3. ConclusionsWe isolated seven nov

3. Conclusions
We isolated seven novel terpenoids belonging to three different structural families from a single cultivation of the xylariaceous fungus H. rickii. Compounds 1–3 are new members of the botryane family, whereas 4–6 had been isolated previously. Hypoxyalins A– C (7–9) are 14-noreudesmanes that could be biosynthetically related to the eremophilanes. The diterpenoid rickitin (10) is the first fungal metabolite with an abietane backbone. These results point towards a hitherto unsuspected diversity of terpenoids in the Xylariaceae – a fungal family that has so far mainly been known for its diversity of polyketides and nitrogen-containing sec- ondary metabolites.
4. Experimental section
4.1. General
Optical rotations were determined with a Perkin-Elmer 241 spectrometer and UV spectra were recorded with a Shimadzu UV–Vis spectrophotometer UV-2450. NMR spectra were recorded with Bruker Avance III 700 spectrometer with a 5 mm TCI cry- oprobe (1H 700 MHz, 13C 175 MHz), Bruker DMX-600 (1H 600MHz, 13C 150MHz) and Avance III 500 (1H 500MHz, 13C 125MHz) spectrometers. HRESI-MS spectra were obtained as described by Halecker et al. (2014). Isolation of pure compounds was achieved if not indicated otherwise with a preparative HPLC (Gilson, Middleton, USA) equipped with a GX-271 Liquid Handler, a 172 DAD, a 305 and 306 pump (with 50SC Piston Pump Head). As stationary phase a VP Nucleodur C18 ec column (125 40 mm, 7 lm; Macherey–Nagel) was used. The mobile phase was composed of deionised water (Milli-Q, Millipore, Schwalbach, Germany) with 0.1% acetic acid (solvent A; Roth) and acetonitrile (ACN) with 0.1% acetic acid (solvent B). Flow rate was set to 15 ml/min.
4.2. Fungal material
Stromata (fruiting bodies) of H. rickii MJF10324 were collected in 2010 from the Caribbean island Martinique by J. Fournier. The strain was designated as epitype of the species (Kuhnert et al., 2014b). The culture was derived by multispore isolation on YMG medium (1.0% malt extract, 0.4% glucose, 0.4% yeast extract, pH 6.3) using the method outlined by Stadler et al. (2014) and has been deposited in public culture collections (MUCL 53309, CBS 129345).
4.3. Cultivation, extraction and isolation
4.3.1. Cultivation
To determine the optimal condition for secondary metabolite production H. rickii was transferred to four different liquid media (YMG medium; Q6/2 medium: 1.0% glycerol, 0.25% glucose, 0.5% cotton seed flour, pH 7.2; ZM/2 medium: 0.5% molasses, 0.5% oat- meal, 0.15% glucose, 0.4% sucrose, 0.4% mannitol, 0.05% edamine, 0.05% ammonium sulphate, 0.15% calcium carbonate, pH 7.2; HLX medium: 3.0% sucrose, 1.0% casamino acids, 0.1% K2HPO4, 0.1% yeast extract, 0.05% MgSO4 7H2O, 0.05% KCl, 0.001% FeSO4 7H2O) in Erlenmeyer flasks (500 ml) filled each with 200 ml media. These media were chosen because previous studies (Bitzer et al., 2008; Stadler et al., 2003; including details on the suppliers of the ingredients) had revealed that, taken together, they are optimal for attaining complementary secondary metabo- lite profiles in filamentous ascomycetes. The submerged cultures were incubated at 23°C in the dark on a rotary shaker at
140 rpm. Fermentation was aborted after free glucose was con- sumed and the pH value had passed through a minimum.
4.3.2. Extraction and large scale fermentation
An aliquot (20 ml) of the culture broth was mixed with 20 ml ethyl acetate and extracted in an ultrasonic bath for 30 min. The organic phase was filtered over anhydrous sodium sulphate and evaporated. The remaining crude extract was dissolved in metha- nol and analysed with an analytical HPLC equipped with a diode array detector (DAD) as described by Stadler et al. (2001). Quantity and quality of secondary metabolites was the highest in HLX and ZM/2 media. For up-scaling purposes, HLX medium was chosen. A seed culture of the strain with a total volume of 1 l was prepared in YMG medium and incubated for 7days. A Biostat UE 100 bioreactor (B. Braun Melsungen AG, Germany) filled with 70 l HLX medium was inoculated with the seed culture under sterile conditions. To prevent foam formation in total 20 g of Tegosipon (Evonik, Essen, Germany) was added in portions of 2– 10 g as necessary, using an automatic supply system. The pH value was maintained between 6.0 and 6.3 using potassium hydroxide (2 N) and sulphuric acid (1 M), respectively. The temperature was set at 26 °C. The oxygen saturation was kept above a minimum of 20%, controlled by increasing the stirrer speed of the Rushton turbine by the built-in process control system. The initial stirrer speed was set to 50rpm and reached a maximum speed of 400 rpm, aeration rate was set to 5 Sl/min and remained constant during fermentation. The culture was harvested after 7 days as sugars (sucrose, fructose) were depleted. Thereafter, the mycelium was separated from the culture fluid by vacuum filtration to yield a total amount of 3 kg wet biomass, which was later extracted with 9 l acetone in an ultrasonic bath for 1 h. The acetone extract was filtered and evaporated to yield an aqueous phase (3.5 l), which was further processed by extraction with 3 1 l of ethyl acetate in a separating funnel. Subsequently the organic phases were com- bined, dried over anhydrous sodium sulphate and evaporated to yield 12 g of oily mycelial crude extract (ME) in total.
