HistoryThe oxidative-fermentative (

History

The oxidative-fermentative (OF) test was developed by Hugh and Leifson and outlined in their 1953 paper (4). Prior to this time microbiologists “had observed that some bacteria produced acid from carbohydrates only under aerobic conditions and others produced acid both under aerobic and anaerobic conditions” (4). Production of acid from the metabolism of carbohydrates in aerobic and anaerobic metabolism was at this time defined as fermentation. Hugh and Leifson were the first to refer to the production of acid from carbohydrates under aerobic conditions only, as oxidative (4). It was noted that the amount of acid produced by bacteria using carbohydrates under aerobic conditions was less than the amount of acid produced during fermentative metabolism.

Hugh and Leifson developed OF media to differentiate between these two populations of bacteria (4). The original OF medium contained glucose as the carbohydrate source. The medium was made by increasing the amount of glucose above that found in medium used to detect fermentation and by decreasing the amount of peptone. This medium therefore enhanced the acid production even during oxidative metabolism and decreased the amount of alkaline product produced by the metabolism of peptone. The medium allowed researchers to, for the first time, easily distinguish between gram-negative bacteria that metabolize glucose oxidatively or fermentatively. These characteristics then became important in the identification and taxonomy of gram-negative bacteria (4).

Prior to the work of Hugh and Liefson, taxonomists “paid little attention to the type of carbohydrate breakdown" (3). Cowan and Steele in their 1965 Manual of the Identification of Medical Bacteria state that, “this test is one of the most important in the identification of aerobic bacteria. Most genera are composed of bacteria that either oxidize or ferment glucose: when a genus contains some species that attack glucose by oxidation and others by fermentation, there would seem to be reason to reconsider the taxonomy of the genus” (3).

Purpose

The oxidative-fermentative test is used to determine if gram-negative bacteria metabolize carbohydrates oxidatively, by fermentation, or are nonsacchrolytic and therefore have no ability to use the carbohydrate in the media.

Theory

The oxidative-fermentative test determines if certain gram-negative rods metabolize glucose by fermentation or aerobic respiration (oxidatively) (6, 8). During the anaerobic process of fermentation, pyruvate is converted to a variety of mixed acids depending on the type of fermentation. The high concentration of acid produced during fermentation will turn the bromthymol blue indicator in OF media from green to yellow in the presence or absence of oxygen (6,8).

Certain nonfermenting gram-negative bacteria metabolize glucose using aerobic respiration and therefore only produce a small amount of weak acids during the Krebs cycle and Entner Doudoroff (glycolysis) (8). The increased concentration of glucose in the medium enhances the production of these weak acids to a level that can be detected by bromthymol blue indicator. To further enhance detection of these weak acids, this medium contains a reduced concentration of peptones. This reduces the production of amines from the metabolism of amino acids, therefore reducing the neutralizing effect of these products (8). Dipotassium phosphate buffer is added to further promote acid detection (6, 8). Bacteria giving this reaction in OF media are oxidative.

RECIPE

Hugh and Leifson’s OF basal medium (6, 8)

Peptone (tryptone) 2.0 g

Sodium chloride 5.0 g

Glucose (or other carbohydrate)a 10.0 g

Bromthymol blue 0.03 g

Agar 3.0 g

Dipotassium phosphate 0.30 g

Bring to 1 liter with distilled water. The pH should be adjusted to 7.1 prior to autoclaving (7).

After the medium is autoclaved at 121°C for 15 minutes, a filter sterilized solution of 10% solution of carbohydrate (6, 8) is aseptically added to the medium to a final concentration of 1%. The sterile medium containing the carbohydrate is aliquoted aseptically into sterile test tubes and cooled unslanted as stabs (5). Some procedures call for the addition of 10 g/liter of carbohydrate to the medium prior to sterilization. The medium is then dissolved by heating to a boil on a hot plate or by steaming for 20 minutes prior to aliquoting into test tubes. The tubed medium is then steamed for 20 minutes in place of autoclaving to prevent breaking down of the carbohydrate (7).

OF basal medium is commercially available in a premixed form from biological supply companies. The carbohydrate source is not included and must be added as stated above.

PROTOCOL

I. Oxidative-fermentative test using OF media with glucose

A. Inoculation of media

Two tubes of oxidative-fermentative medium are inoculated by stabbing “half way to the bottom” (8) or ¼-inch from the bottom (6) with the test organism. Overlay one of the two tubes with 1 cm of mineral oil (8) (Fig. 1, 2, 3). This overlay prevents the diffusion of oxygen into the medium and creates an anaerobic condition in the tube.

B. Incubation conditions

Incubation at 35°C for 48 hours is recommended for most gram-negative rods (5, 6). Slow growing bacteria may take 3 to 4 days before results can be observed (6).

C. Interpretation of results

1. Fermentative results

Bacteria that can ferment glucose give a fermentative result as indicated by acid production in both the open (aerobic) and oil covered (anaerobic) tube. The acid produced (pH 6.0) changes the pH indicator, bromthymol blue, from green to yellow. The semisolid consistency of the medium also allows for detection of motility. Note hazy growth away from the stab line (Fig. 1) (8).



