In this scenario, the probabilities

In this scenario, the probabilities of channel opening from
the nonliganded (R), mono-liganded (AR), and di-liganded
(A2R) states were 9.9_10_6, 0.007, and 0.84, respectively.
What this implies is that an overwhelming majority of the
receptors, in the absence of agonist, are in the R state. A pulse
of GABA at the synaptic cleft would then drive the receptors
through the AR and A2R states to the open A2R* state. For
this reason, a majority of kinetic studies (ours included) have
typically (and safely) ignored openings of the unliganded and
mono-liganded states. At the end of the manuscript where we
proposed this activation mechanism, we concurred that while
normal activation can be adequately described by this
submechanism, the more comprehensive model might be
necessary to account for the actions of selective GABA
receptor modulators (Chang & Weiss, 1999).
A salient feature of this type of mechanism originally
proposed some 50 years ago (Del Castillo & Katz, 1957) is that
the agonist affinity is higher for the open states (A*, AR*, and
A2R*) compared to the closed states (R, AR, and A2R). In our
particular case (a1b2g2 GABAA receptors), the affinity of the
closed state for GABA was E650-fold less than the affinity of
the open state (Chang & Weiss, 1999). Based on our proposed
activation mechanism (Chang & Weiss, 1999), we reasoned
that DZP could alter the sensitivity of the receptor by shifting
the equilibrium between R and R* such that relatively more
receptors reside in the unliganded open state. As more
receptors are in the high-affinity open state, the sensitivity to
GABA-mediated activation would be increased. Here, we
show this is indeed what happens and this concept can account
for the actions of DZP on GABAA receptors. It also provides
a simple approachable notion of allosteric regulation; simply
put, weak agonism at a site distinct from that of agonist.
Methods
Site-directed mutagenesis and in vitro transcription
Unless otherwise noted, all GABAA receptor isoforms used in
this study were rat a1, b2, and g2. The rat a1-, b2-, and g2Lsubunits
were obtained by polymerase chain reaction from a
rat brain cDNA library (Amin et al., 1994). The three subunits
were cloned into pALTER-1 (Promega, Madison, WI, U.S.A.)
and pGEMHE (Liman et al., 1992) vectors. The a1- and
g2-subunits were both cloned in pALTER-1 and pGEMHE
between HindIII and XbaI, whereas b2 in pALTER-1 was
cloned between SalI and BamHI, and in pGEMHE, b2 was
cloned at the HindIII site. All mutations were confirmed by
cDNA sequencing.
The wild-type and mutant cDNAs of the a1-, b2-, g2Lsubunits
in pALTER-1 were linearized by SspI and those in
pGEMHE were linearized by NheI. This linearization process
leaves a tail of several hundred base pairs for RNA stability.
Capped cRNAs from the pALTER-1 and pGEMHE vectors
were transcribed using SP6 or T7 RNA polymerase (Ambion,
Austin, TX, U.S.A.), respectively, using the RNeasy Mini Kit
(Qiagen, Valencia, CA, U.S.A.). After degradation of the
DNA template by RNase-free DNase I, the cRNAs were
purified and suspended in diethyl pyrocarbonate (DEPC)-
treated water. The cRNA yield and integrity were examined on
a 1% agarose gel.
Oocyte isolation and cRNA injection
Female Xenopus laevis (Xenopus I, Ann Arbor MI, U.S.A.)
were anesthetized with 0.2% MS-222 and the ovarian lobes
were surgically removed and placed in a Ca2-free oocyte
Ringer’s solution (OR2) consisting of (in mM) 92.5 NaCl, 5
HEPES, 2.5 KCl, and 1 MgCl2 (pH 7.5). The lobes were cut
into small pieces and digested with 0.2% collagenase A (Roche
Diagnostics, Indianapolis, IN, U.S.A.) in the above solution at
room temperature with continuous stirring until the oocytes
were dispersed (1–2 h). The oocytes were then thoroughly
rinsed with ND-96 incubation solution consisting of (in mM)
96 NaCl, 5 HEPES, 2 KCl, 1 MgCl2, 1.8 CaCl2, 2.5
NaCH3COCO2, 5% horse serum, 0.05 mgml_1 gentamycin,
and 10Uml_1 penicillin/streptomycin (pH 7.5). Stage VI
oocytes were selected and incubated at 141C.