4.3.3. Isolation of the terpenoids
The ME containing all terpenoids was separated in three parts and each (4 g) dissolved in 12 ml methanol. Each part was later fil- tered through a RP solid phase cartridge (Strata-X 33mm, Polymeric Reversed Phase; Phenomenex Aschaffenburg, Germany) and subjected to preparative RP MPLC [column 480 30 mm, ODS/AQ C18 (Kronlab) using the following condi- tions: mobile phase with solvent A [90% deionised water (Milli- Q), 10% methanol] and solvent B (methanol), linear gradient of sol- vent B from 10% to 100% in 60 min, followed by isocratic conditions at 100% solvent B for 20 min, flow rate of 30 ml/min, UV peak detection at 210 nm. A total number of 160 fractions per run were obtained, which were combined according to the main peaks to yield 15 main fractions. Each main fraction was evaporated and the crude extract analysed by HPLC-DAD. One of the main fractions derived from the first run [retention time (RT): 56.0–57.0 min; 15 mg) contained pure compound 4. Another fraction obtained in the first run (58.0–59.0 min, 16 mg) was further fractionized by RP HPLC (linear gradient from 25% to 100% solvent B in 40 min) to obtain compounds 1 (0.75 mg) and 9 (0.73 mg). A further frac- tion derived from the first run (RT: 48.5–49.0 min; 34 mg) was again separated by preparative RP HPLC (linear gradient from 30% to 60% solvent B in 30 min) to obtain compound 6 (7 mg) and [10] (3 mg). Compound [3] (4 mg) was purified from a main fraction of the second run (RT: 57.0–58.5 min; 59 mg) by prepara- tive HPLC [linear gradient from 40 to 100% in 25min using 95% ACN + 5% deionised water supplemented with 0.015% formic acid (Roth) as solvent B]. Another fraction of the same run (RT: 43.0–45.5 min; 119 mg) was fractionized (linear gradient

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3. บทสรุปเราแยกต่างหากเจ็ด terpenoids นวนิยายของ 3 ครอบครัวโครงสร้างแตกต่างจากการเพาะปลูกเดียวของ xylariaceous เชื้อรา H. rickii สาร 1-3 เป็นสมาชิกใหม่ของครอบครัว botryane ในขณะที่ 4 – 6 ได้แยกไว้ก่อนหน้านี้ Hypoxyalins A – C (7-9) คือ 14-noreudesmanes ที่สามารถ biosynthetically กับ eremophilanes Rickitin diterpenoid (10) เป็น metabolite เชื้อราแรกกับแกนหลักการ abietane ชี้ผลลัพธ์เหล่านี้ต่อมาจนบัด unsuspected หลากหลาย terpenoids ใน Xylariaceae – ครอบครัวเชื้อราที่มากส่วนใหญ่เป็นที่รู้จักในความหลากหลายของ polyketides และประกอบด้วยไนโตรเจน metabolites ondary วินาที4 การส่วนที่ทดลอง4.1. ทั่วไปหมุนเวียนแสงถูกกำหนด ด้วยสเปกโตรมิเตอร์เอลเมอเพอร์ 241 และ UV แรมสเป็คตราถูกบันทึกไว้ ด้วยกับ Shimadzu UV – Vis เครื่องทดสอบกรดด่าง UV-2450 ได้รับการบันทึกแรมสเป็คตรา NMR กับสเปกโตรมิเตอร์ Bruker Avance III 700 เป็น 5 มม. TCI ร้องไห้-oprobe (1H 700 MHz, 13C 175 MHz), Bruker DMX-600 (1 H 600 MHz, 13 C 150 MHz) และตรวจ Avance III 500 (1 H 500 MHz, 13 C 125 MHz) นางสาว HRESI แรมสเป็คตราได้รับตามที่อธิบายไว้โดย Halecker et al. (2014) แยกสารบริสุทธิ์ได้สำเร็จถ้า ไม่ระบุมิฉะนั้น ด้วยการ preparative HPLC (Gilson มิดเดิลตัน สหรัฐอเมริกา) พร้อมจัดการกับของเหลว GX-271 พ่อ 172, 305 และ 306 ปั๊ม (มีหัวปั๊มลูกสูบ 50SC) เป็นเครื่องเขียนระยะ ec คอลัมน์ VP Nucleodur C18 (125 มม. 40, 7 lm Macherey–Nagel) ใช้ เฟสเคลื่อนประกอบด้วยน้ำ deionised (Q มาก Schwalbach