FIG. 1. Oxidative-fermentative test inoculated with Escherichia coli. Acid production in both the open and oil-covered tubes indicates a fermentative result. Hazy growth throughout is positive for motility.

See Atlas images for other fermentative results

2. Oxidative results

Nonfermenting bacteria that metabolize glucose via oxidative metabolism give an oxidative result. This result is indicated by a small amount of acid production in the open tube. The acid produced (pH 6.0) changes the pH indicator, bromthymol blue, from green to yellow (6, 8). After a 24-hour incubation a change in pH is observed at the surface of the open tube where growth in the presence of oxygen is observed (2) (Fig. 2a). With prolonged incubation (more than 48 hours), the reduced concentration of agar in the medium allows for the eventual diffusion of the weak acid throughout the whole tube (Fig. 2c). No color change or reaction occurs in the oil-covered tube.


FIG. 2. Oxidative-fermentative test inoculated with Pseudomonas aeruginosa. Acid production in the open tube and not the oil-covered tube indicates an oxidative result. (a) P. aeruginosa incubated for 24 hours. Note pH change in the top of the open tube only. (b) P. aeruginosa incubated for 48 hours. Note the diffusion of the acid down the tube. (c) P. aeruginosa incubated for 5 days. Note the diffusion of the acid throughout the tube. The result is best if read within 24 to 48 hours.

See Atlas images of oxidative results

3. Negative results

Nonsacchrolytic bacteria give a negative OF result. The negative result is indicated by no color change in the oil-covered tube and in some cases an increase in pH (pH 7.6) changing the bromthymol blue from green to blue (6, 8) in the top of the open tube. The increase in pH is due to amine production by bacteria that break down the peptone (protein) in the medium (1, 5). Other bacteria give a negative result indicated by no growth or color change in the medium (5, 6, 8) (Fig. 3).



FIG. 3. Oxidative-fermentative test inoculated with Alcaligenes faecalis. No color change in the oil-covered tube and color change to alkaline in the open tube indicates a negative result. A. faecalis cannot use glucose fermentatively or oxidatively. The blue at the top of the open tube is due to amine production resulting from the metabolism of protein in the media.

See Atlas images for other negative results

II. The oxidative-fermentative test using carbohydrates other than glucose

Nonfermenting gram-negative rods that have been shown to give an oxidative result in an OF glucose test can be further tested for their ability to metabolize other carbohydrates oxidatively. The glucose is replaced by maltose, lactose, mannitol, or sucrose in the medium and only one tube per carbohydrate is inoculated. A heavy inoculum should be used, as many of these nonfermenters are slow growing (6). As the result being detected is based on aerobic respiration no mineral oil or agar layer is used. A positive result is indicated by an acid production and a change in pH in the top of the tube after 24 hours. Some slow growing nonfermenters may take several days to produce enough acid to be detected by the bromthymol blue (6, 8).

SAFETY

The ASM advocates that students must successfully demonstrate the ability to explain and practice safe laboratory techniques. For more information, read the laboratory safety section of the ASM Curriculum Recommendations: Introductory Course in Microbiology and the Guidelines for Biosafety in Teaching Laboratories.

COMMENTS AND TIPS

1. Results of the OF test should be recorded as fermentative (F), oxidative (O), or negative (-). There is no positive (+) result designation. Negative indicates no fermentative or oxidative metabolism of the carbohydrate in the media.