A P87 horizontal puller (Sutter Instrument Co., Novato,
CA, U.S.A.) was used to make micropipettes from borosilicate
glass (Drummond Scientific, Broomall, PA, U.S.A.) for cRNA
injection. The micropipette tips were cut with microscissors to
B40 mm OD. The cRNA for a : b : g-subunits were mixed in a
1 : 1 :2 ratio and diluted 45- to 100-fold with DEPC-treated
water. No dilution was employed for the high expression
experiments. The cRNA was injected into the oocytes with a
Nanoject microinjection system (Drummond Scientific, Broomall,
PA, U.S.A.). The volume of the microinjection into each
oocyte was varied from 27 to 84 nl to provide a range of
expression levels. Typically, a total of 0.1–1 ng of cRNA was
injected into each individual oocyte.
Recording from oocytes
At 1–3 days after cRNA injection, oocytes were placed in a
small volume chamber (o100 ml) with a 300-mm nylon mesh
R AR A2R
R* AR* A2R*
KR KR
KR* KR*
L Lc Lc2
support. The oocyte was continuously perfused at a rate

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ในสถานการณ์สมมตินี้ น่าจะของช่องเปิดจากnonliganded (R), โมโน liganded (AR), และ di ligandedอเมริกา (A2R) ขึ้น 9.9_10_6, 0.007, 0.84 ตามลำดับสิ่งนี้แสดงให้เห็นว่าส่วนใหญ่ที่ครอบงำของการรับของอะโกนิสต์ อยู่ในสถานะ R ชีพจรของ GABA ที่แหว่งผู้ต้องแล้วขับรับผ่านอเมริกา AR และ A2R เปิด A2R * รัฐ สำหรับด้วยเหตุนี้ ส่วนใหญ่ของการศึกษาเคลื่อนไหว (เรารวม) มีโดยทั่วไป (และปลอดภัย) ละเว้นช่องของ unliganded การ และโมโน liganded อเมริกา ที่สุดของต้นฉบับที่เรากลไกนี้เปิดใช้งานการนำเสนอ เราเห็นพ้องว่า ในขณะที่เปิดใช้งานปกติสามารถอธิบายนี้อย่างเพียงพอsubmechanism แบบจำลองครอบคลุมมากขึ้นอาจจะการบัญชีสำหรับการดำเนินการของกาบาเลือกรับข้อ (ช้าง & Weiss, 1999)คุณลักษณะเด่นของประเภทของกลไกเดิมนำเสนอบาง 50 ปี (Castillo Del และแคทซ์ 1957) คือความสัมพันธ์อะโกนิสต์มีสูงกว่าอเมริกาเปิด (A * AR * และA2R*) เปรียบเทียบกับอเมริกาปิด (R, AR และ A2R) ในของเรากรณีเฉพาะ (รับ GABAA a1b2g2) ความสัมพันธ์ของการสถานะปิดสำหรับกาบาถูก E650 พับน้อยกว่าความสัมพันธ์ของสถานะเปิด (ช้าง & Weiss, 1999) ตามที่เราเสนอมีกลไกในการเปิดใช้งาน (ช้าง & Weiss, 1999), เรา reasonedDZP ที่สามารถเปลี่ยนแปลงความไวของรับโดยสมดุลระหว่าง R และ R * ดังกล่าวเพิ่มเติมว่าค่อนข้างตัวรับอยู่ในรัฐเปิด unliganded เป็นมากตัวรับที่อยู่ในสถานะสูงความสัมพันธ์เปิด ความไวแสงเพื่อมี GABA เปิดใช้งานจะเพิ่มขึ้น ที่นี่ เรานี่เป็นสิ่งที่เกิดขึ้น และแนวคิดนี้บัญชีการกระทำของ DZP บนตัวรับ GABAA นอกจากนี้ยังมีความเร็วง่ายของกฎระเบียบเปลี่ยนเสียง allosteric เพียงแค่ใส่ agonism อ่อนที่ไซต์แตกต่างจากอะโกนิสต์วิธีการนำเว็บไซต์ mutagenesis และถอดในหลอดทดลองเว้นแต่ระบุ isoforms รับ GABAA ทั้งหมดใช้ในการการศึกษานี้ได้หนู a1, b2 และ g2 หนู a1, b2- และ g2Lsubunitsได้รับมา โดยปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสจากการหนูสมอง cDNA ไลบรารี (Amin et al. 1994) กำหนดสามมีการลอกแบบลงใน