ResultsHaloferax volcanii cells dev

Results
Haloferax volcanii cells develop into structured colony
biofilms and static liquid biofilms
Planktonic H. volcanii DS2 cells grown in shaking culture
(Figure 1A) readily formed biofilms in typical rich media
types Hv-YPC and Hv-Ca within several experimental
systems that provided a solid plastic or glass substratum.
Colony biofilms [7] developed on the surface of
polycarbonate filters placed on solid media (Figure 1B)
and were cryo-processed and cross-sectioned, exposing
a surface structure containing crevices bounded by
globular structures (Figure 1B). The greatest level of
structural complexity was observed when biofilms were
grown in static liquid (SL-biofilms; Figure 1C). Cultivating
SL-biofilms within chamber slides and on the
surface of borosilicate glass coupons placed in six-well
plates permitted direct staining and optimized imaging
of delicate biofilm structure that was visible macroscopically
(Figure 1C).
We began by examining the development of wild-type
H. volcanii DS2 biofilms in static liquid using CLSM and
the cellular membrane dyes FM 1-43 and CellMask Orange(CMO; Figure 1D–I, Additional file 1: Table S1). Circular
microcolonies formed within 48 h (Figure 1D), which led to
well-defined clusters/aggregates after 5 days (Figure 1E).
SL-biofilms reached maturation after 7 days of incubation
at 42°C having developed into multi-layer towers with
flake-like morphology (Figure 1F,G,H). Large towers
were surrounded by a dense layer of smaller clusters
or microcolonies and were separated by areas with little
or no cell density (Figure 1E–H). Overall structural
integrity was maintained as large clusters surrounded by
smaller microcolonies for several weeks, although a comparison
of orthogonal views of CMO-stained SL-biofilms
showed that after 2 weeks the height of most structures
was diminished and less of the total surface area was
covered with microcolonies (Figure 1I, 2 weeks). Large
clusters/towers, like the example shown in Figure 1F,G,H,
varied in height and width, with a maximum measured
height of 148 μm.
Microcolonies within biofilms formed by a GFP-expressing
Haloferax volcanii strain bind stains targeting polysaccharide,
DNA and amyloid protein
Several H. volcanii strains were engineered to express
GFP to study ECM composition with the goal of reinforcing
and expanding staining experiments conducted by Fröls and
coworkers [38]. Confirmation of GFP expression was first
accessed within colonies formed by two GFP-expression
strains produced in this study. Colonies formed by the parental
H. volcanii H1206 strain (Figure 2A; left panel) did not
autofluoresce with blue excitation (Figure 2A, center panel),
while those formed by the H. volcanii H1206(pJAM1020)
strain based on the previously developed plasmid pJAM1020
(see Additional file 1: Table S2) [59] showed uniform and
high levels of GFP fluorescence (Figure 2A; right panel).
An additional GFP-expressing strain H. volcanii H1206
(pSC409GFP), containing the same red-shifted gfp geneproduced colonies with GFP signals that differed in both
intensity and spatial distribution, resulting in an assortment
of patterns of GFP signal within developed colonies
(Additional file 1: Figure S1). The H1206(pJAM1020)
strain was therefore selected for biofilm compositional
studies to ensure stable GFP expression throughout the
cellular population.
Cellular clusters visible in GFP-expressing biofilms
were colocalized with the signal from a Texas Red conjugate
of the lectin concanavalin A (ConA; Figure 2B)
and with the DNA binding dye 4′,6-diamidino-2-phenylindole
(DAPI; Figure 2C,D,E). ConA is known to
bind a-manopyranosyl and a-glucopyranosyl residues
within glyconjugates of haloarchaeal biofilms [38].