2. If screw cap tubes are used, do not close them too tightly.

3. Use uninoculated controls with and without oi

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ประวัติการ oxidative-fermentative (ของ) ทดสอบโดยฮิวจ์และ Leifson และเค้าร่างในกระดาษของตน 1953 (4) ก่อนหน้านี้ microbiologists "ได้พบว่า แบคทีเรียบางผลิตกรดจากคาร์โบไฮเดรตสภาวะแอโรบิก และอื่น ๆ ผลิตกรดทั้งสองสภาวะออกซิเจน และไม่ใช้" (4) ผลิตของกรดจากเมแทบอลิซึมของคาร์โบไฮเดรตในการเผาผลาญออกซิเจน และไม่ใช้เวลานี้กำหนดเป็นหมักได้ ฮิวจ์และ Leifson แรกที่อ้างอิงถึงการผลิตของกรดจากคาร์โบไฮเดรตภายใต้เงื่อนไขแอโรบิกเท่านั้น เป็น oxidative (4) มันถูกตั้งข้อสังเกตว่า จำนวนกรดที่ผลิต โดยแบคทีเรียที่ใช้คาร์โบไฮเดรตภายใต้เงื่อนไขที่เต้นแอโรบิกมีน้อยกว่าจำนวนกรดที่ผลิตในระหว่างการเผาผลาญ fermentative ฮิวจ์และ Leifson พัฒนาสื่อเพื่อแยกความแตกต่างระหว่างประชากรเหล่านี้สองของแบคทีเรีย (4) ต้นฉบับของน้ำตาลกลูโคสที่มีอยู่กลางเป็นแหล่งคาร์โบไฮเดรต ทำสื่อ โดยเพิ่มจำนวนกลูโคสสูงกว่าที่พบในสื่อที่ใช้ในการหมักการตรวจสอบ และลดจำนวน peptone สื่อนี้จึงเพิ่มการผลิตกรดแม้ระหว่าง oxidative เผาผลาญ และลดจำนวนผลิตภัณฑ์ที่ผลิต โดยเผาผลาญ peptone ด่าง สื่อที่อนุญาตให้นักวิจัยไป ครั้งแรก ได้แยกความแตกต่างระหว่างแบคทีเรียแบคทีเรียแกรมลบที่ metabolize กลูโคส oxidatively หรือ fermentatively ลักษณะเหล่านี้แล้วเป็นสิ่งสำคัญในการระบุและจำแนกประเภทของแบคทีเรียแบคทีเรียแกรมลบ (4)ก่อนการทำงานของฮิวจ์และ Liefson, taxonomists "จ่ายน้อยสนใจประเภทของคาร์โบไฮเดรตแบ่ง" (3) แวนส์ และรัฐ Steele ในคู่มือของ 1965 รหัสของแพทย์แบคทีเรียที่, "การทดสอบนี้เป็นหนึ่งในสิ่งสำคัญที่สุดในรหัสของแบคทีเรียแอโรบิก สกุลส่วนใหญ่จะประกอบด้วยแบคทีเรียที่ออกซิไดซ์ หรือหมักกลูโคส: เมื่อมีสกุลประกอบด้วยบางชนิดที่โจมตีกลูโคสออกซิเดชันและอื่น ๆ โดยหมัก จะดูเหมือน จะเหตุผล reconsider การจำแนกประเภทของตระกูลนี้ " (3)วัตถุประสงค์ ทดสอบ oxidative fermentative เป็นใช้เพื่อกำหนดแบคทีเรียแบคทีเรียแกรมลบ metabolize คาร์โบไฮเดรต โดยหมัก oxidatively หรือ nonsacchrolytic และจะดังนั้น มีความสามารถในการใช้คาร์โบไฮเดรตที่สื่อไม่ ทฤษฎีกำหนดทดสอบ oxidative fermentative ถ้าก้านเฉพาะแบคทีเรียแกรมลบ metabolize กลูโคส โดยหมักหรือหายใจเต้นแอโรบิก (oxidatively) (6, 8) ในระหว่างกระบวนการไม่ใช้ของหมักดอง pyruvate จะถูกแปลงไปเป็นกรดผสมตามชนิดของหมักดอง ความเข้มข้นสูงของกรดที่ผลิตในระหว่างการหมักจะเปลี่ยนตัวบ่งชี้ bromthymol สีน้ำเงินในสื่อจากสีเขียวกับสีเหลืองในสถานะการขาดงานของออกซิเจน (6,8) แบคทีเรียแบคทีเรียแกรมลบบาง nonfermenting metabolize กลูโคสใช้หายใจเต้นแอโรบิก และดังนั้น เฉพาะผลิตจำนวนกรดอ่อนในระหว่างวัฏจักรเครบส์และ Entner Doudoroff (glycolysis) (8) เพิ่มความเข้มข้นของกลูโคสในการช่วยเพิ่มการผลิตของกรดอ่อนเหล่านี้ให้เป็นระดับที่สามารถตรวจพบ โดยตัวบ่งชี้ bromthymol สีฟ้า เพื่อการตรวจกรดเหล่านี้อ่อนแอ สื่อประเภทนี้ประกอบด้วยความเข้มข้นที่ลดลงของ peptones นี้ลดการผลิตของ amines จากเผาผลาญกรดอะมิโน ลดผล neutralizing ของผลิตภัณฑ์ (8) ดังนั้น Dipotassium ฟอสเฟตบัฟเฟอร์เพิ่มเติม ส่งเสริมตรวจกรด (6, 8) แบคทีเรียที่ทำให้ปฏิกิริยานี้ในสื่อมี oxidativeสูตรฮิวจ์และของ Leifson ของโรคปานกลาง (6, 8) Peptone (tryptone) 2.0 gโซเดียมคลอไรด์ 5.0 gกลูโคส (หรือคาร์โบไฮเดรตอื่น) 10.0 gBromthymol บลู 0.03 g Agar 3.0 gDipotassium ฟอสเฟต 0.30 gนำไป 1 ลิตรด้วยน้ำกลั่น ควรจะปรับ pH 7.1 ก่อน autoclaving (7) หลังจากสื่อ autoclaved ที่ 121° C 15 นาที กรอง sterilized โซลูชันของ 10% ของคาร์โบไฮเดรต (6, 8) จะถูกเพิ่ม aseptically เพื่อสื่อถึงความเข้มข้นสุดท้าย 1% สื่อกอซประกอบด้วยคาร์โบไฮเดรตเป็น aliquoted aseptically ลงในหลอดทดสอบที่ผ่านการฆ่าเชื้อ และระบายความร้อนด้วย unslanted เป็น stabs (5) โทรบางขั้นตอนสำหรับการเพิ่ม 10 กรัม/ลิตรของคาร์โบไฮเดรตปานกลางก่อนฆ่าเชื้อ สื่อมีส่วนยุบแล้ว โดยความร้อนไปต้มบนจานร้อน หรือนึ่ง 20 นาทีก่อนที่จะ aliquoting ลงในหลอดทดสอบ สื่อ tubed เป็นแล้วนึ่ง 20 นาทีแทน autoclaving ให้แบ่งของคาร์โบไฮเดรต (7) ของโรคปานกลางได้ในเชิงพาณิชย์ในรูปแบบ premixed จากบริษัทจัดหาวัสดุชีวภาพ แหล่งคาร์โบไฮเดรตไม่รวม และต้องเพิ่มตามที่ระบุไว้ข้างต้น โพรโทคอล I. ทดสอบปฏิกิริยาออกซิเด fermentative ใช้สื่อกับกลูโคสA. inoculation สื่อ หลอดสองของกลาง oxidative fermentative เป็น inoculated โดยแทง "ครึ่งทางที่ด้านล่าง" (8) หรือ¼นิ้วจากด้านล่าง (6) มีการทดสอบสิ่งมีชีวิต ซ้อนทับหนึ่งของหลอดที่สองมี 1 ซม.