pALTER-1 (Promega เมดิสัน WI สหรัฐอเมริกา)pGEMHE (Liman et al. 1992) และเวกเตอร์ A1 - และกำหนด g2 ถูกโคลนใน pALTER-1 และ pGEMHEระหว่าง HindIII และ XbaI ในขณะที่เป็น b2 ใน pALTER-1ถูกโคลน ระหว่างสลี่และ BamHI และ pGEMHE, b2โคลนที่เว็บไซต์ HindIII พันธุ์ทั้งหมดได้รับการยืนยันโดยลำดับ cDNACDNAs ชนิดของป่า และกลายพันธุ์ a1- b2- g2Lsubunitsใน pALTER 1 ถูก linearized SspI และในpGEMHE ถูก linearized โดย NheI กระบวนการนี้ linearizationใบหางหลายร้อยคู่ฐานสำหรับเสถียรภาพของ RNACRNAs capped จากเวกเตอร์ pALTER 1 และ pGEMHEถูกทับศัพท์ใช้ SP6 หรือ T7 RNA พอลิเมอเรส (AmbionAustin, TX, U.S.A.), respectively, using the RNeasy Mini Kit(Qiagen, Valencia, CA, U.S.A.). After degradation of theDNA template by RNase-free DNase I, the cRNAs werepurified and suspended in diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water. The cRNA yield and integrity were examined ona 1% agarose gel.Oocyte isolation and cRNA injectionFemale Xenopus laevis (Xenopus I, Ann Arbor MI, U.S.A.)were anesthetized with 0.2% MS-222 and the ovarian lobeswere surgically removed and placed in a Ca2-free oocyteRinger’s solution (OR2) consisting of (in mM) 92.5 NaCl, 5HEPES, 2.5 KCl, and 1 MgCl2 (pH 7.5). The lobes were cutinto small pieces and digested with 0.2% collagenase A (RocheDiagnostics, Indianapolis, IN, U.S.A.) in the above solution atroom temperature with continuous stirring until the oocyteswere dispersed (1–2 h). The oocytes were then thoroughlyrinsed with ND-96 incubation solution consisting of (in mM)96 NaCl, 5 HEPES, 2 KCl, 1 MgCl2, 1.8 CaCl2, 2.5NaCH3COCO2, 5% horse serum, 0.05 mgml_1 gentamycin,and 10Uml_1 penicillin/streptomycin (pH 7.5). Stage VIoocytes were selected and incubated at 141C.A P87 horizontal puller (Sutter Instrument Co., Novato,CA, U.S.A.) was used to make micropipettes from borosilicateglass (Drummond Scientific, Broomall, PA, U.S.A.) for cRNAinjection. The micropipette tips were cut with microscissors toB40 mm OD. The cRNA for a : b : g-subunits were mixed in a1: อัตรา 1:2 และปรับลด 45 - ไป 100 - fold ด้วยถือ DEPCน้ำ ไม่เจือจางถูกจ้างสำหรับค่าสูงการทดลอง CRNA ถูกฉีดเข้าไปในเชื้ออสุจิจนมีการNanoject ระบบ microinjection (ดรัมวิทยาศาสตร์ BroomallPA สหรัฐอเมริกา) Microinjection ในแต่ละระดับoocyte ถูกแตกต่างจาก 27 การ 84 nl ให้หลากหลายแสดงระดับ โดยทั่วไป รวม 0.1 – 1 ฉบับของ cRNA ได้ฉีดเข้าไปใน oocyte แต่ละบุคคลบันทึกจากเชื้ออสุจิจนที่ 1 – 3 วันหลังจากฉีด cRNA เชื้ออสุจิจนถูกวางไว้ในห้องขนาดเล็ก (o100 มิลลิลิตร) ด้วยตาข่ายไนล่อน 300 มม.R AR A2RR * AR * A2R *KR KRKR * KR *L Lc Lc2การสนับสนุน Oocyte เป็นหลอดเข้าไปเลี้ยงอย่างต่อเนื่องในอัตราที่

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ในสถานการณ์นี้น่าจะเป็นของการเปิดช่องทางจาก
nonliganded (R), โมโน liganded (AR) และ di-liganded
(A2R) สหรัฐอเมริกาเป็น 9.9_10_6, 0.007 และ 0.84 ตามลำดับ.