DAPI was selected as an extracellular DNA stain for
our CLSM study because it is known to stain eDNA
preferentially in haloarchaeal biofilms [38]. Fröls and
coworkers [38] used three nucleic acid dyes to distinguish
between extracellular and intracellular DNA
in biofilms formed by H. volcanii and additional
haloarchaeal strains, and showed that: (a) only acridine
orange stained individual live cells, appearing similar
our use of the cell permeable nucleic acid dye SYTO 9
(Additional file 1: Figure S2), (b) the signal from DAPI
appeared nebulous and granular and was colocalized
with microcolonies, (c) simultaneous staining with 7-
hydroxy-9H-1-3-dichloro-9,9-dimenthylacridin-2-one
(DDAO), a nucleic acid dye considered completely impermeable
to cells, led to an essentially identical pattern
of fluorescence signals, and (d) very few non-viable cells
are present within H. volcanii biofilms (even after
30 days of incubation), suggesting that the observed DAPI
signal was not from dead cells. Our CLSM analysis also
showed colocalization of DAPI-stained material with
microcolonies and a lack of signal from individual cells.
Further three-dimensional reconstruction of DAPI-stained
GFP-expressing biofilms revealed that DNA was concentrated
in the basal layer of the biofilm and dispersed
as plume-like structures at the top of larger
towers (Figure 2C,D,E; lower panels).
Larger structures observed in mature biofilms with
transmitted light and through GFP fluorescence were
also colocalized with the signal from Congo red (CR)
and thioflavin T (ThT). These stains are routinely used
as characteristic tests for the presence of a wide variety
of amyloid proteins, including for diagnosis and study
as in pJAM1020 but cloned into the plasmid pTA409,

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ผลลัพธ์Haloferax volcanii เซลล์ที่พัฒนาเป็นโครงสร้างอาณานิคมbiofilms และ biofilms คงเหลวเซลล์ volcanii DS2 H. planktonic ปลูกสั่นวัฒนธรรม(รูปที่ 1A) พร้อมรูป biofilms ในสื่อทั่วไปชนิด Hv YPC และ Hv-Ca ภายในต่าง ๆ ทดลองระบบที่มีฐานพลาสติกหรือแก้วแข็งอาณานิคม biofilms [7] พัฒนาบนพื้นผิวของโพลีคาร์บอเนตกรองวางบนสื่อที่เป็นของแข็ง (รูปที่ 1B)และได้ ดำเนินการ cryo และ cross-sectioned เปิดเผยโครงสร้างผิวประกอบด้วย crevices ที่ล้อมรอบด้วยglobular โครงสร้าง (รูปที่ 1B) ระดับมากที่สุดความซับซ้อนของโครงสร้างถูกตรวจสอบเมื่อถูก biofilmsเติบโตขึ้นในของเหลวคงที่ (SL-biofilms รูปที่ 1 C) เพาะปลูกSL-biofilms ภาย ในหอภาพนิ่ง และคงพื้นผิวของแก้ว borosilicate คูปองไว้ในหกดีแผ่นสามารถย้อมสีโดยตรง และปรับภาพให้เหมาะสมโครงสร้าง biofilm อ่อนที่เห็น macroscopically(รูปที่ 1C)เราเริ่ม ด้วยการตรวจสอบการพัฒนาชนิดของป่าH. volcanii biofilms DS2 ในของเหลวคงที่โดยใช้ CLSM และมือถือเมมเบรนสี FM 1-43 และ CellMask Orange(CMO; รูปที่ 1D – ฉัน ไฟล์เพิ่มเติม 1: S1 ตาราง) แบบวงกลมmicrocolonies ที่เกิดขึ้นภายใน h 48 (รูป 1D), ซึ่งนำไปสู่โดยคลัสเตอร์/ผลหลังจาก 5 วัน (รูปที่ 1E)ถึงพ่อแม่หลังจาก 7 วันบ่ม biofilms SLที่ 42° C มีพัฒนาเป็นอาคารหลายชั้นด้วยสัณฐานวิทยาคล้ายเกล็ด (รูป 1F, G, H) อาคารขนาดใหญ่ถูกล้อมรอบ ด้วยชั้นของคลัสเตอร์มีขนาดเล็กหนาแน่นหรือ microcolonies และถูกคั่น ด้วยพื้นที่น้อยด้วยหรือความหนาแน่นไม่เซลล์ (รูปที่ 1E-H) โครงสร้างโดยรวมมีรักษาความเป็นคลัสเตอร์ขนาดใหญ่ที่ล้อมรอบด้วยmicrocolonies เล็กหลายสัปดาห์ แม้ว่าการเปรียบเทียบมุมมอง orthogonal ของ CMO สี SL-biofilmsพบว่าหลังจาก 2 สัปดาห์ความสูงของโครงสร้างส่วนใหญ่ลดลงและน้อยของพื้นที่ผิวทั้งหมดปกคลุม ด้วย microcolonies (1I รูป 2 สัปดาห์) ขนาดใหญ่คลัสเตอร์/อาคาร เช่นตัวอย่างที่แสดงในรูปที่ 1F, G, Hแตกต่างกันในความสูงและความกว้าง มีวัดได้สูงสุดความสูงของ 148 μmMicrocolonies ภายใน biofilms ก่อตั้งขึ้น โดยมี GFP-แสดงHaloferax