Materials and methodsMosquito larva

Materials and methods
Mosquito larvae
The Ae. albopictus larvae used in this study were kindly provided by
the Insect Physiology Laboratory of Chonbuk National University, Korea.
The mosquito larvae were kept at 28±1 °C, 65±5% of relative humidity
(RH) with a photoperiod of 16:8 (L:D) and feed with artificial diet in
the laboratory (Shin and Lee, 2014).

Isolation and identification of entomopathogenic fungi
Entomopathogenic fungal isolates were collected from soil by placing
Tenebrio molitor (mealworm) larvae on the soil for two weeks and
isolating the out-grown fungi from the surfaces of cadavers. The collection
of soil samples are summarized in Table 1. The fungal isolates were
identified by sequencing the internal transcribed spacer (ITS) region
and examining the morphological characteristics. The newly identified
and recorded isolates in Korea were firstly stored at Inset Molecular
and Biotechnological Laboratory (IMBL) of Chonbuk National University
as conidial suspensions in 20% glycerol at −80 °C (Humber, 1997) and
then deposited at the National Institute of Biological Resources (NIBR;
www.nibr.go.kr) (Incheon, Korea).

Solid culture condition
The fungal isolates were cultured on quarter-strength Sabouraud
dextrose agar (1/4 SDA) (pH 6) in Petri dishes (60-mm diam.) in the
dark at 25 ± 1 °C for 10 days (Humber, 2005). Conidia were collected
by vortexing the agar blocks (6 mm diam.) in an Eppendorf-tube containing
0.03% siloxane solution (Silwet L-77, Momentive Performance
Materials Inc.). The numbers of conidia were counted with a hemocytometer
at 400× magnification (3 times per isolate). Conidia with
N90% viabilitywere kept in a refrigerator at 4 °C for 3–4 days before use.


Millet-based solid culture
The fungal isolates were solid cultured using the millet-based culture
system (Bartlett and Jaronski, 1988; Li and Feng, 2005; Kim et al.,
2011). To prepare inocula for the solid cultures, a conidial suspension
from 3 sporulated agar blocks (6-mm diam.) of M. anisopliae JEF-003
was added to quarter-strength Sabouraud dextrose broth in a 250-ml
flask. Flasks were held on a rotary shaker (150 rpm) at 25 ± 2 °C for
3 days. Millet (Panicummiliaceum) grains (200 g)were placed in a polyvinyl
bag, soaked in 100 ml of water containing citric acid (0.4 ml l−1)
and autoclaved at 120 °C for 15 min. The bag was then cooled to ambient
temperature. The liquid culture broth (3 ml) was introduced into
the bag and thoroughly mixed. All bags were held for 6 days at 25 ±
1 °C and a 16:8 (L/D) photoperiod. After incubation, mycotized GRs
were dried at ambient temperature for 3 days, until the moisture content
reached b5% (determined by a moisture analyzer [Sartorius
Omnimark]). All batches of mycotized GRs were assessed for conidial
concentration (g−1) with a hemocytometer.


Fungal transformation
To observe the infection of the selected isolate (M. anisopliae
JEF-003) in Ae. albopictus larvae, a transgenic M. anisopliae JEF-003
was generated by a fungal transformation using the pBARKS1-egfp.
Briefly, the egfp expression cassette was released from pBluscript II KS
(+)-egfp by ClaI and SacI digestion and then cloned into the ClaI/SacIdigested
pBARKS1 vector and confirmed by commercial sequencing
(MACRO GEN, Korea). The pBARKS1-egfp, has phosphinothricin (PPT)
resistant bar fungal selection marker and EGFP genes, both of them
are expressed under the control of gpdA promoter. The plasmid, linearized
by restriction enzyme digestion, was integrated into the genomic
DNA of M. anisopliae JEF-003 by the REMI method based on
blastospores (Ying and Feng, 2006; Kim et al., 2013). The M. anisopliae
JEF-003 EGFP-transformant was cultured on Czapek's agar supplement
with 600 μg ml−1 phosphinothricin. The M. anisopliae JEF-003 EGFPtransformant
was subjected to the infection test in the mosquito larvae
and observed under fluorescence microscopy.