สิ่งนี้หมายถึงก็คือว่าส่วนใหญ่ที่ครอบงำ ของ
ผู้รับในกรณีที่ไม่มีตัวเอกที่อยู่ในสถานะที่ R ชีพจร
ของ GABA ที่ synaptic แหว่งแล้วจะขับรถผู้รับ
ผ่าน AR และ A2R สหรัฐฯเปิด A2R * รัฐ สำหรับ
เหตุผลนี้ส่วนใหญ่ของการศึกษาเกี่ยวกับการเคลื่อนไหว (ของเรารวม) ได้
โดยทั่วไป (และปลอดภัย) ละเว้นการเปิดของ unliganded และ
สหรัฐอเมริกาโมโน liganded ในตอนท้ายของต้นฉบับที่เรา
นำเสนอกลไกการเปิดใช้งานนี้เราเห็นว่าในขณะที่
การเปิดใช้งานตามปกติที่สามารถอธิบายได้อย่างเพียงพอตามนี้
submechanism รูปแบบที่ครอบคลุมมากขึ้นอาจจะมี
ความจำเป็นที่จะบัญชีสำหรับการกระทำของการเลือกกาบา
modulators รับ (ช้างและไวส์ 1999 ).
คุณลักษณะเด่นของประเภทของกลไกนี้ แต่เดิม
ที่เสนอ 50 ปีที่ผ่านมา (Del Castillo & Katz, 1957) คือ
ความสัมพันธ์ที่ตัวเอกเป็นที่สูงขึ้นสำหรับเปิดสหรัฐอเมริกา (A *, AR * และ
A2R *) เมื่อเทียบกับปิด สหรัฐอเมริกา (R, AR และ A2R) ของเราใน
กรณีพิเศษ (a1b2g2 ผู้รับ GABAA) ความสัมพันธ์ของ
รัฐที่ปิดสนิทสำหรับ GABA เป็น E650 เท่าน้อยกว่าความสัมพันธ์ของ
รัฐเปิด (ช้างและไวส์, 1999) ขึ้นอยู่กับเราเสนอ
กลไกการเปิดใช้งาน (ช้างและไวส์, 1999) เรามีเหตุผล
ที่ DZP สามารถปรับเปลี่ยนความไวของตัวรับโดยขยับ
สมดุลระหว่าง R และ R * เช่นที่ค่อนข้างเพิ่มเติม
ผู้รับอยู่ในสถานะเปิด unliganded ในฐานะที่เป็น
ตัวรับอยู่ในระดับสูงความสัมพันธ์สถานะเปิดความไวในการ
เปิดใช้งาน GABA พึ่งจะเพิ่มขึ้น ที่นี่เรา
แสดงนี่เป็นสิ่งที่เกิดขึ้นและแนวคิดนี้สามารถอธิบาย
การกระทำของ DZP ผู้รับ GABAA นอกจากนี้ยังมี
ความคิดที่เข้าถึงได้ง่ายของการควบคุม allosteric; เพียงแค่
ใส่ agonism อ่อนแอที่เว็บไซต์ที่แตกต่างจากที่ของตัวเอกได้.
วิธีการ
เว็บไซต์กำกับฉับและในหลอดทดลองถอดความ
เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่นทุกไอโซฟอร์ม GABAA รับใช้ในการ
ศึกษาครั้งนี้มีหนู A1, B2 และ G2 a1- หนู b2- และ g2Lsubunits
ที่ได้รับโดยวิธี Polymerase chain reaction จาก
ห้องสมุดสมองหนูยีน (Amin et al., 1994) ทั้งสามหน่วยย่อย
ถูกโคลนเข้าไปพูดเล่น-1 (Promega, Madison, WI, USA)
และ pGEMHE (ฮี et al., 1992) เวกเตอร์ a1- และ
G2-หน่วยย่อยทั้งสองได้พูดเล่นโคลนใน-1 และ pGEMHE
ระหว่าง HindIII และ XbaI ขณะ B2 ในพูดเล่น-1
โคลนระหว่างสาลี่และ BamHI และใน pGEMHE, B2 ถูก
โคลนที่เว็บไซต์ HindIII การกลายพันธุ์ทั้งหมดได้รับการยืนยันโดย
ยีนลำดับ.