volcanii ต้องใช้ผูกคราบ polysaccharide การกำหนดเป้าหมายโปรตีนดีเอ็นเอและแอมีลอยด์สายพันธุ์หลาย H. volcanii ได้ออกแบบทางวิศวกรรมด่วนGFP ศึกษา ECM ประกอบกับเป้าหมายของภาคเอกชนและขยายการทดลองย้อมสี โดย Fröls และเพื่อนร่วมงาน [38] ยืนยัน GFP นิพจน์เป็นครั้งแรกเข้าถึงภายในอาณานิคมที่ก่อตั้ง โดยสองนิพจน์ GFPสายพันธุ์ที่ผลิตในการศึกษานี้ เกิดขึ้น โดยที่ผู้ปกครองอาณานิคมไม่มี volcanii H. H1206 ต้องใช้ (รูปที่ 2A แผงด้านซ้าย)autofluoresce กับในการกระตุ้นสีน้ำเงิน (รูปที่ 2A แผงกลาง),ในขณะที่ก่อตั้งขึ้น โดย H. volcanii H1206(pJAM1020)ต้องใช้ตาม pJAM1020 plasmid พัฒนาก่อนหน้านี้(ดูเพิ่มเติมแฟ้ม 1: S2 ตาราง) [59] แสดงเครื่องแบบ และระดับสูงของ fluorescence GFP (รูปที่ 2A แผงด้านขวา)An additional GFP-expressing strain H. volcanii H1206(pSC409GFP), containing the same red-shifted gfp geneproduced colonies with GFP signals that differed in bothintensity and spatial distribution, resulting in an assortmentof patterns of GFP signal within developed colonies(Additional file 1: Figure S1). The H1206(pJAM1020)strain was therefore selected for biofilm compositionalstudies to ensure stable GFP expression throughout thecellular population.Cellular clusters visible in GFP-expressing biofilmswere colocalized with the signal from a Texas Red conjugateof the lectin concanavalin A (ConA; Figure 2B)and with the DNA binding dye 4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI; Figure 2C,D,E). ConA is known tobind a-manopyranosyl and a-glucopyranosyl residueswithin glyconjugates of haloarchaeal biofilms [38].DAPI was selected as an extracellular DNA stain forour CLSM study because it is known to stain eDNApreferentially in haloarchaeal biofilms [38]. Fröls andcoworkers [38] used three nucleic acid dyes to distinguishbetween extracellular and intracellular DNAin biofilms formed by H. volcanii and additionalhaloarchaeal strains, and showed that: (a) only acridineorange stained individual live cells, appearing similarour use of the cell permeable nucleic acid dye SYTO 9(Additional file 1: Figure S2), (b) the signal from DAPIappeared nebulous and granular and was colocalizedwith microcolonies, (c) simultaneous staining with 7-hydroxy-9H-1-3-dichloro-9,9-dimenthylacridin-2-one(DDAO), a nucleic acid dye considered completely impermeableto cells, led to an essentially identical patternof fluorescence signals, and (d) very few non-viable cellsare present within H. volcanii biofilms (even after30 days of incubation), suggesting that the observed DAPIsignal was not from dead cells. Our CLSM analysis alsoshowed colocalization of DAPI-stained material withmicrocolonies and a lack of signal from individual cells.Further three-dimensional reconstruction of DAPI-stainedGFP-expressing biofilms revealed that DNA was concentratedin the basal layer of the biofilm and dispersedas plume-like structures at the top of largertowers (Figure 2C,D,E; lower panels).Larger structures observed in mature biofilms withtransmitted light and through GFP fluorescence werealso colocalized with the signal from Congo red (CR)and thioflavin T (ThT). These stains are routinely usedas characteristic tests for the presence of a wide varietyof amyloid proteins, including for diagnosis and studyas in pJAM1020 but cloned into the plasmid pTA409,

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ผลการ
Haloferax เซลล์ volcanii พัฒนาเป็นอาณานิคมโครงสร้าง
ไบโอฟิล์มและไบโอฟิล์มของเหลวคง
planktonic H. volcanii เซลล์ DS2 เติบโตในวัฒนธรรมสั่น
(รูปที่ 1A) ที่เกิดขึ้นได้อย่างง่ายดายไบโอฟิล์มในสื่อที่อุดมไปด้วยโดยทั่วไป
ประเภท HV-YPC และ HV-Ca ภายในทดลองหลาย
ระบบที่ให้มั่นคง พลาสติกหรือแก้วชั้นล่าง.