Mosquitocidal assay
Virulence of 12 entomopathogenic fungal isolates against Ae.
albopictus larvae was investigated as follows. Conidial suspensions
were adjusted to 1 × 107 conidia ml−1 using 0.03% siloxane solution
in 90-mm-diameter Petri dishes at 10 ml dish−1. Fifteen third-instar larvae
were placed in the dish using a disposable dropper. Dishes were covered
with lids and kept at 25 ± 1 °C and 16:8 (L/D) photoperiod and
examined daily for 8 days. For dosage dependent assay, the conidial concentration
of the selected isolate (M. anisopliae JEF-003)was 10-fold diluted
from1 × 105 to 1× 107 conidia ml−1 andassayedwith samepetri-dish
conditions as described above. This experiment was replicated 3 times.



Virulence assay of M. anisopliae JEF-003 GR
To investigate the potential control efficacy of GR, mycotized GRs
were applied to the water in 90-mm-diam Petri dishes at 1 g dish−1
and 15 larvaewere transferred to each dish. Untreated control served as
a negative control. The number of dead mosquito larvae was observed
daily. This experiment was replicated 3 times.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการตัวอ่อนของยุงแอะ albopictus ตัวอ่อนที่ใช้ในการศึกษานี้ได้กรุณาให้ห้องปฏิบัติการสรีรวิทยาของแมลงของมหาวิทยาลัยแห่งชาติ Chonbuk เกาหลีตัวอ่อนของยุงที่ถูกเก็บไว้ที่ 28±1 ° C, 65±5% ของความชื้นสัมพัทธ์(RH) กับช่วงแสง 16:8 (L:D) และอาหาร ด้วยอาหารเทียมในห้องปฏิบัติการ (ชินและลี 2014)แยกและรหัสของเชื้อรา entomopathogenicเชื้อราที่แยกได้ถูกรวบรวมจากดินด้วย Entomopathogenicตัวอ่อน (หนอนนก) โมลิเตอร์ Tenebrio บนดินสำหรับสองสัปดาห์ และแยกเชื้อราเข้าปลูกจากพื้นผิวของ cadavers คอลเลกชันของดิน ตัวอย่างจะสรุปในตารางที่ 1 แยกเชื้อราได้ระบุลำดับเบสภูมิภาคเป็นตัวเว้นวรรคใช้ทับภายใน (ของ)และตรวจสอบลักษณะสัณฐาน ระบุใหม่และแยกบันทึกในเกาหลีถูกเก็บไว้ก่อนที่แทรกโมเลกุลและปฏิบัติ Biotechnological (IMBL) ของมหาวิทยาลัยแห่งชาติ Chonbukเป็นบริการ conidial ใน 20% กลีเซอรที่ −80 ° C (Humber, 1997) และแล้ว ฝากที่ชาติสถาบันของชีวภาพทรัพยากร (NIBRwww.nibr.go.kr) (อินชอน เกาหลี)สภาพวัฒนธรรมแข็งแยกเชื้อรามีอ่างใน Sabouraud แรงไตรมาสขึ้น agar (SDA 1/4) (pH 6) ในจาน Petri (60 มม. diam.) ในการมืดที่ 25 ± 1 ° C 10 วัน (Humber, 2005) Conidia ถูกเก็บรวบรวมโดย vortexing บล็อก agar (6 mm diam.) ใน Eppendorf หลอดประกอบด้วยโซลูชัน siloxane 0.03% (Silwet L 77, Momentive ประสิทธิภาพวัสดุ Inc.) หมายเลขของ conidia นับได้ ด้วย hemocytometerที่ขยายการ 400 (3 ครั้งต่อแยก) Conidia ด้วยN90% viabilitywere เก็บไว้ในตู้เย็นที่ 4 ° C 3 – 4 วันก่อนที่จะใช้โดยฟ่างวัฒนธรรมแข็งแยกเชื้อราถูกแข็งอ่างใช้วัฒนธรรมตามประเทศระบบ (ในบาร์ตเลตและ Jaronski, 1988 หลี่และเฟิง 2005 Kim et al.,2011) . การเตรียม inocula ของแข็งวัฒนธรรมปลูก ระงับ conidialจาก 3 sporulated agar บล็อก (diam. 6 mm) M. anisopliae JEF-003มีเพิ่มแรงไตรมาส Sabouraud ขึ้นซุปใน 250-mlหนาว น้ำถูกจัดขึ้นในเชคเกอร์โรตารี่แบบ (150 รอบต่อนาที) ที่ 25 ± 2 ° C สำหรับวันที่ 3 ฟ่าง (Panicummiliaceum) ธัญพืช (200 กรัม) ไว้ในเป็นโพลีไวนิลถุงนำไปแช่ใน 100 ml ของน้ำที่ประกอบด้วยกรดซิตริก (l−1 0.4 ml)และ autoclaved ที่ 120 ° C สำหรับ 15 นาที แล้วได้ระบายความร้อนด้วยถุงไปล้อมอุณหภูมิ วัฒนธรรมของเหลวซุป (3 ml) ถูกนำเข้าสู่กระเป๋า และผสมอย่างละเอียด กระเป๋าทั้งหมดถูกจัดขึ้น 6 วันที่ 25 ±1 ° C และมีช่วงแสง (L/D) 16:8 หลังจากบ่ม mycotized GRsแห้งที่อุณหภูมิสำหรับ 3 วัน จนชื้นถึง b5% (กำหนด โดยวิเคราะห์ความชื้น [บริษัทซาร์โทเรียสOmnimark]) มีประเมินทั้งหมดชุดของ mycotized GRs conidialความเข้มข้น (g−1) กับ hemocytometerการเปลี่ยนแปลงของเชื้อราสังเกตการติดเชื้อของการเลือกแยก (M. anisopliaeJEF-003) ใน Ae ตัวอ่อน albopictus, JEF 003 anisopliae M. เป็นถั่วเหลืองถูกสร้างขึ้น โดยเชื้อราการแปลงโดยใช้ pBARKS1-egfpสั้น ๆ ออกเทปนิพจน์ egfp จาก pBluscript II KS(+) -egfp โดยย่อยอาหาร ClaI และ SacI และโคลนแล้ว เป็น ClaI/SacIdigestedpBARKS1 เวกเตอร์ และยืนยันตามลำดับเชิงพาณิชย์(แมโคร GEN เกาหลี) PBARKS1-egfp มี phosphinothricin (PPT)ทนแถบเครื่องหมายเลือกเชื้อราและยีน EGFP ทั้งสองอย่างจะแสดงภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ gpdA Plasmid เป็นเส้นตรงโดยย่อยอาหารเอนไซม์จำกัด ถูกรวมอยู่ในการ genomicดีเอ็นเอของ M. anisopliae JEF-003 โดยวิธีเรมี่ตามblastospores (คุณหญิงและเฟิง 2006 คิม et al., 2013) Anisopliae เมตรJEF-003 EGFP transformant ถูกอ่างบนของ Czapek agar อาหารเสริมมี 600 μg ml−1 phosphinothricin M. anisopliae JEF-003 EGFPtransformantที่ต้องการทดสอบการติดเชื้อในตัวอ่อนของยุงและสังเกตใต้ fluorescence microscopyทดสอบ MosquitocidalVirulence ของ 12 entomopathogenic เชื้อราที่แยกได้กับ Aealbopictus ตัวอ่อนถูกตรวจสอบดังนี้ บริการ conidial1 × 107 conidia ml−1 ได้ปรับใช้โซลูชัน siloxane 0.03%ในจาน Petri 90-มม.เส้นผ่าศูนย์กลางที่ dish−1 10 ml ตัวอ่อน instar สามสิบห้าถูกวางในจานโดยใช้ตัวปล่อยทิ้ง อาหารครอบคลุมมีฝา และเก็บไว้ที่ 25 ± 1 ° C และช่วงแสง 16:8 (L/D) และตรวจสอบทุกวัน 8 วัน สำหรับการทดสอบขึ้นอยู่กับขนาด ความเข้มข้น conidialที่เลือกแยก (M. anisopliae JEF-003) ถูก 10-fold ผสมfrom1 × 105 ไป 1 × 107 conidia ml−1 andassayedwith samepetri-จานเงื่อนไขตามที่อธิบายไว้ข้างต้น การทดลองนี้ถูกจำลองแบบแล้ว 3 ครั้งทดสอบ virulence ของ M. anisopliae JEF-003 GRการตรวจสอบประสิทธิภาพควบคุมศักยภาพของ GR, mycotized GRsใช้น้ำในจาน Petri diam 90 มม.ที่ 1 g dish−1และโอนย้ายไปแต่ละจาน larvaewere 15 เป็นการควบคุมไม่ถูกรักษาลบตัวควบคุม จำนวนตัวอ่อนยุงตายถูกสังเกตทุกวัน การทดลองนี้ถูกจำลองแบบแล้ว 3 ครั้ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการ
ยุงตัวอ่อน
แอะ ตัวอ่อน albopictus ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ได้ให้ความกรุณาโดย
. ห้องปฏิบัติการสรีรวิทยาแมลง Chonbuk มหาวิทยาลัยแห่งชาติเกาหลี
ลูกน้ำยุงถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 28 ± 1 ° C, 65 ± 5% ของความชื้นสัมพัทธ์
(RH) กับช่วงแสง 16: 8 (L: D) และอาหารที่มีอาหารเทียมใน
ห้องปฏิบัติการ (ชินและลี, 2014). การแยกและจำแนกของเชื้อราแมลงสายพันธุ์เชื้อราแมลงที่ถูกเก็บรวบรวมจากดินโดยการวางTenebrio molitor (mealworm) ตัวอ่อนบนพื้นดินเป็นเวลาสองสัปดาห์และแยก เชื้อราออกเติบโตขึ้นจากพื้นผิวของศพ คอลเลกชันของตัวอย่างดินได้สรุปไว้ในตารางที่ 1 สายพันธุ์เชื้อราถูกระบุลำดับ spacer คัดลอกภายใน (ITS) ภูมิภาคและการตรวจสอบลักษณะทางสัณฐานวิทยา ระบุใหม่สายพันธุ์และมีการบันทึกในเกาหลีถูกเก็บไว้ในตอนแรกที่ภาพประกอบโมเลกุลและเทคโนโลยีชีวภาพทางห้องปฏิบัติการ (IMBL) ของ Chonbuk มหาวิทยาลัยแห่งชาติเป็นสารแขวนลอยเชื้อราในกลีเซอรอล 20% ที่ -80 ° C (ซังกะตาย 1997) และแล้วฝากที่สถาบันแห่งชาติของทางชีวภาพ ทรัพยากร (NIBR; www.nibr.go.kr). (อินชอนประเทศเกาหลี) สภาพวัฒนธรรมแข็งเชื้อราเชื้อเพาะเลี้ยงที่กำลังมาแรงในช่วงไตรมาส Sabouraud dextrose agar (1/4 SDA) (pH 6) ในจานเลี้ยงเชื้อ (60 มม เส้นผ่าศูนย์กลาง.) ในที่มืดที่อุณหภูมิ 25 ± 1 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 วัน (ซังกะตาย 2005) สปอร์ที่ถูกเก็บรวบรวมโดย vortexing บล็อกวุ้น (6 มิลลิเมตรเส้นผ่าศูนย์กลาง.) ใน Eppendorf หลอดที่มี0.03% วิธีการแก้ปัญหาไซโลเซน (Silwet L-77, Momentive Performance Materials Inc. ) ตัวเลขของสปอร์นับกับ hemocytometer ที่ 400 ×ขยาย (3 ครั้งต่อแยก) สปอร์ที่มีN90% viabilitywere เก็บไว้ในตู้เย็นที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3-4 วันก่อนการใช้งาน. วัฒนธรรมของแข็งข้าวฟ่างตามสายพันธุ์ของเชื้อรามีลักษณะเป็นของแข็งเพาะเลี้ยงโดยใช้วัฒนธรรมข้าวฟ่างตามระบบ (บาร์ตเลตต์และ Jaronski 1988; Li และฮ . 2005; คิมและคณะ, 2011) เพื่อเตรียมความพร้อมสำหรับ inocula วัฒนธรรมของแข็งระงับเชื้อราจาก 3 sporulated วุ้นบล็อก (6 มม diam.) ของ M. anisopliae JEF-003 ถูกบันทึกอยู่ในความแข็งแรงไตรมาสน้ำซุปเดกซ์โทรส Sabouraud ใน 250 มล. ขวด Flasks ถูกจัดขึ้นในเครื่องปั่นหมุน (150 รอบต่อนาที) ที่อุณหภูมิ 25 ± 2 องศาเซลเซียสเป็นเวลา3 วัน ข้าวฟ่าง (Panicummiliaceum) ธัญพืช (200 กรัม) ถูกวางไว้ในโพลีไวนิลถุงแช่ใน 100 ml ของน้ำที่มีกรดซิตริก (0.4 มล L-1) และนึ่งฆ่าเชื้อที่ 120 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 นาที ถุงถูกระบายความร้อนนั้นไปโดยรอบอุณหภูมิ น้ำซุปวัฒนธรรมของเหลว (3 