ป่าชนิดและกลายพันธุ์ cDNAs ของ a1- ที่ b2-, g2Lsubunits
ในพูดเล่น-1 ได้รับการเชิงเส้นโดย SSPI และผู้ที่อยู่ใน
pGEMHE ถูกเชิงเส้นโดย NheI กระบวนการเชิงเส้นนี้
ออกจากหางของหลายร้อยคู่ฐานสำหรับเสถียรภาพ RNA.
ปกคลุม CRNAs จากพูดเล่น-1 และเวกเตอร์ pGEMHE
ถูกถ่ายทอดโดยใช้ SP6 หรือ T7 RNA โพลิเมอร์ (Ambion,
ออสติน, TX, USA) ตามลำดับโดยใช้ชุด RNeasy มินิ
(Qiagen, วาเลนเซีย, CA, USA) หลังจากการย่อยสลายของ
แม่แบบดีเอ็นเอโดย RNase ฟรี DNase ผม CRNAs เป็น
บริสุทธิ์และระงับใน diethyl pyrocarbonate (DEPC) -
น้ำประปา ผลผลิตสีดำและความสมบูรณ์ถูกตรวจสอบใน
เจล agarose 1%.
การแยกไข่และฉีดสีดำ
หญิง Xenopus laevis (Xenopus I, Ann Arbor MI, USA)
ได้รับการดมยาสลบกับ 0.2% MS-222 และกลีบรังไข่
ถูกผ่าตัดออกและวางไว้ใน ไข่Ca2ฟรี
วิธีการแก้ปัญหาริงเกอร์ (OR2) ประกอบด้วย (มิลลิเมตร) 92.5 โซเดียมคลอไรด์, 5
HEPES 2.5 KCl และ 1 MgCl2 (pH 7.5) กลีบถูกตัด
เป็นชิ้นเล็ก ๆ และย่อยด้วย 0.2% คอลลา A (Roche
Diagnostics, อินเดียแนโพลิ IN, USA) ในการแก้ปัญหาดังกล่าวข้างต้นที่
อุณหภูมิห้องกับกวนอย่างต่อเนื่องจนกว่าเซลล์ไข่จะ
ถูกกระจาย (1-2 ชั่วโมง) พบว่าไข่นั้นก็ให้สะอาด
ล้างด้วย ND-96 วิธีการแก้ปัญหาการบ่มประกอบด้วย (มิลลิเมตร)
96 NaCl 5 HEPES 2 KCl 1 MgCl2 1.8 CaCl2 2.5
NaCH3COCO2, 5% ซีรั่มม้า, 0.05 mgml_1 Gentamycin,
และ 10Uml_1 penicillin / streptomycin (pH 7.5) ขั้นตอนที่หก
เซลล์ไข่ได้รับการคัดเลือกและการบ่มที่ 141C.
P87 ดึงแนวนอน (ซัทเทอ Instrument Co. , โนวาโต,
CA, USA) ถูกนำมาใช้เพื่อให้ไมโครจาก borosilicate
แก้ว (ดรัมมอนด์วิทยาศาสตร์ Broomall, PA, USA) สำหรับสีดำ
ฉีด เคล็ดลับ micropipette ถูกตัดด้วย microscissors เพื่อ
B40 มม OD Crna ค้นหา: B: G-หน่วยย่อยที่ถูกผสมใน
1: อัตราส่วน 1: 2 และปรับลด 45 ถึง 100 เท่าด้วย DEPC รับการรักษา
น้ำ ไม่มีการลดสัดส่วนที่ถูกจ้างสำหรับการแสดงออกสูง
ทดลอง Crna ถูกฉีดเข้าไปในเซลล์ไข่ที่มี
ระบบ microinjection Nanoject (ดรัมมอนด์วิทยาศาสตร์ Broomall,
PA, USA) ปริมาณของ microinjection เข้าไปในแต่ละ
เซลล์แปรผัน 27-84 NL เพื่อให้ช่วงของ
ระดับการแสดงออก โดยปกติแล้วทั้งหมดของ NG Crna 0.1-1 ถูก
ฉีดเข้าไปในไข่แต่ละบุคคล.