ของน้ำมัน (8) (Fig. 1, 2, 3) ซ้อนทับนี้ป้องกันการแพร่ของออกซิเจนเข้าไปในสื่อ และสร้างสภาพไม่ใช้ออกซิเจนในหลอดB. เงื่อนไขคณะทันตแพทยศาสตร์ บ่มที่ 35° C ภายใน 48 ชั่วโมงเหมาะสำหรับแบคทีเรียแกรมลบส่วนใหญ่ก้าน (5, 6) เชื้อแบคทีเรียเจริญเติบโตช้าอาจใช้เวลา 3-4 วันก่อนที่ผลจะสังเกตได้จาก (6) C. การตีความผล 1. ผลลัพธ์ fermentative แบคทีเรียที่สามารถหมักน้ำตาลกลูโคสให้ผลลัพธ์ fermentative ตามที่ระบุ โดยผลิตกรด (แอโรบิก) เปิดและท่อน้ำมันที่ครอบคลุม (ไม่ใช้) กรดที่ผลิต (pH 6.0) เปลี่ยนแปลงตัวบ่งชี้ค่า pH สีฟ้า สีเขียวกับสีเหลืองจาก bromthymol ความสอดคล้อง semisolid กลางยังได้ตรวจ motility หมายเหตุมัวเติบโตจากรายการแทง (Fig. 1) (8)FIG. 1 ทดสอบปฏิกิริยาออกซิเด fermentative inoculated ด้วย Escherichia coli กรดผลิตทั้งน้ำมันครอบคลุม และเปิดหลอดแสดงผล fermentative เติบโตมัวตลอดเป็นค่าบวกสำหรับ motility ดูภาพอื่น ๆ ผลลัพธ์ fermentative Atlas 2. oxidative ผลลัพธ์ แบคทีเรีย nonfermenting ที่ metabolize ผ่าน oxidative เผาผลาญกลูโคสให้ผลลัพธ์การ oxidative ผลลัพธ์นี้จะแสดงจำนวนผลิตกรดในท่อเปิดขนาดเล็ก กรดที่ผลิต (pH 6.0) เปลี่ยนแปลงตัวบ่งชี้ค่า pH สีฟ้า สีเขียวกับสีเหลือง (6, 8) จาก bromthymol หลังจากบ่ม 24 ชั่วโมง การเปลี่ยนแปลงค่า pH จะสังเกตที่พื้นผิวของท่อเปิดที่เติบโตในต่อหน้าของออกซิเจนจะสังเกต (2) (Fig. 2a) ด้วยการบ่มเป็นเวลานาน (มากกว่า 48 ชั่วโมง), ลดความเข้มข้นของ agar ในการช่วยให้การแพร่ในของกรดอ่อนตลอดทั้งท่อ (Fig. 2 c) ไม่มีสีเปลี่ยนแปลงหรือปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นในท่อน้ำมันครอบคลุม FIG. 2 ทดสอบปฏิกิริยาออกซิเด fermentative inoculated มี Pseudomonas aeruginosa ผลิตกรดในท่อเปิดและไม่รวมน้ำมันท่อบ่งชี้ผลการ oxidative (ก) P. aeruginosa incubated 24 ชั่วโมง หมายเหตุเปลี่ยนแปลงค่า pH ด้านบนของท่อเปิดเท่านั้น (ข) P. aeruginosa incubated ภายใน 48 ชั่วโมง หมายเหตุแพร่ของกรดลงท่อ (c) P. aeruginosa incubated 5 วัน หมายเหตุแพร่ของกรดตลอดท่อ ผลจะดีที่สุดถ้าอ่านภายใน 24-48 ชั่วโมงดูรูป Atlas oxidative ผล 3. ลบผลลัพธ์ Nonsacchrolytic แบคทีเรียให้เป็นค่าลบของผล ผลลบแสดง โดยไม่เปลี่ยนสีในหลอดน้ำมันครอบคลุม และการเพิ่มขึ้นของค่า pH (pH 7.6) ในบางกรณีการเปลี่ยน bromthymol สีฟ้าจากสีเขียวสีน้ำเงิน (6, 8) ด้านบนของท่อเปิด เพิ่มค่า pH ได้เนื่องจาก amine ผลิตโดยแบคทีเรียที่ทำลายลง peptone (โปรตีน) กลาง (1, 5) แบคทีเรียอื่น ๆ ให้ผลลัพธ์เป็นค่าลบบ่งชี้ โดยเปลี่ยนแปลงเจริญเติบโตหรือสีกลาง (5, 6, 8) (Fig. 3)FIG. 3 ทดสอบปฏิกิริยาออกซิเด fermentative inoculated กับ Alcaligenes faecalis ไม่เปลี่ยนสีในน้ำมันครอบคลุมหลอดและสีเปลี่ยนแปลงด่างในหลอดเปิดแสดงผลลัพธ์เป็นค่าลบ A. faecalis ไม่สามารถใช้กลูโคสได้ fermentatively หรือ oxidatively สีฟ้าที่ด้านบนของท่อเปิดเนื่องจากผลิต amine ที่เกิดจากเมแทบอลิซึมของโปรตีนในสื่อได้ ดูรูป Atlas สำหรับผลเชิงลบอื่น ๆII. การทดสอบ oxidative fermentative ใช้คาร์โบไฮเดรตนอกจากน้ำตาลกลูโคส ก้านของแบคทีเรียแกรมลบ nonfermenting ที่ได้รับการแสดงเพื่อให้ผลลัพธ์การ oxidative ในการทดสอบน้ำตาลกลูโคสของ สามารถจะทดสอบสำหรับความสามารถในการ metabolize คาร์โบไฮเดรตอื่น ๆ oxidatively เพิ่มเติม กลูโคสถูกแทนที่ ด้วย maltose ย่อยแลคโตส mannitol หรือซูโครสในสื่อ และ inoculated หลอดเดียวต่อคาร์โบไฮเดรต Inoculum หนักควรใช้ เป็น nonfermenters เหล่านี้มากมาย (6) การเจริญเติบโตช้า เป็นผลถูกตรวจพบจะขึ้นอยู่กับใช้น้ำมันแร่หรือชั้น agar ไม่หายใจเต้นแอโรบิก แสดงผลบวก โดยการผลิตกรดและการเปลี่ยนแปลงในค่า pH ด้านบนของท่อหลังจาก 24 ชั่วโมง บาง nonfermenters เติบโตช้าอาจใช้เวลาหลายวันในการผลิตกรดเพียงพอสามารถตรวจจับสีฟ้า bromthymol (6, 8)ด้านความปลอดภัยเข้มสนับสนุนว่า นักเรียนต้องสำเร็จแสดงให้เห็นถึงความสามารถในการอธิบาย และฝึกเทคนิคห้องปฏิบัติการปลอดภัย สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม อ่านส่วนความปลอดภัยห้องปฏิบัติการของคำแนะนำหลักสูตรเข้ม: หลักสูตรภาษาในจุลชีววิทยาและแนวทางการ Biosafety ในห้องปฏิบัติการสอนความคิดเห็นและคำแนะนำ 1. ผลลัพธ์ของการทดสอบของควรจะบันทึกเป็น fermentative (F), oxidative (O), หรือลบ (-) ไม่มีไม่เป็นบวก (+) ทำให้กำหนด ค่าลบบ่งชี้ไม่ fermentative หรือ oxidative เผาผลาญคาร์โบไฮเดรตในสื่อ 2. ถ้าใช้หลอดฝาสกรู ไม่ปิดแน่นเกินไป 3. ใช้ควบคุม uninoculated มี และไม่ มีอ้อย

