peeled seeds). Dissolving
the sample residues was performed with the corresponding eluent
as previously used for the SPE. In this regard, fractions I, II, and III
extracted from hulls were dissolved in 0.5 mL whereas fractions IV and
V were dissolved in 0.2 mL. In contrast, the first three fractions from the
peeled peas were resolved in 0.25 mL and the last two in 0.125 mL eluent,
respectively. In accordance with preliminary investigations only fractions
II, III, and IV contained the DDMP saponin and the saponin B.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3. เตรียมตัวอย่างและมาตรฐานSaponin อุดมไปสารสกัดเตรียมไว้ตามโพรโทคอลของGurfinkel และราว (2001) มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย สารผง 10 กรัมสกัดในเมทานอล (40 มล.) สำหรับ h 4 ที่ 50 ° C มีอาการกังวลต่อเบา ๆในห้องน้ำ ทุก 30 นาที พักถูกสะอาดผสมการ saponin ประกอบด้วยเมทานอลสารสกัดจากถูกกรองและตัวอย่างสารตกค้างถูกล้าง ด้วยเพิ่มเติมเมทานอล ได้รับเล่มสุดท้ายของ 50 mL หลังจากนั้น ทำตอนล้างแยกsaponins จากสาร (เช่นน้ำตาล โปรตีน) ที่มาพร้อมกับ ถึงการนี้ ส่วนลงตัว 10 mL ของสารสกัดเมทานอลถูกผสม 1:2อัตรา 0.4 M แอมโมเนียซัลเฟตและโซลูชันถูกทิ้งเป็นเชคเกอร์สำหรับที่ 20 h Precipitate ได้ที่ประกอบด้วยไม่ใช่-saponinconstituents ถูกเอาออก โดย centrifugation (3.225 × g, 30 นาที) ที่ที่อุณหภูมิห้อง Precipitate ถูกล้าง ด้วยส่วนผสม 1:2 (v/v)เมทานอลและ 0.4 M แอมโมเนียซัลเฟต centrifuged และ supernatantsได้รวม (รวมปริมาณ 20 mL) ในเวลาต่อมา saponinrichบางส่วนได้หายไปกับความแห้งกร้านภายใต้กระแสเป็นต้นไนโตรเจน สารตกค้างแห้งถูกละลายใน 5 mL ของคู่กลั่นน้ำ (ddH2O) และผสมอย่างละเอียด จะเป็นเศษส่วนแท้ saponinเป็นอีกตัวอย่างเตรียม โดยแยกเฟสของแข็ง (SPE)ถูกต้อง สำหรับวัตถุประสงค์ Chromabond C18 ชนิดนี้คอลัมน์ (adsorbent 500 มิลลิกรัม 6 mL, Macherey – Nagel GmbH & Co. KG)ปรับอากาศล่วงหน้า ด้วยเมทานอล (6 mL) และ equilibrated ด้วยddH2O (6 มล.) ตัวอย่าง (5 mL) ถูกช้าผ่านการคอลัมน์ โดย saponins เก็บไว้ โดย adsorbent ที่ตลับหมึกถูกล้าง ด้วยส่วนผสมของ ddH2O และเมทานอล (95:5v/v, 3 mL) ทำการฟอกและการแยกส่วนของ saponinsใน 5 ขั้นตอน (ส่วนฉัน – V, 3 mL) กับเมทานอลน้ำไล่มี pH เป็นด่างโดยการเพิ่ม 17% แอมโมเนียโซลูชัน ที่แตกต่างกันส่วนที่รวบรวมได้หายไปภายใต้กระแสของไนโตรเจน และถึงปริมาณที่กำหนดขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของ saponinในแต่ละส่วนและชนิดของตัวอย่าง (hulls หรือเมล็ด peeled) ยุบทำตกอย่างกับ eluent ที่สอดคล้องกันก่อนหน้านี้ที่ ใช้ใน SPE ในเรื่องนี้ ส่วนฉัน II และ IIIสกัดจาก hulls ถูกละลายใน 0.5 mL ในขณะที่เศษส่วน IV และV ได้ละลายใน 0.2 mL ในทางตรงข้าม ส่วนสามอันดับแรกจากการถั่วลันเตา peeled ได้รับการแก้ไขใน 0.25 mL และสองใน 0.125 mL eluent ที่ล่าสุดตามลำดับ ตามการตรวจสอบเบื้องต้นเฉพาะส่วนII, III และ IV ประกอบด้วย DDMP saponin และ saponin B.