บันทึกจากการพัฒนาของไข่
ใน 1-3 วันหลังจากการฉีดสีดำ, เซลล์ไข่ถูกวางไว้ใน
ห้องปริมาณขนาดเล็ก (o100 ml) 300 มมตาข่ายไนลอน
R AR A2R
R * * * * * * * * AR A2R *
KR KR
KR * * * * * * * * KR
L Lc Lc2
สนับสนุน ไข่ถูก perfused อย่างต่อเนื่องในอัตราที่

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ในสถานการณ์สมมตินี้ น่าจะเป็นของ ช่องเปิดจากการ nonliganded ( R ) , โมโน liganded ( AR ) และ ดิ liganded( a2r ) รัฐเป็น 9.9_10_6 0.007 , และ 0.84 ตามลำดับสิ่งนี้หมายถึงเป็นส่วนใหญ่ที่ครอบงำของนอกจากนั้น ในการขาดงานของกล้ามเนื้อลายใน R , รัฐ ชีพจรของ GABA ใน synaptic ก็ขับรถผ่าตัวรับผ่านรัฐ AR และ a2r เพื่อเปิด a2r * รัฐ สำหรับเหตุผลนี้ ส่วนใหญ่ของจลนพลศาสตร์ ( เราด้วย ) มีโดยทั่วไป ( และปลอดภัย ) เว้นช่องว่างของ unliganded และโมโน liganded สหรัฐอเมริกา ในตอนท้ายของบทความที่เราเสนอนี้กระตุ้นกลไก เราเห็นด้วยว่าในขณะที่การเปิดใช้งานปกติ สามารถอธิบายได้ด้วยนี้อย่างเพียงพอsubmechanism โมเดลที่ครอบคลุมมากขึ้นอาจจะต้องบัญชีสำหรับการกระทำของกาบา เลือกรับ modulators ( Chang & ไวส์ , 1999 )คุณลักษณะเด่นของกลไกเดิมชนิดนี้เสนอเมื่อ 50 ปีที่แล้ว ( del Castillo & Katz , 1957 ) คือมิตต์ รอมนีย์ affinity สูงสำหรับสหรัฐอเมริกาเปิด ( * , AR * และa2r * ) เมื่อเทียบกับรัฐปิด ( อาร์อาร์ และ a2r ) ในของเราโดยเฉพาะกรณี ( a1b2g2 gabaa receptors ) , ความสัมพันธ์ของรัฐปิด GABA เป็น e650 พับน้อยกว่า 4% ของรัฐเปิด ( Chang & ไวส์ , 1999 ) ตามเสนอกลไกการกระตุ้น ( Chang & ไวส์ , 1999 ) เราใช้เหตุผลที่ dzp สามารถปรับเปลี่ยนความไวของตัวรับ โดยขยับสมดุลระหว่าง R และ R * ที่ค่อนข้างมาก เช่นผู้รับอยู่ในสถานะเปิด unliganded . เป็นมากกว่าตัวรับมี affinity สูงเปิดของรัฐ ไวโดยการกระตุ้น GABA จะเพิ่มขึ้น ที่นี่เราการแสดงนี้ย่อมเป็นสิ่งที่เกิดขึ้นได้ และแนวคิดนี้สามารถบัญชีสำหรับการกระทำของ dzp บน gabaa receptor มันก็มีความคิดเข้าถึงง่ายของการควบคุมอัลโลส ; เพียงให้ อ่อนแอ agonism ในเว็บไซต์ที่แตกต่างจากที่ของเวลา .วิธีการเว็บไซต์ของการถอดความและกำกับเว้นแต่ระบุไว้เป็นอย่างอื่น ทุก gabaa ตัวรับเฮอร์บาไลฟ์ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้หนู A1 , B2 และ G2 . หนู A1 , B2 , g2lsubunitsที่ได้รับโดยปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสจากสมองหนู cDNA ห้องสมุด ( อามิน et al . , 1994 ) 3 หน่วยถูกโคลนเข้าไปใน palter-1 ( promega เมดิสัน , WI , ประเทศสหรัฐอเมริกาและ pgemhe ( ไลแมน et al . , 1992 ) เวกเตอร์ A1 - และG2 หน่วยย่อยของทั้งคู่ใน palter-1 pgemhe โคลนและและระหว่างสายพันธุ์ xbai ส่วนใน palter-1 B2 คือโคลนและระหว่างสาลี่ BamHI และ pgemhe , B2 คือ- ตำแหน่งที่เว็บไซต์ ทั้งหมดได้รับการยืนยันโดยการกลายพันธุ์การจัดลำดับดีเอ็นเอ .