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ประวัติ

ออกซิเดชันวิศวกรรมเคมี ( ของ ) แบบทดสอบพัฒนาโดยฮิวจ์ และ leifson และอธิบายในกระดาษ 1953 ( 4 ) ถึงเวลานี้ microbiologists " มีข้อสังเกตว่า แบคทีเรียบางชนิดผลิตกรดจากคาร์โบไฮเดรตเพียงภายใต้สภาวะแอโรบิกและอื่น ๆผลิตกรดทั้งแอโรบิค และ anaerobic ภายใต้เงื่อนไข " ( 4 )การผลิตกรดจากการเผาผลาญของคาร์โบไฮเดรตในแอโรบิค และ anaerobic การเผาผลาญอยู่ในเวลานี้ เช่นการหมัก ฮิวจ์ และ leifson เป็นครั้งแรกเพื่อดูการผลิตของกรดจากคาร์โบไฮเดรตภายใต้สภาวะแอโรบิกเท่านั้น เป็นกรด ( 4 )มันเป็นข้อสังเกตว่า ปริมาณของกรดที่ผลิตโดยแบคทีเรียที่ใช้คาร์โบไฮเดรตภายใต้สภาวะแอโรบิก น้อยกว่าปริมาณของกรดที่ผลิตในระหว่างวิศวกรรมเคมี การเผาผลาญ