เยอรมนี) ด้วย 0.1% กรดน้ำส้ม (ตัวทำละลาย A รอด) acetonitrile (ACN) ด้วย 0.1% กรดน้ำส้ม (ตัวทำละลาย B) และการ อัตราการไหลถูกตั้งค่าให้ 15 ml/min4.2. วัสดุเชื้อราStromata (fruiting ศพ) ของ H. rickii MJF10324 ถูกเก็บรวบรวมในปี 2553 จากแคริบเบียนเกาะมาร์ตินีก โดย Fournier เจ สายพันธุ์ถูกกำหนดเป็น epitype พันธุ์ (Kuhnert et al., 2014b) วัฒนธรรมรับมา โดยแยก multispore YMG กลาง (1.0% มอลต์สกัด กลูโคส 0.4% สารสกัดจากยีสต์ 0.4%, pH 6.3) ใช้วิธีการอธิบายโดย Stadler et al. (2014) และได้รับฝากไว้ในชุดวัฒนธรรมสาธารณะ (MUCL 53309, CBS 129345)4.3 การปลูก การสกัด และการแยก4.3.1 การเพาะปลูกเพื่อกำหนดเงื่อนไขเหมาะสมที่สุดสำหรับ metabolite รอง ผลิต H. rickii ถูกถ่ายโอนไปเหลวสื่อสี่แตกต่างกัน (YMG กลาง กลาง Q6/2:1.0% กลีเซอร กลูโคส 0.25%, 0.5% ฝ้ายเมล็ดแป้ง pH 7.2 สื่อ ZM/2: กากน้ำตาล 0.5%, 0.5% ข้าวโอ๊ตอาหาร 0.15% กลูโคส 0.4% ซูโครส 0.4% mannitol, edamine 0.05%, 0.05% แอมโมเนียมซัลเฟต 0.15% แคลเซียมคาร์บอเนต pH 7.2 สื่อ HLX: 3.0% ซูโครส กรด casamino 1.0%, 0.1% K2HPO4 สารสกัดจากยีสต์ 0.1%, 0.05% MgSO4 7H2O, 0.05% KCl, 0.001% FeSO4 7H2O) ใน Erlenmeyer น้ำ (500 มล.) เต็มไปด้วยสื่อ 200 ml สื่อเหล่านี้ถูกเลือกเนื่องจากการศึกษาก่อนหน้า (Bitzer et al., 2008 Stadler et al., 2003 รวมทั้งรายละเอียดเกี่ยวกับซัพพลายเออร์ของส่วนผสม) ได้เปิดเผยว่า ปวง จะเหมาะสมที่สุดสำหรับเสริมรอง metabo - lite โพรไฟล์ใน filamentous ascomycetes การบรรลุ วัฒนธรรมน้ำท่วมถูก incubated ที่ 23° C ในมืดในเชคเกอร์โรตารี่ที่140 รอบต่อนาที หมักได้ถูกยกเลิกหลังจากกลูโคสฟรีมีแอร์ sumed และค่า pH ก็ผ่านอย่างน้อย4.3.2 การสกัดและหมักขนาดใหญ่เป็นส่วนลงตัว (20 มล.) ของซุปวัฒนธรรมถูกผสมกับ 20 ml เอทิล acetate และสกัดในการอาบน้ำ 30 นาทีอัลตราโซนิก ระยะอินทรีย์กรองผ่านไดโซเดียมซัลเฟต และหายไป สารสกัดจากน้ำมันที่เหลือละลายในเมธา nol และ analysed ด้วย HPLC การวิเคราะห์พร้อมกับไดโอดอาร์เรย์จับ (พ่อ) ตามที่อธิบายไว้โดย Stadler et al. (2001) ปริมาณและคุณภาพของ metabolites รองถูกสูงสุดสื่อ HLX และ ZM/2 สำหรับปรับตั้งวัตถุประสงค์ มีการเลือกปานกลาง HLX วัฒนธรรมเมล็ดของสายพันธุ์ของ 1 l ที่เตรียมไว้ใน YMG และ incubated ใน 7 เดย์ เป็น Biostat UE 100 bioreactor (B. Braun Melsungen AG เยอรมนี) เต็มไป ด้วยสื่อ HLX 70 l ถูก inoculated กับวัฒนธรรมเมล็ดภายใต้สภาพที่ผ่านการฆ่าเชื้อ เพื่อป้องกันไม่ให้โฟม ก่อตัวใน 20 กรัมรวมของ Tegosipon (Evonik เอสเซน เยอรมนี) ถูกเพิ่มในส่วนของ g 2 – 10 ตามความจำเป็น ใช้ประปาอัตโนมัติ มีรักษาค่า pH ระหว่าง 6.0 และ 6.3 ใช้โพแทสเซียมไฮดรอกไซด์ (2 N) และกรดซัลฟุริก (1 เมตร), ตามลำดับ ตั้งอุณหภูมิที่ 26 องศาเซลเซียส ความอิ่มตัวออกซิเจนเก็บไว้ข้างบนอย่างน้อย 20% ควบคุม โดยการเพิ่มความเร็วช้อนคนของกังหัน Rushton ระบบควบคุมกระบวนการภายใน ความเร็วเริ่มต้นช้อนคนตั้ง 50 รอบต่อนาที และความเร็ว 400 รอบต่อนาทีสูงสุดถึง aeration อัตราตั้ง Sl 5 นาที และยังคงคงในระหว่างการหมัก วัฒนธรรมถูกเก็บเกี่ยวหลังจาก 7 วันเป็นน้ำตาล (ซูโครส ฟรักโทส) ได้สิ้นสุดลง หลังจากนั้น mycelium ถูกแยกจากน้ำวัฒนธรรม ด้วยเครื่องกรองสูญญากาศให้จำนวน 3 กก.น้ำชีวมวล ซึ่งภายหลังถูกสกัด ด้วยอะซิโตน 9 l ในการอัลตราโซนิกสำหรับ 1 h กรอง และหายไปให้มีอควีระยะ (3.5 ลิตร), ซึ่งมีการประมวลผลเพิ่มเติม โดยแยก 3 สารสกัดจากอะซีโตนเอทิล acetate ในกรวยแยก l 1 ต่อระยะอินทรีย์ได้ com-bined แห้งมากกว่าไดโซเดียมซัลเฟต และให้ผลผลิตของมัน mycelial ดิบสารสกัด (ME) รวม 12 กรัมที่หายไป4.3.3 การแยกของ terpenoidsME ประกอบด้วย terpenoids ทั้งหมดถูกแบ่งใน 3 ส่วน และแต่ละ (4 กรัม) ละลายในเมทานอล 12 ml แต่ละส่วนมีไฟล์ tered หลังจากผ่านตลับหมึกแข็งระยะ RP (ชั้น-X 33 มม. ระยะในการกลับรายการชนิด Phenomenex Aschaffenburg เยอรมนี) และการ preparative RP MPLC [คอลัมน์ 480 30 มม. C18 ODS/AQ (Kronlab) ใช้ tions เบาะ ๆ ว่าพวกเขาที่ต่อไปนี้: ระยะเคลื่อนที่ ด้วยตัวทำละลาย [90% deionised น้ำ (- Q), เมทานอล 10%] และตัวทำละลาย B (เมทานอล), การไล่ระดับสีเชิงเส้นของ B ระบายโซลจาก 10% เป็น 100% ใน 60 นาที ตาม ด้วยเงื่อนไข isocratic คิดที่ 100% ตัวทำละลาย B 20 นาที อัตราการไหลของ 30 ml/min, UV ตรวจพบสูงสุดที่ 210 nm จำนวนเศษส่วน 160 ต่อรันได้รับ ซึ่งถูกรวมกันตามหลักแห่งเศษ 15 หลักให้ เศษส่วนแต่ละหลักหายไป และสารสกัดน้ำมัน analysed โดย HPLC-พ่อ หนึ่งของส่วนหลักมาจากการรันครั้งแรก [รักษาเวลา (RT): 56.0 – 57.0 นาที 15 mg) ประกอบด้วย 4 บริสุทธิ์ผสม เพิ่มเติมส่วนอื่นที่ได้รับในการรันครั้งแรก (58.0-59.0 นาที 16 มิลลิกรัม) ถูก fractionized โดย HPLC RP (เส้นไล่ระดับจาก 25% ถึง 100% ตัวทำละลาย B ใน 40 นาที) การรับสาร 1 (0.75 มิลลิกรัม) และ 9 (0.73 มิลลิกรัม) Frac-สเตรชันเพิ่มเติมมาจากการรันครั้งแรก (RT: 48.5 – 49.0 นาที 34 มิลลิกรัม) ถูกคั่นอีก ด้วย RP preparative HPLC (เส้นไล่ระดับจาก 30% ถึง 60% ตัวทำละลาย B ใน 30 นาที) รับผสม 6 (7 มิลลิกรัม) และ [10] (3 มิลลิกรัม) ผสม [3] (4 มิลลิกรัม) คือบริสุทธิ์จากส่วนหลักของการรันที่สอง (RT: 57.0 – 58.5 นาที 59 มิลลิกรัม) โดย HPLC prepara tive [เส้นไล่ระดับจาก 40 ถึง 100% ในนาทีที่ 25 ใช้ 95% ACN + น้ำ 5% deionised เสริม ด้วย 0.015% กรด (รอด) เป็นตัวทำละลาย B] เศษส่วนอื่นของการรันเดียว (RT: 43.0-45.5 นาที 119 มิลลิกรัม) ได้ fractionized (เส้นไล่ระดับสี

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3.
สรุปผลการวิจัยเราแยกเจ็ดterpenoids นวนิยายที่เป็นสามครอบครัวที่มีโครงสร้างแตกต่างจากการเพาะปลูกเดียวของเชื้อรา xylariaceous เอช rickii สารประกอบ 1-3 เป็นสมาชิกใหม่ของครอบครัว botryane ในขณะที่ 4-6 ได้รับการแยกออกมาก่อนหน้านี้ Hypoxyalins A- C (7-9) 14-noreudesmanes ที่อาจจะเกี่ยวข้องกับการ biosynthetically eremophilanes rickitin diterpenoid (10) เป็นสารแรกของเชื้อราที่มีกระดูกสันหลัง abietane ผลการศึกษานี้ชี้ไปทางความหลากหลายไม่น่าสงสัยจนบัดนี้ของ terpenoids ใน Xylariaceae -. ครอบครัวของเชื้อราที่ได้รับเพื่อให้ห่างไกลส่วนใหญ่เป็นที่รู้จักสำหรับความหลากหลายของ polyketides และไนโตรเจนที่มีสาร ondary ชั่ว
4 ส่วนการทดลอง
4.1 ทั่วไปผลัดออฟติคอลได้รับการพิจารณาด้วยเพอร์กินเอลเมอ 241 สเปกโตรมิเตอร์และสเปกตรัมรังสียูวีที่ถูกบันทึกไว้ด้วย Shimadzu spectrophotometer UV-Vis UV-2450
สเปกตรัม NMR บันทึกด้วย Bruker Avance III 700 สเปกโตรมิเตอร์ที่มี 5 มม TCI cry- oprobe (1H 700 MHz, 175 MHz 13C) Bruker DMX-600 (1H 600MHz, 13C 150MHz) และ Avance III 500 (1H 500MHz, 125MHz 13C) สเปกโทรมิเตอร์ HRESI-MS สเปกตรัมที่ได้รับตามที่อธิบาย Halecker et al, (2014) การแยกสารบริสุทธิ์ก็ประสบความสำเร็จหากไม่ได้ระบุเป็นอย่างอื่นที่มีการเตรียม HPLC (Gilson, มิดเดิลตันสหรัฐอเมริกา) พร้อมกับ GX-271 Handler เหลว 172 DAD, 305 และ 306 ปั๊ม (มี 50SC หัวลูกสูบปั๊ม) ในฐานะที่เป็นเฟสคอลัมน์ VP Nucleodur C18 ec (125 ขนาด 40 มม 7 LM; Macherey-แจคกี้) ถูกนำมาใช้ เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยน้ำ deionised (พัน-Q คชวาล, เยอรมนี) กับ 0.1% กรดอะซิติก (ตัวทำละลาย; Roth) และ acetonitrile (ACN) กับ 0.1% กรดอะซิติก (ตัวทำละลาย B) อัตราการไหลถูกกำหนดให้ 15 มล. / นาที.