อาณานิคมไบโอฟิล์ม [7] การพัฒนาบนพื้นผิวของ
ฟิลเตอร์โพลีคาร์บอเนตที่วางอยู่บนสื่อที่เป็นของแข็ง (รูปที่ 1B)
และมี Cryo-การประมวลผลและตัดข้ามที่เผยให้เห็น
โครงสร้างของพื้นผิวที่มีรอยแยกล้อมรอบด้วย
โครงสร้างทรงกลม (รูปที่ 1B) ระดับที่ยิ่งใหญ่ที่สุดของ
โครงสร้างที่ซับซ้อนก็สังเกตเห็นเมื่อไบโอฟิล์มได้รับการ
ปลูกในของเหลวคงที่ (SL-ไบโอฟิล์มรูปที่ 1C) ปลูก
SL-ไบโอฟิล์มสไลด์ภายในห้องและบน
พื้นผิวของคูปองแก้ว borosilicate วางไว้ในหกดี
แผ่นได้รับอนุญาตการย้อมสีโดยตรงและเพิ่มประสิทธิภาพการถ่ายภาพ
ของโครงสร้างไบโอฟิล์มที่ละเอียดอ่อนที่มองเห็น macroscopically
(รูปที่ 1C).
เราเริ่มต้นด้วยการตรวจสอบการพัฒนาของป่าชนิด
เอช volcanii ไบโอฟิล์ม DS2 ในของเหลวคงใช้ CLSM และ
สีย้อมเมมเบรนของเซลล์ FM 1-43 และ CellMask สีส้ม (CMO รูปที่ 1D-I, แฟ้มเพิ่มเติม 1: ตาราง S1) Circular
microcolonies เกิดขึ้นภายใน 48 ชั่วโมง (รูปที่ 1D) ซึ่งนำไปสู่การ
ที่ดีที่กำหนดกลุ่ม / มวลรวมหลังวันที่ 5 (รูปที่ 1E).
SL-ไบโอฟิล์มถึงการเจริญเติบโตหลังจากวันที่ 7 ของการบ่ม
ที่อุณหภูมิ 42 ° C มีการพัฒนาเป็นอาคารหลายชั้นที่มี
สัณฐานเหมือนเกล็ด (รูป 1F, G, H) อาคารขนาดใหญ่ที่
ถูกล้อมรอบด้วยชั้นความหนาแน่นของกลุ่มที่มีขนาดเล็ก
หรือ microcolonies และถูกแยกออกจากพื้นที่ที่มีเล็ก ๆ น้อย ๆ
ความหนาแน่นของเซลล์หรือไม่ (รูป 1E-H) โครงสร้างโดยรวม
สมบูรณ์ก็ยังคงเป็นกลุ่มที่มีขนาดใหญ่ล้อมรอบด้วย
microcolonies ขนาดเล็กสำหรับหลายสัปดาห์ถึงแม้ว่าการเปรียบเทียบ
มุมมองมุมฉากของ CMO เปื้อน SL-ไบโอฟิล์ม
แสดงให้เห็นว่าหลังจาก 2 สัปดาห์ความสูงของโครงสร้างส่วนใหญ่
ได้รับการลดลงและน้อยของพื้นที่ผิวทั้งหมดถูก
ปกคลุม กับ microcolonies (รูปที่ 1I, 2 สัปดาห์) ขนาดใหญ่
กลุ่ม / อาคารเช่นตัวอย่างที่แสดงในรูปที่ 1F, G, H,
แตกต่างกันในความสูงและความกว้างสูงสุดกับวัด
ความสูงของ 148 ไมโครเมตร.