leifson ฮิวจ์ และพัฒนาสื่อเพื่อแยกความแตกต่างระหว่างสองประชากรของแบคทีเรีย ( 4 ) ต้นฉบับของ medium ซึ่งประกอบด้วยกลูโคสเป็นแหล่งคาร์โบไฮเดรตสื่อทำโดยการเพิ่มปริมาณของกลูโคสสูงกว่าที่พบในสื่อที่ใช้ในการตรวจหาเชื้อ และลดปริมาณของเปปโตน . สื่อจึงเพิ่มการผลิตกรดในปฏิกิริยาการเผาผลาญและลดจำนวนของผลิตภัณฑ์ด่างที่ผลิตโดยการเผาผลาญของเปปโตน . กลางอนุญาตให้นักวิจัย เป็นครั้งแรกสามารถแยกแยะความแตกต่างระหว่างแบคทีเรียแกรมลบที่เผาผลาญกลูโคส oxidatively หรือ fermentatively . ลักษณะเหล่านี้ก็กลายเป็นที่สำคัญในการจำแนกและอนุกรมวิธานของแบคทีเรียแกรมลบ ( 4 ) .

ก่อนการทำงานของฮิวจ์ และ liefson taxonomists , " ให้ความสนใจน้อยกับชนิดของการสลายคาร์โบไฮเดรต " ( 3 )แวนส์และ Steele ใน 1965 คู่มือการจำแนกแบคทีเรียทางการแพทย์ระบุว่า " การทดสอบนี้เป็นหนึ่งในสิ่งที่สำคัญที่สุดในตัวของแอโรบิคแบคทีเรีย สกุลส่วนใหญ่จะประกอบด้วยแบคทีเรียที่ออกซิไดซ์หรือหมักกลูโคส เมื่อพืชมีบางชนิดที่โจมตีกลูโคสออกซิเดชัน และผู้อื่น โดยการหมักมันดูเหมือนจะมีเหตุผลที่จะพิจารณาอนุกรมวิธานของสกุล " ( 3 ) .

จุดประสงค์

ออกซิเดชันวิศวกรรมเคมีการทดสอบใช้เพื่อตรวจสอบว่าแบคทีเรียแกรมลบเผาผลาญคาร์โบไฮเดรต oxidatively โดยการหมัก หรือ nonsacchrolytic และดังนั้นจึงมีความสามารถในการใช้คาร์โบไฮเดรต ในสื่อ



ทฤษฎีการทดสอบปฏิกิริยาบางแท่งแกรมลบ วิศวกรรมเคมี กําหนดว่า เผาผลาญกลูโคสโดยการหมักหรือการหายใจแบบใช้ออกซิเจน ( oxidatively ) ( 6 , 8 ) ในระหว่างกระบวนการบำบัดของการหมักไพรูเวทแปลงความหลากหลายของกรดที่ผสมขึ้นอยู่กับประเภทของการหมักความเข้มข้นสูงของกรดที่ผลิตในระหว่างการหมักจะเปลี่ยนเวรตะไลตัวบ่งชี้ในสื่อจากสีเขียวเป็นสีเหลืองในการแสดงตนหรือขาดออกซิเจน ( 6,8 )

บาง nonfermenting แบคทีเรียแกรมลบเผาผลาญกลูโคสโดยใช้การหายใจ และดังนั้นจึง ผลิตเพียงจำนวนเล็ก ๆของกรดอ่อนในวัฏจักรเครปส์ และ entner doudoroff ( ไกลโคลิซิส ) ( 8 )การเพิ่มความเข้มข้นของกลูโคสในอาหารช่วยเพิ่มการผลิตของกรดอ่อนเหล่านี้ให้อยู่ในระดับที่สามารถตรวจพบได้ โดยตัวบ่งชี้ที่เวรตะไล . เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการตรวจหากรดอ่อนเหล่านี้ กลางมี ลดความเข้มข้นของเพปโทน . นี้ช่วยลดการผลิตของเอมีนจากเมแทบอลิซึมของกรดอะมิโนดังนั้นการ neutralizing ผลของผลิตภัณฑ์เหล่านี้ ( 8 ) Dipotassium phosphate buffer จะถูกเพิ่มเพื่อส่งเสริมการตรวจหากรด ( 6 , 8 ) แบคทีเรียให้ปฏิกิริยานี้ในสื่อจะเกิด

สูตร

ฮิวจ์ และ leifson ของ basal medium ( 6 , 8 )