4.2 เชื้อราวัสดุ
Stromata (ดอกเห็ด) ของเอช rickii MJF10324 ถูกเก็บในปี 2010 จากเกาะแคริบเบียนมาร์ตินีโดยเจเยร์ สายพันธุ์ที่ได้รับการกำหนดให้เป็น epitype ชนิด (Kühnert et al., 2014b) วัฒนธรรมที่ได้มาโดยการแยก multispore ในสื่อ YMG (1.0% สารสกัดจากมอลต์กลูโคส 0.4% สารสกัดจากยีสต์ 0.4% ค่า pH 6.3) โดยใช้วิธีการที่ระบุไว้โดย Stadler et al, (2014) และได้รับการฝากไว้ในคอลเลกชันวัฒนธรรมสาธารณะ (MUCL 53309 ซีบีเอส 129345).
4.3 การเพาะปลูกการสกัดและการแยก
4.3.1 การเพาะปลูกเพื่อศึกษาสภาวะที่เหมาะสมในการผลิตสารเอชรอง rickii ถูกย้ายไปสี่สื่อของเหลวที่แตกต่างกัน (กลาง YMG; Q6 / 2 กลาง: กลีเซอรีน 1.0%, 0.25% กลูโคส, ผ้าฝ้าย 0.5% แป้งเมล็ดค่า pH 7.2; ZM / 2 กลาง : 0.5 กากน้ำตาล%, 0.5% อาหาร oat- กลูโคส 0.15%, 0.4% ซูโครสแมนนิทอล 0.4%, 0.05% edamine ซัลเฟต 0.05% แอมโมเนียมแคลเซียมคาร์บอเนต 0.15% pH 7.2; HLX กลาง: 3.0% ซูโครส 1.0% ซามิ กรด 0.1% K2HPO4, สารสกัดจากยีสต์ 0.1%, 0.05% MgSO4 7H2O, 0.05% KCl, 0.001% FeSO4 7H2O) ใน Erlenmeyer ขวด (500 มล.) ที่เต็มไปด้วยแต่ละคนมีสื่อ 200 มล
สื่อเหล่านี้ถูกเลือกเพราะการศึกษาก่อนหน้า (Bitzer et al, 2008;. Stadler et al, 2003;. รวมทั้งรายละเอียดเกี่ยวกับซัพพลายเออร์ของส่วนผสม) ได้เปิดเผยว่านำมารวมกันที่พวกเขาจะดีที่สุดสำหรับการบรรลุ metabo- รองเสริมในรูปแบบไลต์ ascomycetes ใย วัฒนธรรมที่จมอยู่ใต้น้ำได้รับการบ่มที่ 23 องศาเซลเซียสในที่มืดในเครื่องปั่นหมุนที่
140 รอบต่อนาที การหมักถูกยกเลิกหลังจากกลูโคสฟรีได้จะประกอบด้วยทุโภชนาการและค่า pH ได้ผ่านขั้นต่ำ.
4.3.2 การสกัดและการหมักขนาดใหญ่หาร (20 มล.) น้ำซุปวัฒนธรรมผสมกับ 20 มล. เอทิลอะซิเตทและสกัดในห้องอาบน้ำอัลตราโซนิกเป็นเวลา 30 นาที
เฟสอินทรีย์ถูกกรองมากกว่าโซเดียมซัลเฟตปราศจากน้ำและระเหย สารสกัดที่เหลือถูกละลายใน nol metha- และวิเคราะห์ด้วย HPLC เพื่อการวิเคราะห์การติดตั้งเครื่องตรวจจับอาร์เรย์ไดโอด (DAD) ตามที่อธิบาย Stadler et al, (2001) ปริมาณและคุณภาพของสารทุติยภูมิที่เป็นที่สูงที่สุดใน HLX และ ZM / 2 สื่อ สำหรับการปรับขึ้นวัตถุประสงค์กลาง HLX ได้รับเลือก วัฒนธรรมเมล็ดพันธุ์ของสายพันธุ์ที่มีปริมาณรวมของ 1 ลิตรถูกจัดทำขึ้นในระดับปานกลาง YMG และบ่มเป็นเวลา 7 วัน BioStat UE 100 เครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพ (B. Braun Melsungen เอจี, เยอรมนี) ที่เต็มไปด้วยสื่อ 70 ลิตร HLX ได้รับเชื้อด้วยวัฒนธรรมเมล็ดพันธุ์ภายใต้สภาพปลอดเชื้อ เพื่อป้องกันการก่อตัวโฟมรวม 20 กรัม Tegosipon (Evonik, เอสเซน, เยอรมนี) ถูกเพิ่มเข้ามาในส่วนของ 2 10 กรัมเท่าที่จำเป็นโดยใช้ระบบอัตโนมัติ ค่าพีเอชได้รับการรักษาระหว่าง 6.0 และ 6.3 โดยใช้โพแทสเซียมไฮดรอกไซ (2 N) และกรดกำมะถัน (1 M) ตามลำดับ อุณหภูมิอยู่ที่ 26 องศาเซลเซียส ความอิ่มตัวของออกซิเจนถูกเก็บไว้ข้างต้นไม่ต่ำกว่า 20%, การควบคุมโดยการเพิ่มความเร็วกวนของกังหันรัชตันโดยระบบการควบคุมกระบวนการในตัว ความเร็วในการกวนเริ่มต้นถูกกำหนดให้ 50rpm และถึงความเร็วสูงสุด 400 รอบต่อนาทีอัตราการให้อากาศถูกกำหนดให้ 5 Sl / นาทีและคงที่อยู่ระหว่างการหมัก วัฒนธรรมเก็บเกี่ยวหลังจากวันที่ 7 เป็นน้ำตาล (น้ำตาลฟรุกโตส) กำลังหมดลง หลังจากนั้นเป็นต้นมาเส้นใยถูกแยกออกจากของเหลววัฒนธรรมโดยการกรองสูญญากาศที่จะให้ผลผลิตเป็นจำนวนเงินรวม 3 กก. ชีวมวลเปียกซึ่งต่อมาถูกสกัดด้วยอะซีโตน 9 ลิตรในอ่างอัลตราโซนิกเป็นเวลา 1 ชั่วโมง สารสกัดจากอะซิโตนถูกกรองและระเหยให้ผลผลิตช่วงน้ำ (3.5 ลิตร) ซึ่งได้รับการดำเนินการต่อไปโดยการสกัด 3 1 ลิตรของน้ำนมในช่องทางแยก ต่อจากนั้นขั้นตอนอินทรีย์สั่งแบบผสมแห้งมากกว่าโซเดียมซัลเฟตปราศจากน้ำระเหยและให้ผลผลิต 12 กรัมของน้ำมันสารสกัดเส้นใย (ME) ทั้งหมด.