Microcolonies ภายในไบโอฟิล์มที่เกิดขึ้นจาก GFP-แสดง
Haloferax volcanii คราบผูกสายพันธุ์การกำหนดเป้าหมาย polysaccharide,
ดีเอ็นเอ และโปรตีน amyloid
หลายสายพันธุ์เอช volcanii ถูกออกแบบมาเพื่อแสดงความ
GFP เพื่อศึกษาองค์ประกอบของ ECM มีเป้าหมายในการเสริม
และขยายการทดลองดำเนินการโดยการย้อมสีFrölsและ
เพื่อนร่วมงาน [38] ยืนยันในการแสดงออก GFP เป็นครั้งแรกที่
เข้าถึงได้ภายในอาณานิคมที่เกิดขึ้นจากสอง GFP แสดงออก
สายพันธุ์ที่เกิดขึ้นในการศึกษาครั้งนี้ อาณานิคมที่เกิดขึ้นจากผู้ปกครอง
เอช ความเครียด volcanii H1206 (รูปที่ 2A; แผงด้านซ้าย) ไม่
autofluoresce กับการกระตุ้นสีฟ้า (รูปที่ 2A, แผงกลาง)
ในขณะที่ผู้ที่สร้างขึ้นโดยเอช volcanii H1206 (pJAM1020)
สายพันธุ์ที่อยู่บนพื้นฐานของการพัฒนาก่อนหน้านี้พลาสมิด pJAM1020
(ดูแฟ้มเพิ่มเติม 1: ตารางที่ S2) [59] แสดงให้เห็นสม่ำเสมอและ
ระดับสูงของการเรืองแสง GFP (รูปที่ 2A. แผงขวา)
เพิ่มเติม GFP-แสดงสายพันธุ์เอช volcanii H1206
(pSC409GFP) ที่มีสีแดงขยับเดียวกันอาณานิคม geneproduced GFP กับสัญญาณ GFP ที่แตกต่างกัน ทั้ง
ความรุนแรงและกระจายผลในการแบ่งประเภท
ของรูปแบบของสัญญาณ GFP ภายในอาณานิคมพัฒนา
(แฟ้มเพิ่มเติม 1: รูปที่ S1) H1206 (pJAM1020)
สายพันธุ์ที่ได้รับการคัดเลือกดังนั้นสำหรับ compositional ไบโอฟิล์ม
การศึกษาเพื่อให้แน่ใจว่าการแสดงออก GFP ตลอด
ประชากรโทรศัพท์มือถือ.
กลุ่ม Cellular มองเห็นได้ในไบโอฟิล์ม GFP-แสดงความ
ถูก colocalized กับสัญญาณจากเท็กซัสคอนจูเกตสีแดง
ของเลคติน concanavalin (Cona; เต็มตัว 2B)
และมีผลผูกพันกับดีเอ็นเอย้อม 4 '6 diamidino-2-phenylindole
(DAPI; รูป 2C, D, E) Cona เป็นที่รู้จักกัน
ผูก-manopyranosyl และสารตกค้าง-glucopyranosyl
ภายใน glyconjugates ของไบโอฟิล์ม haloarchaeal [38].