เปปโตน ( ทริพโทน ) 2.0 G

โซเดียมคลอไรด์ 5.0 g

กลูโคส ( หรือคาร์โบไฮเดรตอื่น ๆ ) 10.0 กรัม

บอแรกซ์ 0.03 กรัม


ขนาด 3.0 กรัม
ฟอสเฟต dipotassium 0.30 กรัม

นำ 1 ลิตรด้วยน้ำกลั่น ด่างควรปรับ 7.1 ก่อนอัตราส่วนโฟกัส ( 7 )

หลังจากที่สื่อสังเคราะห์ที่ 121 ° C เป็นเวลา 15 นาที กรองสารละลายฆ่าเชื้อ 10% โซลูชั่นของคาร์โบไฮเดรต ( 6 , 8 ) aseptically เพิ่ม ) ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 1 %การฆ่าเชื้ออาหารที่มีคาร์โบไฮเดรตเป็น aliquoted aseptically ในหลอดทดลองที่เป็นหมันและเย็น unslanted เป็นแทง ( 5 ) บางขั้นตอนเรียกเพิ่ม 10 กรัม / ลิตรของคาร์โบไฮเดรตในอาหารก่อนการฆ่าเชื้อ สื่อ แล้วละลายด้วยความร้อนให้เดือดบนจานร้อน หรือ นึ่งประมาณ 20 นาที ก่อนที่จะ aliquoting ในหลอดทดสอบการ tubed สื่อแล้วนึ่ง 20 นาทีในสถานที่ของอัตราส่วนโฟกัสเพื่อป้องกันการหมดสภาพของคาร์โบไฮเดรต ( 7 )

ของแรกเริ่มเป็นสื่อที่ใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ในรูปแบบผสม จาก บริษัท จัดหาทางชีวภาพ คือแหล่งคาร์โบไฮเดรต ไม่รวม และต้องเพิ่มตามที่ระบุไว้ข้างต้น

)

ผมออกซิวิศวกรรมเคมี ทดสอบการใช้สื่อกับกลูโคส

A

ใส่สื่อิวิศวกรรมเคมี ของกลาง 2 หลอดเป็นเชื้อร้าย " ครึ่งนึงด้านล่าง " ( 8 ) หรือ¼ - นิ้วจากด้านล่าง ( 6 ) แบบทดสอบชีวิต ซ้อนทับอีกสองหลอด 1 ซม. ของน้ำมันแร่ ( 8 ) ( รูปที่ 1 , 2 , 3 ) ข้อมูลนี้จะช่วยป้องกันการแพร่กระจายของออกซิเจนลงในสื่อและสร้างสภาวะไร้ออกซิเจนในหลอด

B

4 เงื่อนไขการบ่มที่ 35 ° C เป็นเวลา 48 ชั่วโมงแนะนำสำหรับแท่งแกรมลบมากที่สุด ( 5 , 6 ) แบคทีเรียที่เติบโตช้า อาจใช้เวลา 3 ถึง 4 วัน ก่อนผลจะสังเกตได้ ( 6 )

C . การแปลผล

1 วิศวกรรมเคมีผล

แบคทีเรียที่สามารถหมักกลูโคสให้วิศวกรรมเคมีผลตามที่ระบุ โดยผลิตกรด ทั้งเปิดและปิด ( แอโรบิก ) น้ำมัน ( ถัง ) หลอด ผลิตกรด ( pH 60 ) การเปลี่ยนแปลง pH indicator , บอแรกซ์ จากสีเขียวเป็นสีเหลือง ความสอดคล้อง semisolid ของตัวกลางยังช่วยให้การตรวจจับการเคลื่อนที่ . หมายเหตุ หมอกเจริญห่างจากแทงเส้น ( รูปที่ 1 ) ( 8 ) .



รูปที่ 1 ทดสอบปฏิกิริยากับวิศวกรรมเคมี เชื้อ Escherichia coli การผลิตกรด ทั้งน้ำมันและท่อเปิดปิดแสดงผลวิศวกรรมเคมี .ภาพการเจริญเติบโตตลอดเป็นบวกสำหรับการเคลื่อนที่ .

ดูแผนที่ภาพเพื่อผลลัพธ์อื่น ๆ

วิศวกรรมเคมี 2

เกิดการเผาผลาญกลูโคส nonfermenting แบคทีเรียที่ผ่านปฏิกิริยาการเผาผลาญให้ส่งผลออกซิเดชัน ผลที่ได้นี้แสดงโดยจำนวนเล็ก ๆของการผลิตกรดในหลอด เปิด ผลิตกรด ( pH 6.0 ) การเปลี่ยนแปลง pH indicator , บอแรกซ์ จากสีเขียวเป็นสีเหลือง ( 68 ) หลังจากให้บริการบ่มเพาะเปลี่ยนพีเอช สังเกตที่ผิวของท่อเปิดที่เติบโตในการปรากฏตัวของออกซิเจน ) ( 2 ) ( รูปที่ 2A ) ด้วยระยะเวลานาน ( มากกว่า 48 ชั่วโมง ) , ลดความเข้มข้นของวุ้นในสื่อที่ช่วยให้สำหรับในที่สุดการแพร่ของกรดอ่อนตลอดทั้งท่อ ( รูปที่ 2 )ไม่มีการเปลี่ยนสี หรือปฏิกิริยาเกิดขึ้นในน้ำมันครอบคลุมหลอด