4.3.3 การแยกของ terpenoids
ผมมี terpenoids ทั้งหมดถูกแยกออกเป็นสามส่วนและแต่ละ (4 กรัม) ละลายในเมทานอล 12 มล. แต่ละส่วนต่อมาก็อกไว้ fil- ผ่าน RP ตลับของแข็ง (33mm ชั้น-X พอลิเมอเวิร์สเฟส; Phenomenex อาส, เยอรมนี) และอยู่ภายใต้การเตรียม RP MPLC [คอลัมน์ 480 30 มม ODS / AQ C18 (Kronlab) ใช้ต่อไปนี้ สภาวะ: เฟสมือถือที่มีตัวทำละลาย [90% น้ำ deionised (หนึ่งในพัน Q), เมทานอล 10%] และตัวทำละลาย B (เมทานอล) ลาดเชิงเส้นของ B ระบายสารละลายจาก 10% ถึง 100% ใน 60 นาทีตามด้วย เงื่อนไข isocratic ที่ 100% ตัวทำละลาย B 20 นาที, อัตราการไหล 30 มล. / นาทีการตรวจสอบจุดสูงสุดรังสียูวีที่ 210 นาโนเมตร จำนวนรวมทั้งสิ้น 160 เศษส่วนต่อการทำงานที่ได้รับซึ่งถูกรวมกันตามยอดเขาหลักที่จะให้ผลผลิต 15 เศษส่วนหลัก แต่ละส่วนหลักระเหยและสารสกัดจากน้ำมันดิบวิเคราะห์โดยวิธี HPLC-DAD หนึ่งในเศษส่วนหลักที่ได้มาจากการทำงานครั้งแรก [การเก็บรักษาเวลา (RT): 56.0-57.0 นาที; 15 มก.) ที่มีสารบริสุทธิ์ 4. ส่วนอีกที่ได้รับในระยะแรก (58.0-59.0 นาที, 16 มก.) ได้รับการ fractionized ต่อไปโดย RP HPLC (ลาดเชิงเส้นจาก 25% ถึง 100% ตัวทำละลาย B ใน 40 นาที) ที่จะได้รับสารที่ 1 ( 0.75 มก.) และ 9 (0.73 มก.) การ frac- ต่อไปที่ได้มาจากการทำงานครั้งแรก (RT: 48.5-49.0 นาที 34 มก.) ถูกแยกออกมาอีกครั้งโดยเตรียม RP HPLC (ลาดเชิงเส้นจาก 30% เป็น 60% ในตัวทำละลาย B 30 นาที) เพื่อให้ได้สาร 6 (7 มิลลิกรัม ) และ [10] (3 มก.) Compound [3] (4 มก.) บริสุทธิ์จากส่วนหลักของระยะที่สอง (RT: 57.0-58.5 นาที; 59 มก.) โดยเชิง prepara- HPLC [ลาดเชิงเส้น 40-100% ใน 25 นาทีโดยใช้ ACN 95% + 5 น้ำ deionised% เสริมด้วย 0.015% กรด (Roth) เป็นตัวทำละลาย B] ส่วนของการทำงานเดียวกันอีก (RT: 43.0-45.5 นาที; 119 มก.) ได้รับการ fractionized (ลาดเชิงเส้น

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

3 . สรุป
เราแยกเจ็ดนวนิยายเทอร์ปีนอยด์ของ 3 ครอบครัวที่มีโครงสร้างแตกต่างจากการเลี้ยงเดี่ยวของเชื้อรา xylariaceous h rickii . สารประกอบ 1 – 3 มีสมาชิกใหม่ของครอบครัว botryane ในขณะที่ 4 – 6 มีแยกก่อนหน้านี้ hypoxyalins เป็น C ( 7 ) ( 9 ) 14 noreudesmanes ที่สามารถ biosynthetically เกี่ยวข้องกับ eremophilanes .การ rickitin อยด์ ( 10 ) เป็นครั้งแรกของไลท์กับ abietane กระดูกสันหลัง ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ไปที่ความหลากหลายนี้สิ่งที่ไม่คาดหมายของเทอร์ปีนอยด์ในการตกผลึก และครอบครัวที่มีเพื่อให้ห่างไกลเชื้อราส่วนใหญ่เป็นที่รู้จักสำหรับความหลากหลายของ polyketides nitrogen-containing วินาที และ ondary สาร .