DAPI ได้รับเลือกเป็นคราบดีเอ็นเอ extracellular สำหรับ
การศึกษา CLSM ของเราเพราะมันเป็นที่รู้จักกันเปื้อน EDNA
ตัวในไบโอฟิล์ม haloarchaeal [38] Frölsและ
เพื่อนร่วมงาน [38] ใช้สามสีย้อมกรดนิวคลีอิกที่จะแยกแยะความแตกต่าง
ระหว่างดีเอ็นเอในเซลล์และนอกเซลล์
ในไบโอฟิล์มที่เกิดขึ้นโดยเอช volcanii และเพิ่มเติม
สายพันธุ์ haloarchaeal และแสดงให้เห็นว่า (ก) เพียง acridine
ส้มย้อมเซลล์สดบุคคลที่ปรากฏคล้าย
การใช้งานของเรา กรดนิวคลีอิกเซลล์ดูดซึมสีย้อม Syto 9
(แฟ้มเพิ่มเติม 1: รูปที่ S2) (ข) สัญญาณจาก DAPI
ปรากฏชัดเจนและเม็ดและถูก colocalized
กับ microcolonies (ค) การย้อมสีพร้อมกันกับ 7-
hydroxy-9H-1-3- dichloro-9,9-dimenthylacridin-2-หนึ่ง
(DDAO), สีย้อมกรดนิวคลีอิกถือว่าผ่านไม่สมบูรณ์
ไปยังเซลล์นำไปสู่รูปแบบที่เหมือนกันเป็นหลัก
ของการส่งสัญญาณการเรืองแสงและ (ง) น้อยมากเซลล์ที่ไม่ทำงาน
ที่มีอยู่ภายในเอช volcanii ไบโอฟิล์ม (แม้หลังจาก
30 วันของการบ่ม) บอกว่าสังเกต DAPI
สัญญาณไม่ได้มาจากเซลล์ที่ตายแล้ว การวิเคราะห์ CLSM ของเรายัง
แสดงให้เห็น colocalization ของวัสดุ DAPI เปื้อนกับ
microcolonies และขาดสัญญาณจากแต่ละเซลล์.
เพิ่มเติมฟื้นฟูสามมิติของ DAPI เปื้อน
ไบโอฟิล์ม GFP-แสดงเปิดเผยว่าดีเอ็นเอเข้มข้น
ในชั้นฐานของไบโอฟิล์มและแยกย้ายกันไป
เป็น โครงสร้างเหมือนขนนกที่ด้านบนของขนาดใหญ่
อาคาร (รูปที่ 2C, D, E; แผงล่าง).
โครงสร้างขนาดใหญ่ตั้งข้อสังเกตในไบโอฟิล์มเป็นผู้ใหญ่ที่มี
แสงที่ส่งและผ่านการเรืองแสง GFP ถูก
colocalized ยังมีสัญญาณจากคองโกสีแดง (CR)
และ thioflavin T (THT) คราบเหล่านี้จะถูกใช้เป็นประจำ
เช่นการทดสอบลักษณะการปรากฏตัวของความหลากหลาย
ของโปรตีน amyloid รวมทั้งการวินิจฉัยและการศึกษา
เช่นเดียวกับใน pJAM1020 แต่โคลนเข้าสู่พลาสมิด pTA409,

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ผล volcanii
haloferax เซลล์พัฒนาเป็นโครงสร้างอาณานิคม
biofilms และไบโอฟิล์ม
ของเหลวคงที่สิ่งมีชีวิตขนาดเล็กมากในน้ำ . volcanii DS2 เซลล์โตสั่นวัฒนธรรม
( รูปที่ 1A ) พร้อมสร้างไบโอฟิล์มในทั่วไปประเภทสื่อ
รวย ypc HV และ HV CA ภายในหลายทดลอง
ระบบที่ให้พลาสติกแข็งหรือชั้นล่างแก้ว
อาณานิคมไบโอฟิล์ม [ 7 ] พัฒนาบนพื้นผิวของ
โพลีคาร์บอเนตกรองอยู่ในสื่อที่เป็นของแข็ง ( รูปที่ 1A )
และแช่แข็ง แปรรูปและข้ามตัด , การเปิดเผย