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3
การเตรียมการของกลุ่มตัวอย่างและมาตรฐานสารสกัดซาโปนินที่อุดมด้วยดังต่อไปนี้ได้จัดทำโพรโทคอของ
Gurfinkel และราว (2001) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย 10
กรัมผงแป้งถูกสกัดในเมทานอล(40 มิลลิลิตร) 4 ชั่วโมงที่ 50 ° C
ที่มีการกวนอ่อนโยนในอ่างน้ำ ทุก 30 นาทีแขวนลอยที่ถูกผสม. ซาโปนินสารสกัดที่มีส่วนผสมของเมทานอลถูกกรองและตัวอย่างที่เหลือถูกล้างด้วยเมทานอลที่เพิ่มขึ้นได้รับเล่มสุดท้ายของ50 มล หลังจากนั้นขั้นตอนการทำความสะอาดที่ได้ดำเนินการที่จะแยกsaponins จากสารประกอบ (เช่นน้ำตาลโปรตีน) ที่จะสิ้นสุดนี้ aliquot 10 มิลลิลิตรของสารสกัดเมทานอลผสมใน 1: 2 อัตราส่วน 0.4 M แอมโมเนียมซัลเฟตและการแก้ปัญหาที่ถูกทิ้งไว้ในเครื่องปั่นอย่างน้อย20 ชั่วโมง ตะกอนที่เกิดขึ้นที่มีซาโปนินที่ไม่เป็นคนละถูกลบออกโดยการหมุนเหวี่ยง (3.225 ×กรัม 30 นาที) ที่อุณหภูมิห้อง ตะกอนถูกล้างด้วย 1: 2 (v / v) มีส่วนผสมของเมทานอลและ0.4 M แอมโมเนียมซัลเฟต, ปั่นและ supernatants มารวมกัน (ปริมาณ 20 มิลลิลิตร) ต่อจากนั้น saponinrich สารสกัดถูกระเหยแห้งภายใต้กระแสของก๊าซไนโตรเจน ที่เหลือแห้งถูกละลายใน 5 มิลลิลิตรคู่กลั่นน้ำ(ddH2O) และผสม จะได้รับเป็นเศษส่วนซาโปนินบริสุทธิ์เป็นเตรียมตัวต่อไปได้โดยการสกัดของแข็ง (SPE) ที่ถูกต้อง เพื่อจุดประสงค์นี้ Chromabond C18 โพรพิลีนคอลัมน์(500 มก. ดูดซับ, 6 มิลลิลิตร Macherey-Nagel GmbH & Co. KG) ได้ก่อนพร้อมด้วยเมทานอล (6 มิลลิลิตร) และ equilibrated กับddH2O (6 มิลลิลิตร) กลุ่มตัวอย่าง (5 มิลลิลิตร) ก็ผ่านไปอย่างช้า ๆ ผ่านคอลัมน์โดยซาโปนินที่มีการเก็บรักษาไว้โดยตัวดูดซับ ตลับหมึกถูกล้างด้วยส่วนผสมของ ddH2O และเมทานอล (95: 5, ปริมาตร / ปริมาตร 3 มิลลิลิตร) บริสุทธิ์และแยกของซาโปนินได้ดำเนินการในขั้นตอนที่ห้า (เศษส่วน I-V 3 มิลลิลิตร) ที่มีการไล่ระดับสีเมทานอลน้ำที่มีค่าความเป็นกรดเป็นด่างโดยการเพิ่มสารละลายแอมโมเนีย17% แตกต่างกันเศษส่วนถูกเก็บรวบรวมระเหยภายใต้กระแสของไนโตรเจนและนำไปสู่การกำหนดปริมาณขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของซาโปนินในแต่ละส่วนและประเภทของกลุ่มตัวอย่าง(เปลือกหรือเมล็ดปอกเปลือก) ละลายสารตกค้างกลุ่มตัวอย่างได้รับการดำเนินการกับตัวชะที่สอดคล้องกันที่ใช้ก่อนหน้านี้สำหรับSPE