มล.) ถูกนำเข้าสู่ถุงและผสม ถุงทั้งหมดถูกจัดขึ้นเป็นเวลา 6 วันที่ 25 ± 1 องศาเซลเซียสและ 16: 8 (L / D) ช่วงแสง หลังจากบ่ม GRS mycotized แห้งที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 3 วันจนกระทั่งความชื้นถึง B5% (กำหนดโดยการวิเคราะห์ความชื้น [Sartorius Omnimark]) สำหรับกระบวนการทั้งหมดของ GRS mycotized ได้รับการประเมินสำหรับเชื้อราเข้มข้น (G-1) ที่มี hemocytometer. การเปลี่ยนแปลงเชื้อราในการสังเกตการติดเชื้อของเชื้อราที่เลือก (M. anisopliae JEF-003) ในแอะ ตัวอ่อน albopictus, transgenic M. anisopliae JEF-003 ถูกสร้างขึ้นโดยการเปลี่ยนแปลง fungal ใช้ pBARKS1-egfp. สั้น ๆ เทป expression egfp ได้รับการปล่อยตัวจาก pBluscript II KS (+) - egfp โดย ClaI และการย่อยอาหาร SacI และโคลนจากนั้นเข้าไป ClaI / SacIdigested pBARKS1 เวกเตอร์และได้รับการยืนยันโดยลำดับในเชิงพาณิชย์(MACRO GEN เกาหลี) pBARKS1-egfp มี phosphinothricin (PPT) บาร์ทนเครื่องหมายเลือกเชื้อราและยีน EGFP ทั้งสองจะแสดงภายใต้การควบคุมของผู้ก่อการ GPDA พลาสมิดเชิงเส้นโดยการย่อยอาหารเอนไซม์ จำกัด ได้รับการรวมอยู่ในจีโนมดีเอ็นเอของ M. anisopliae JEF-003 โดยวิธี REMI ขึ้นอยู่กับblastospores (หญิงและฮ 2006;. คิมและคณะ, 2013) M. anisopliae JEF-003-EGFP transformant เป็นเพาะเลี้ยงบนอาหารเสริมวุ้น Czapek ของ600 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร-1 phosphinothricin M. anisopliae JEF-003 EGFPtransformant ถูกยัดเยียดให้ทดสอบการติดเชื้อในตัวอ่อนของยุงและสังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง. Mosquitocidal ทดสอบความรุนแรงของเชื้อราแมลง 12 แยกกับ Ae. albopictus ตัวอ่อนได้รับการตรวจสอบดังต่อไปนี้ สารแขวนลอยเชื้อรามีการปรับถึง 1 × 107 สปอร์มล-1 โดยใช้วิธีการแก้ปัญหา 0.03% ลอกใน 90 มิลลิเมตรเส้นผ่าศูนย์กลางจานเลี้ยงเชื้อที่ 10 ml จาน-1 สิบห้าตัวอ่อนวัยที่สามถูกวางไว้ในจานโดยใช้หลอดหยดทิ้ง อาหารถูกปกคลุมที่มีฝาปิดและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 25 ± 1 ° C และ 16: 8 (L / D) ช่วงแสงและการตรวจสอบทุกวันเป็นเวลา 8 วัน สำหรับปริมาณการทดสอบขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของเชื้อราสายพันธุ์ที่เลือก (M. anisopliae JEF-003) เป็น 10 เท่าปรับลดตั้งแต่วันที่ 1 × 105-1 × 107 สปอร์มล-1 andassayedwith samepetri จานเงื่อนไขตามที่อธิบายไว้ข้างต้น การทดลองนี้ถูกจำลองแบบ 3 ครั้ง. ทดสอบความรุนแรงของ M. anisopliae JEF GR-003 ในการตรวจสอบประสิทธิภาพการควบคุมที่มีศักยภาพของอู๊ mycotized GRS ถูกนำไปใช้กับน้ำในอาหาร 90 มิลลิเมตรเส้นผ่าศูนย์กลาง Petri ที่ 1 กรัมจาน-1 และ 15 larvaewere โอนไปยังแต่ละจาน ได้รับการรักษาควบคุมทำหน้าที่เป็นผู้ควบคุมเชิงลบ จำนวนลูกน้ำยุงตายถูกพบในชีวิตประจำวัน การทดลองนี้ถูกจำลองแบบ 3 ครั้ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการ ลูกน้ำ