4 ทดลองส่วน
4.1 . ทั่วไป
แสงรอบตัดสินใจกับเพอร์กินเอลเมอร์ 241 สเปกและ UV แสงที่ถูกบันทึกไว้กับ Shimadzu UV Spectrophotometer ( VIS uv-2450 . NMR สเปกตรัมได้ถูกบันทึกไว้ด้วย BRUKER วนซ์ 3 700 คุ่มกับ 5 มม. 12 ร้องไห้ - oprobe ( 1 , 700 MHz 13C 175 MHz ) , dmx-600 BRUKER ( 1H และ 13C 600MHz 150mhz , 500 ( 1 ) วนซ์ III 500MHz 13C า , 125mhz ) .hresi-ms Spectra ได้รับตามที่อธิบายไว้โดย halecker et al . ( 2014 ) การแยกสารประกอบบริสุทธิ์ได้สําเร็จ ถ้าไม่ระบุมิฉะนั้นด้วย HPLC ( กิลสัน มิดเดิลตัน ด , USA ) พร้อม gx-271 เหลวผู้ดูแล , พ่อ , 305 306 ( 50sc และปั๊มลูกสูบหัวปั๊ม ) เป็นเครื่องเขียนเฟส VP nucleodur c18 EC คอลัมน์ ( 125 40 มม. 7 LM ; macherey –นาเกล ) คือใช้เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วย deionised น้ำ ( milli-q มิลลิ , Schwalbach , เยอรมนี ) 0.1% กรดน้ำส้ม ( ตัวทำละลาย ; Roth ) และไน ( ACN ) 0.1% กรดน้ำส้ม ( ตัวทำละลาย B ) การตั้งค่าอัตรา 15 มิลลิลิตร / นาที
4.2 . stromata วัสดุ
รา ( กินเนื้อ ) . rickii mjf10324 เก็บตัว 2010 จากเกาะแคริบเบียน ไทย โดย โฟร์เนียร์ .สายพันธุ์ที่ถูกกำหนด epitype ของสปีชีส์ ( kuhnert et al . , 2014b ) วัฒนธรรมเกิดจาก multispore แยกบน ymg ขนาดกลาง ( สารสกัดจากมอลต์ 1.0 % 1% กลูโคส 0.4 % สารสกัดจากยีสต์ , pH 6.3 ) โดยใช้วิธีการที่อธิบายไว้โดย Stadler et al . ( 2014 ) และได้รับฝากไว้ในคอลเลกชันของวัฒนธรรมสาธารณะ ( mucl 53309 CBS 129345 ) .
4.3 . การปลูก การสกัดและการแยก
ใน . การเพาะปลูก
เพื่อศึกษาสภาวะที่เหมาะสมสำหรับการผลิตระดับมัธยมศึกษา . rickii ย้ายไปสี่แตกต่างกันของเหลวสื่อ ( ymg ขนาดกลาง ; Q6 / ขนาดกลาง 2 : 1.0 % กลีเซอรอล น้ำตาล แป้งเมล็ดฝ้าย 0.25% และ 0.5% pH 7.2 ; ZM / ขนาดกลาง 2 : 0.5 % กากน้ำตาล 0.5% โอ๊ต - อาหาร , กลูโคส , 0.15 % 4 % ซูโครส 0.4 % 5 % edamine 0.05 0.05 เปอร์เซ็นต์แอมโมเนียมซัลเฟต 0.15 % แคลเซียมคาร์บอเนต , pH 7.2 ; hlx ขนาดกลาง 3 .0 % ซูโครส 1.0% กรด casamino 0.1 % k2hpo4 ยีสต์สกัด 0.1% 0.05 เปอร์เซ็นต์ MgSO4 ใ 7h2o 0.05 % ปริมาณ 0.001 % feso4 7h2o ) ในเออร์เลนเมเยอร์ขวด ( 500 มล. ) 200 มล. เติมแต่ละ ด้วยสื่อ สื่อเหล่านี้ถูกเลือกเนื่องจากการศึกษาก่อนหน้านี้ ( บิทเซอร์ et al . , 2008 ; Stadler et al . , 2003 ; รวมทั้งรายละเอียดของซัพพลายเออร์ของส่วนผสม ) ได้เปิดเผยว่า ถ่ายด้วยกันพวกเขากำลังที่เหมาะสมสำหรับการประกอบรองแท่น - Lite โปรไฟล์ในเส้นใยแอ คไมซิทิส . วัฒนธรรมในอุณหภูมิ 23 องศาองศาเซลเซียสในที่มืดในเครื่องปั่นหมุนที่
140 รอบต่อนาที ถูกยกเลิกหลังจากการหมักกลูโคสฟรีคือคอน - สุเมดและค่า pH ได้ผ่านน้อยที่สุด
4.3.2 . การสกัดและ
หมักขนาดใหญ่เป็นส่วนลงตัว ( 20 มล. ) ของวัฒนธรรมน้ำซุปผสมกับเอทิลอะซีเตท 20 ml และสกัดเป็นนํ้า ultrasonic เป็นเวลา 30 นาที ระยะอินทรีย์ถูกกรองผ่านโซเดียมซัลเฟตแอนไฮดรัส และระเหย ที่เหลือก็ละลายสารสกัดหยาบเมธานอล - วิเคราะห์ด้วยการวิเคราะห์ HPLC พร้อมกับไดโอดเรย์ตรวจจับ ( พ่อ ) ตามที่อธิบายไว้โดย Stadler et al . ( 2001 )ปริมาณและคุณภาพของสารประกอบทุติยภูมิได้สูงสุดใน hlx / 2 ZM และสื่อ สำหรับการปรับขึ้นมี hlx ขนาดกลางที่ถูกเลือก เมล็ดเพาะสายพันธุ์ที่มีปริมาณ 