ในเรื่องนี้เศษส่วน I, II และ III สกัดจากเปลือกถูกกลืนหายไปในขณะที่ 0.5 มิลลิลิตรเศษส่วน IV และV ถูกกลืนหายไปใน 0.2 มิลลิลิตร ในทางตรงกันข้ามครั้งแรกที่สามเศษส่วนจากถั่วปอกเปลือกได้รับการแก้ไขใน 0.25 มิลลิลิตรและทั้งสองที่ผ่านมาในตัวชะมิลลิลิตร 0.125, ตามลำดับ สอดคล้องกับการตรวจสอบเบื้องต้นเพียงเศษส่วนII, III และ IV บรรจุ DDMP ซาโปนินและซาโปนินบี

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 การเตรียมการของตัวอย่างและซาโปนินมาตรฐาน
อุดมสารสกัดจะถูกทำขึ้นตามโปรโตคอลของ
gurfinkel & Rao ( 2001 ) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย 10 กรัมของผงสารสกัดเมทานอล
( 40 ml ) 4 H 50 ° C
กวนอ่อนโยนในอ่างน้ำ ทุก 30 นาที , สารแขวนลอยผสมอย่างทั่วถึง ประกอบด้วยสารสกัดเมทานอลเป็นอังกฤษ

กรองและตัวอย่างกาก ก็ล้างด้วยเมทานอลเพิ่มเติมขอรับ
เล่มสุดท้ายของ 50 มล. หลังจากนั้น ขั้นตอนทำความสะอาด ได้แยกจากสารประกอบ saponins
ประกอบ ( เช่นน้ำตาล โปรตีน )

จบนี้ 10 ml ส่วนลงตัวของเมทานอลผสมในอัตราส่วน 1 : 2
0 M ด้วยแอมโมเนียม ซัลเฟตและโซลูชั่นถูกทิ้งไว้บนเครื่องปั่น
อย่างน้อย 20 ชั่วโมงเกิดตกตะกอน ประกอบด้วยองค์ประกอบที่ไม่ใช่ซาโปนิน
ถูกลบออกโดยการเหวี่ยงแยก ( 3.225 × g
30 นาที ) ที่อุณหภูมิห้อง ที่ถูกล้างด้วย 1 : 2 ( v / v ) ส่วนผสม
ของเมทานอลและ 0.4 M แอมโมเนียมซัลเฟต ไฟฟ้าและ supernatants
ร่วม ( ปริมาณ 20 ml รวม ) โดยมี saponinrich
สารระเหยแห้งภายใต้กระแสของไนโตรเจน เป็นต้น

กากแห้งละลายใน 5 มล. คู่กลั่น
น้ำ ( ddh2o ) และผสมอย่างทั่วถึง จะเป็นเศษส่วนอังกฤษเพียว
เป็นไปได้เพิ่มเติมตัวอย่างที่เตรียมโดยการสกัดแยกด้วยเฟสของแข็ง ( SPE )
ถูกต้อง สำหรับวัตถุประสงค์นี้ chromabond c18 Polypropylene
คอลัมน์ ( 500 มิลลิกรัม ตัวดูดซับ macherey –นาเกล GmbH & . กก. 6 ml )
) ก่อนปรับอากาศที่มีเมทานอล ( 6 กรัม ) และ equilibrated กับ
ddh2o ( 5 ml ) ตัวอย่าง ( 5 ml ) เป็นอย่างช้า ๆผ่าน
คอลัมน์ ซึ่งซาโปนินจะถูกเก็บไว้โดยตัวดูดซับ
ล้างตลับหมึกที่มีส่วนผสมของ ddh2o และเมทานอล ( 95:5
, v / v , 3 ml ) การทำให้บริสุทธิ์และองค์ประกอบของซาโปนินได้ด
ออกมาใน 5 ขั้นตอน ( สำหรับผม ) V , 3 ml ) กับเมทานอลและน้ำลาด
ที่มีความเป็นกรดด่างโดยการเติมสารละลายแอมโมเนีย 17 %ความแตกต่าง
เศษส่วนแบบสอบถามระเหยภายใต้กระแสของไนโตรเจนและ
นำมากำหนดปริมาณขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของซาโปนิน
ในแต่ละส่วน และชนิดของตัวอย่าง ( เปลือกหรือเมล็ดปอกเปลือก ) ละลาย
ตัวอย่างตกค้างได้ กับตัวที่เป็นก่อนหน้านี้
ใช้สำหรับเอสพีอี . ในเรื่องนี้ ส่วน I , II และ III