เอ จากตัวอ่อนที่ใช้ในการศึกษาได้แก่ กรุณาให้
แมลงสรีรวิทยาห้องปฏิบัติการของมหาวิทยาลัยแห่งชาติ ชนบุค เกาหลี
ลูกน้ำไว้ที่ 28 ± 1 ° C 65 ± 5 % ความชื้นสัมพัทธ์ ( RH )
ที่มีต่อ 16 : 8 ( L : D ) และเลี้ยงด้วยอาหารเทียมใน
ห้องปฏิบัติการ ( ชิน และ ลี ปี 2014

)การแยกและการแยกเชื้อรา แมลงที่ตายของแมลงที่ตายเชื้อรา
เก็บจากดิน โดยวาง
tenebrio โมลิเตอร์ ( หนอนนก ) หนอนในดินสำหรับสองสัปดาห์และ
แยกปลูกเชื้อราจากพื้นผิวของท่าน คอลเลกชันของตัวอย่างดิน
สรุปในตารางที่ 1 ส่วนเชื้อราไอโซเลท
ระบุลำดับการถ่ายทอด spacer ( ITS ) และศึกษาลักษณะทางภูมิภาค
. ระบุและบันทึกสายพันธุ์ใหม่

แรกในเกาหลีที่สอดแทรกเทคโนโลยีชีวภาพโมเลกุลและเก็บไว้ในห้องปฏิบัติการ ( imbl ) ของมหาวิทยาลัยแห่งชาติชนบุค
เป็น 20% จากสารแขวนลอยในกลีเซอรอลที่− 80 ° C ( Humber , 1997 ) และ
งั้นฝากไว้ที่สถาบันทรัพยากรชีวภาพ ( nibr ;
www.nibr ไป เคอาร์ ) ( อินชอน เกาหลี )


วัฒนธรรมสภาพแข็งแยกเชื้อรา เพาะเลี้ยงในไตรมาสแรง sabouraud
dextrose agar ( 1 / 4 ( SDA ) pH 6 ) ในจานเลี้ยงเชื้อ ( 60 มม. เดียม ) ใน
มืดที่ 25 ± 1 ° C เป็นเวลา 10 วัน ( Humber , 2005 ) ผลการศึกษาครั้งนี้ vortexing
โดยใช้บล็อก ( 6 มม. เดียม .) ในหลอดบรรจุสารละลายเพนดอร์ฟ
ทั่วโลก 0.03 % ( silwet l-77 โคน , การแสดง
วัสดุอิงค์ ) ตัวเลขนี้ถูกนับด้วย hemocytometer
ที่ 400 ×ขยาย ( 3 ครั้งต่อแยก ) โคนิด้วย
viabilitywere 90 % เก็บในตู้เย็นที่อุณหภูมิ 4 องศา C เป็นเวลา 3 - 4 วัน ก่อนใช้ ข้าวฟ่าง



ตามวัฒนธรรมแข็งการเพาะเลี้ยงเชื้อราไอโซเลทที่เป็นของแข็งโดยใช้ระบบวัฒนธรรม
จากข้าวฟ่าง ( Bartlett และ jaronski , 1988 ; ลี และ ฟง , 2005 ; Kim et al . ,
2011 ) เตรียม inocula สำหรับวัฒนธรรมทึบ จากช่วงล่าง
3 บล็อกวุ้นสร้างสปอร์มาก ( 6-mm เดียม ) M . anisopliae jef-003
เพิ่ม 2 แรง sabouraud Dextrose Broth ในขวด 250 มล.