1 ลิตรที่เตรียมไว้ใน ymg ขนาดกลาง และบ่มใน 7 วัน . เป็นอ 100 ( UE ( พ. บราวน์ เมลล์ซุนเก่น AG , Germany ) เต็มไปด้วย 70 ลิตร hlx กลางเป็นเชื้อที่มีการเพาะเมล็ดภายใต้สภาพปลอดเชื้อเพื่อป้องกันการเกิดฟองในรวม 20 กรัม ( evonik Essen , เยอรมนี , tegosipon ) เพิ่มในส่วนของ 2 – 10 กรัมเท่าที่จำเป็น การใช้ระบบประปาอัตโนมัติ มีค่าอยู่ระหว่าง 6.0 และรักษา 6.3 ใช้โพแทสเซียมไฮดรอกไซด์ ( 2 ) และกรดซัลฟิว ( 1 เมตร ) ตามลำดับ อุณหภูมิไว้ที่ 26 องศา ความอิ่มตัวของออกซิเจนที่ถูกเก็บไว้ข้างต้นอย่างน้อย 20 %ควบคุมโดยการเพิ่มความเร็วของกังหันหมุน Rushton โดยระบบควบคุมกระบวนการในตัว . ความเร็วหมุนเริ่มต้นตั้ง 50rpm และถึงความเร็วสูงสุด 400 รอบต่อนาทีอัตราการให้อากาศตั้ง 5 SL / min และคงที่ในระหว่างการหมัก วัฒนธรรมที่ถูกเก็บเกี่ยวหลังจาก 7 วัน เช่น น้ำตาล ( ซูโครส ฟรักโทส ) ได้หมด หลังจากนั้นการเพาะเลี้ยงแยกจากของเหลววัฒนธรรมโดยการกรองสูญญากาศที่จะทำให้ปริมาณ 3 กิโลกรัมเปียกน้ำ ซึ่งภายหลังถูกสกัดด้วยอะซีโตนในอ่างอัลตราโซนิก 9 ลิตร เป็นเวลา 1 ชั่วโมง สำหรับสารสกัดถูกกรองและระเหยผลผลิตระยะน้ำ ( 3.5 ลิตร ) ซึ่งถูกเพิ่มเติมประมวลผล โดยการสกัดด้วย 3 1 ลิตร ของเอทิลอะซิเตทในกรวยแยก .ต่อมาระยะอินทรีย์ถูกดอทคอม - bined แห้งกว่าอันไฮดรัสโซเดียมมซัลเฟตและระเหย 12 กรัมของเส้นใยต่อผิวสกัด ( ฉัน ) รวม
4.3.3 . การแยกของเทอร์ปีนอยด์
ฉันที่มีทั้งหมดเทอร์ปีนอยด์ก็แยกเป็นสามส่วน และแต่ละ ( 4 กรัม ) ละลายในเมทานอล 12 ml . แต่ละส่วนได้ในภายหลังใน - tered ผ่าน RP แข็งตลับ ( strata-x 33mm ระยะ ,ใช้ขั้นตอนกลับ ; phenomenex Aschaffenburg , เยอรมนี ) และภายใต้คอลัมน์ค่า RP mplc [ 480 30 มม. ODS / AQ c18 ( kronlab ) ใช้ตาม condi - tions : เฟสเคลื่อนที่ด้วยตัวทำละลายน้ำ deionised [ 90% ( พัน - q ) 10% และตัวทำละลายเมทานอล ( methanol ) , ลาดเชิงเส้น ข ของ Sol - ระบาย B จาก 10% ถึง 100% ใน 60 นาทีตามสภาพ Isocratic ที่ 100% ตัวทำละลาย B สำหรับ 20 นาทีอัตราการไหลของ 30 มล. / นาที , UV สูงสุดการตรวจสอบ 210 นาโนเมตร จำนวน 160 เศษส่วนต่อวิ่งได้ , ซึ่งรวมกันตามยอดเขาหลักผลผลิต 15 ส่วนหลัก หลักแต่ละส่วนถูกระเหยและสารสกัดที่วิเคราะห์ โดย hplc-dad . หนึ่งในหลักเศษส่วนได้จากครั้งแรกที่ใช้ [ retention time ( RT ) : 56.0 – 57.0 มิน ; 15 มก. ) ประกอบด้วยสารประกอบบริสุทธิ์ 4ส่วนอื่นที่ได้รับในรอบแรก ( 58.0 – 59.0 นาที 16 มิลลิกรัมต่อ fractionized โดย RP HPLC ( เชิงเส้นไล่ระดับจาก 25% ถึง 100% ตัวทำละลาย B 40 นาที ) เพื่อให้ได้สารประกอบ 1 ( 0.75 มิลลิกรัม ) และ 9 ( 0.73 มิลลิกรัม ) อีก frac - tion มาจากรอบแรก ( RT : 48.5 – 49.0 มิน ;34 มก. ) อีกครั้งโดยแยกค่า RP HPLC ( เชิงเส้นไล่ระดับจาก 30% ถึง 60% ตัวทำละลาย B ใน 30 นาที ) เพื่อให้ได้สารประกอบ 6 ( 7 มก. ) และ [ 10 ] ( 3 มก. ) สาร [ 3 ] ( 4 มิลลิกรัม ) บริสุทธิ์จากส่วนหลักของวิ่งที่สอง ( RT : 57.0 – 58.5 มิน ; 59 มิลลิกรัม ) โดย prepara - tive HPLC [ เส้นไล่ระดับจาก 40 ถึง 100 % ใน 25min ใช้ 95% ACN 5% deionised น้ำเสริมด้วย 0015 % กรด ( โรท ) เป็นตัวทำละลาย B ] อีกส่วนของวิ่งเหมือนกัน ( RT : 43.0 28.9 –มิน ; 119 มก. ) คือ fractionized ( ลาดเชิงเส้น