รูปที่ 2 ออกซิเดชันทดสอบกับวิศวกรรมเคมี เชื้อ Pseudomonas aeruginosa . การผลิตกรดในหลอดเปิดและไม่ครอบคลุมหลอดแสดงผลน้ำมันออกซิเดชัน ( A ) P . aeruginosa บ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมง หมายเหตุด่างในด้านบนของท่อเปิดเท่านั้น ( B ) P . aeruginosa บ่ม 48 ชั่วโมงหมายเหตุ การแพร่ของกรดลงท่อ ( c ) P . aeruginosa บ่มเป็นเวลา 5 วัน หมายเหตุ การแพร่ของกรดตลอดท่อ ผลที่ดีที่สุดคือถ้าอ่านภายใน 24 ถึง 48 ชั่วโมง

เห็น Atlas ภาพของออกซิเดชันผล

3 เชิงลบผล

nonsacchrolytic แบคทีเรียให้ลบของผลผลเป็นลบ แสดงโดย ไม่มีเปลี่ยนสีในน้ำมันครอบหลอด และในบางกรณีมีการเพิ่ม pH ( pH 7.6 ) เปลี่ยนเวรตะไลจากสีเขียวเป็นสีฟ้า ( 6 , 8 ) ในด้านบนของท่อเปิด การเพิ่ม pH เนื่องจากเอมีนผลิตโดยแบคทีเรียที่ทำลายลงเปปโตน ( โปรตีน ) ในกลาง ( 1 , 5 )แบคทีเรียอื่น ๆให้ได้ผลเชิงลบที่ระบุโดยไม่เจริญเติบโตหรือเปลี่ยนสีในกลาง ( 5 , 6 , 8 ) ( รูปที่ 3 ) .



รูปที่ 3 ิวิศวกรรมเคมี ทดสอบใส่ Alcaligenes faecalis . ไม่มีการเปลี่ยนสีในน้ำมันครอบหลอด และเปลี่ยนสีด่างในหลอดเปิดแสดงผลเป็นลบ A . faecalis ไม่สามารถใช้กลูโคส fermentatively หรือ oxidatively .สีฟ้าที่ด้านบนของหลอดเปิดเนื่องจากเอมีนการผลิตที่เกิดจากการเผาผลาญของโปรตีน ในสื่อ

ดูแผนที่ภาพเพื่อผลลัพธ์อื่น ๆลบ

2 ออกซิเดชันวิศวกรรมเคมี ทดสอบการใช้คาร์โบไฮเดรตมากกว่ากลูโคส

nonfermenting แท่งแกรมลบที่ได้รับการแสดงเพื่อให้เกิดผลในการทดสอบกลูโคสสามารถเพิ่มเติม ทดสอบความสามารถในการเผาผลาญคาร์โบไฮเดรตอื่น ๆ oxidatively . กลูโคสจะถูกแทนที่โดย มอลโตส แลคโตส , mannitol หรือซูโครสในกลางและเพียงหนึ่งหลอดต่อคาร์โบไฮเดรต คือ หัวเชื้อ . เป็นเชื้อหนัก ควรใช้อย่างที่หลาย nonfermenters เหล่านี้จะเติบโตช้า ( 6 ) ผลการตรวจสอบจะขึ้นอยู่กับการหายใจไม่มีน้ำมันแร่หรือชั้นวุ้นที่ใช้คือ บวก แสดงโดยการผลิตกรดและการเปลี่ยนแปลง pH ในด้านบนของท่อหลังจาก 24 ชั่วโมง มีการเจริญเติบโตช้า nonfermenters อาจใช้เวลาหลายวันเพื่อผลิตกรดมากพอที่จะตรวจพบโดยเวรตะไล ( 6 , 8 ) .

ตู้

มีเครือข่ายสนับสนุนที่นักเรียนต้องประสบความสำเร็จ แสดงให้เห็นถึงความสามารถในการอธิบายและฝึกเทคนิคห้องปฏิบัติการปลอดภัย สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมอ่านห้องปฏิบัติการความปลอดภัยส่วนของ ASM หลักสูตรแนะนำ : หลักสูตรเบื้องต้นในจุลชีววิทยาและแนวทางความปลอดภัยทางชีวภาพในห้องปฏิบัติการสอน

ความคิดเห็นและเคล็ดลับ

1ผลของการทดสอบจะถูกบันทึกเป็นวิศวกรรมเคมี ( F ) , ออกซิเดชัน ( O ) หรือ ลบ ( - ) ไม่มีบวก ( ) ชื่อผล ไม่ระบุไม่มีวิศวกรรมเคมี หรือเกิดการเผาผลาญของคาร์โบไฮเดรตในสื่อ

2 ถ้าหลอดฝาเกลียวที่ใช้จะไม่ปิดแน่นเกินไป

3 การควบคุมการใช้กับไม่ใช้ .