ขวดที่ถูกจัดขึ้นในเครื่องปั่น Rotary ( 150 รอบต่อนาที ) ที่ 25 ± 2 ° C
3 วัน ข้าวฟ่าง ( panicummiliaceum ) ธัญพืช ( 200 กรัม ) ใส่ในถุงโพลีไวนิล
แช่น้ำ 100 มิลลิลิตรของน้ำที่มีกรดซิตริก ( 0.4 มล. L − 1 ) และ 120 ° C
สังเคราะห์เป็นเวลา 15 นาที กระเป๋าก็เย็นอุณหภูมิ

วัฒนธรรมน้ำซุป ( 3 ml ) ใช้เป็น
กระเป๋าและผสมอย่างทั่วถึงกระเป๋าทั้งหมดถูกจัดขึ้นเป็นเวลา 6 วัน ที่ 25 ±
1 ° C และ 16 : 8 ( L / D ) ต่อ . หลังจากระยะเวลา mycotized GRS
แห้งที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 3 วัน จนกระทั่งความชื้นถึง B5
% ( กำหนดโดยความชื้นเครื่องวัด Sartorius
[ omnimark ] ) ทุกชุดของ mycotized GRS มีการประเมินสำหรับความเข้มข้นเดีย
( G − 1 ) กับ hemocytometer .



3 แปลงสังเกตการติดเชื้อของเลือกแยก ( M . anisopliae
jef-003 ) เอ ตัวอ่อนที่มียีนโรค , ม. jef-003
ถูกสร้างขึ้น โดยการใช้เชื้อรา pbarks1 egfp .
สั้น ๆ , egfp การแสดงออกเทปที่ถูกปล่อยออกมาจาก pbluscript II KS
( ) - egfp โดย clai ซาซิและการย่อยอาหารและโคลนเข้าไปใน clai / sacidigested
pbarks1 เวกเตอร์และยืนยันโดยการจัดลำดับการค้า
( โคเก็น เกาหลี ) การ pbarks1 egfp ได้ phosphinothricin ( ppt ) ป้องกันเชื้อราและเลือกแถบเครื่องหมาย

egfp ยีน , ทั้งสองของพวกเขาจะแสดง ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ gpda . การตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ ในช่วง
, การย่อยอาหาร , ถูกรวมอยู่ในดีเอ็นเอของ M . anisopliae
jef-003 โดยวิธีตาม
เรมิblastospores ( Ying และฟง , 2006 ; Kim et al . , 2013 ) . . . anisopliae
jef-003 egfp / เลี้ยงบนอาหาร Czapek เป็นวุ้นเสริม
μกรัม 600 มล. − 1 phosphinothricin . . . . anisopliae jef-003 egfptransformant
ภายใต้การติดเชื้อทดสอบในลูกน้ำยุง และตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง




mosquitocidal การทดสอบโรคของแมลงที่ตาย 12 แยกเชื้อรา กับ เอ ที่มีตัวอ่อน
ศึกษาดังนี้ จากสารแขวนลอย
คือปรับ 1 × 107 โคนิ ml − 1 ใช้ 0.03 % ทั่วโลก โซลูชั่น
ใน 90 มม. เส้นผ่าศูนย์กลางจานเลี้ยงเชื้อที่ 10 ml จาน− 1 สิบห้าสามหนอน
ถูกวางไว้ในจาน ใช้หยดทิ้ง อาหารที่ถูกปกคลุม
มีฝาปิดและเก็บไว้ที่ 25 ± 1 ° C และ 16 :8 ( L / D ) และการไม่ตรวจสอบทุกวัน
8 วัน สำหรับปริมาณขึ้นอยู่กับ assay , จากสมาธิ
ของเลือกแยก ( M . anisopliae jef-003 ) คือ 10 เท่าเจือจาง
from1 × 105 1 × 107 โคนิ ml − 1 andassayedwith samepetri จาน
เงื่อนไขตามที่อธิบายไว้ข้างต้น การทดลองนี้ได้ทำการทดลอง 3 ครั้ง



( M . anisopliae โรค jef-003 GR
เพื่อศึกษาศักยภาพในการควบคุมประสิทธิภาพของ GR , mycotized GRS
เพื่อใช้น้ำในจานเลี้ยงเชื้อที่ 90 มม. เดียม 1 กรัมจาน− 1
15 larvaewere มาแต่ละจาน ควบคุมและทำหน้าที่เป็น
ควบคุมลบ จำนวนลูกน้ำยุงตายพบ
ทุกวัน การทดลองนี้ได้ทำการทดลอง 3 ครั้ง