ของ และกลายพันธุ์ cdnas ของ A1 , B2 , g2lsubunitsในช่วง palter-1 คือ ไอพีสตาร์ และผู้โดยpgemhe โดยมีช่วง nhei . กระบวนการเชิงเส้นนี้ใบหางคู่ร้อยฐานหลายเสถียรภาพ RNAปกคลุม crnas จาก palter-1 pgemhe และเวกเตอร์ถูกถ่ายทอดด้วย sp6 หรืออาร์เอ็นเอพอลิเมอเรส ( ambion * * 3 ,TX Austin , สหรัฐอเมริกา ) ตามลำดับ การใช้ rneasy ชุดมินิ( เพิ่ม , Valencia , CA , USA ) หลังจากการสลายตัวของดีเอ็นเอแม่แบบโดยเลสฟรีตรวจหา ADNase ผม crnas คือบริสุทธิ์และแขวนลอยในได pyrocarbonate ( depc )การรักษาน้ำ การ crna ผลผลิตและความสมบูรณ์เหมาะสมกับเจล ( 1 )การแยกและการฉีด crna โอโอไซต์หญิง ( Xenopus Xenopus laevis , Ann Arbor มี ประเทศสหรัฐอเมริกาถูกวางยาสลบด้วย ms-222 0.2% และแฉกรังไข่ถูกเอาออก surgically และวางไว้ในแคลเซียมไข่ - ฟรีเสียงของโซลูชั่น ( or2 ) ประกอบด้วย ( มม. ) 92.5 เกลือ , 5ฮีเปส , 2.5 KCl และ 1 ชุด ( pH 7.5 ) มีถูกตัดเป็นชิ้นเล็ก ๆ และตัดด้วย 0.2 % คอลลาเจน ( โรชการวินิจฉัย , Indianapolis , สหรัฐอเมริกา ) ในการแก้ปัญหาข้างต้นที่อุณหภูมิห้องกวนจนไข่อย่างต่อเนื่องถูกกระจาย ( 1 – 2 H ) ร่วมกับแล้วอย่างละเอียดล้างด้วยสารละลายที่ประกอบด้วย nd-96 บ่ม ( mm )96 5 ฮีเปส 2 NaCl KCl 1 ชุด , 1.8 CaCl2 2.5nach3coco2 , 5% ม้า mgml_1 เจนตาไมซินเซรั่ม , 0.05 ,และ 10uml_1 เพนนิซิลลิน / สเตรปโตมัยซิน ( pH 7.5 ) VI เวทีเซลล์ที่บ่มที่ 141c .เป็น p87 แนวนอนหัว ( ซัตเตอร์เครื่องมือ Co . , newbie ,CA , USA ) ถูกใช้เพื่อให้ micropipettes จาก borosilicateแก้ว ( ดรัมมอนด์ทางวิทยาศาสตร์ broomall , PA , USA ) สำหรับ crnaการฉีด ไมโครปิเปตที่ถูกตัดด้วย microscissors กับเคล็ดลับขาด mm OD . การ crna สำหรับ : B : g-subunits นำมาผสมใน1 : 1 : 1 และอัตราส่วนเจือจาง 45 - 100 พับกับ depc ปฏิบัติน้ำ ไม่เจือจางเป็นเครื่องมือในการแสดงออกสูงการทดลอง การ crna ถูกฉีดเข้าไปในไข่ด้วยระบบไมโครอินเจคชัน nanoject ( broomall ดรัมมอนด์ทางวิทยาศาสตร์ ,PA , USA ) ระดับเสียงของจังหวัดสุพรรณบุรี ในแต่ละไข่ที่หลากหลายจาก 27 84 เหมาะที่จะให้ช่วงของระดับการแสดงออก โดยทั่วไป , รวม 0.1 – 1 นาโน crna คือฉีดเข้าไปในไข่แต่ละบุคคลบันทึกจากไข่ที่ 1 - 3 วัน หลังฉีด crna ไข่ , ถูกวางไว้ในห้องเสียงเล็ก ( o100 มิลลิลิตรด้วยตาข่ายไนล่อน 300 มม.a2r r arr * * * a2r ARKR เคอาร์KR * KR *ผม lc2 LCสนับสนุน ส่วนไข่ที่หนูเป็นอย่างต่อเนื่อง