พื้นผิวโครงสร้างที่มีโครงสร้างเป็นรูปทรงกลมใหญ่ล้อมรอบด้วย
( รูปที่ 1A ) ระดับที่ยิ่งใหญ่ที่สุดของความซับซ้อนของโครงสร้างพบ biofilms

โตในแบบคงที่เมื่อถูกของเหลว ( SL ไบโอฟิล์ม ; รูป 1C ) กสิ
SL ไบโอฟิล์มภายในห้องและบน
สไลด์พื้นผิวของแก้ว borosilicate คูปองอยู่ในหกดี
แผ่นได้รับอนุญาตโดยตรง staining และปรับภาพ
โครงสร้างไบโอฟิล์มละเอียดอ่อนที่มองเห็น ซึ่งมองเห็นด้วยตาเปล่า

( รูป 1C ) เราเริ่มโดยการตรวจสอบการพัฒนาของ
h volcanii DS2 biofilms ในคงที่และของเหลวโดยใช้เซลล์เยื่อ clsm
สี FM 1-43 cellmask รัฐเท็กซัสและส้ม ; รูป 1D –ฉันเพิ่มเติมไฟล์ 1 ตาราง S1 )กลม
microcolonies เกิดขึ้นภายใน 48 ชั่วโมง ( คิดดี ) ซึ่งนำไปสู่การกำหนดกลุ่มตัวอย่างหลัง /
5 วัน ( รูปที่ 1e ) .
SL biofilms ถึงวุฒิภาวะ หลังจาก 7 วัน 1
42 ° C มีการพัฒนาเป็นอาคารหลายชั้น มีเกล็ดเหมือนสัณฐาน ( รูปที่ชั้น 1
, G , H )
อาคารขนาดใหญ่ที่ถูกล้อมรอบด้วยชั้นของกลุ่ม
ขนาดเล็กหนาแน่นหรือ microcolonies และแยกตามพื้นที่เล็ก ๆด้วย
หรือความหนาแน่นเซลล์ ( รูปที่ 1e ( H ) ความสมบูรณ์ของโครงสร้าง
โดยรวมยังคงเป็นกลุ่มขนาดใหญ่ล้อมรอบด้วย
microcolonies ขนาดเล็กหลายสัปดาห์แล้ว ถึงแม้ว่าการเปรียบเทียบมุมมองของ CMO )

เปื้อน SL ไบโอฟิล์ม พบว่า หลังจาก 2 สัปดาห์ความสูงของโครงสร้างส่วนใหญ่
ลดลงและน้อยของพื้นที่ผิวทั้งหมด
ปกคลุมด้วย microcolonies ( รูป 1i , 2 สัปดาห์ ) ขนาดใหญ่
กลุ่ม / อาคาร เหมือนตัวอย่างที่แสดงในรูปที่ 1f , G , H ,
หลากหลายในความสูงและความกว้างกับความสูงสูงสุดวัดได้

μ 148 เมตร microcolonies ภายในไบโอฟิล์มรูปแบบโดย GFP แสดง
haloferax volcanii ความเครียดผูกคราบเป้าหมายพอลิแซคคาไรด์และโปรตีนดีเอ็นเอไมโตคอนเดรีย

หลายชั่วโมง volcanii สายพันธุ์ ที่ออกแบบมาเพื่อแสดง
เพื่อศึกษาองค์ประกอบของ GFP ECM กับเป้าหมายของการขยายการศึกษาและการทดลองด้วย

เพื่อนร่วมงานและ fr ö LS [ 38 ] ยืนยันการแสดงออกของ GFP เป็นครั้งแรก
เข้าถึงภายในอาณานิคมที่เกิดขึ้นโดยสอง GFP การแสดงออก
สายพันธุ์ที่ผลิตในการศึกษานี้ อาณานิคมที่ก่อตั้งโดยบิดา
h volcanii h1206 สายพันธุ์ ( รูปที่ 2A ; แผงด้านซ้าย ) ไม่ได้
autofluoresce กับสีฟ้า ( รูปที่ 2A , กระตุ้นแผงกลาง ) ในขณะที่ผู้ที่ก่อตั้งโดย H .
volcanii h1206 ( pjam1020 )
เมื่อยตามการพัฒนาก่อนหน้านี้พลาส pjam1020
( ดูเพิ่มเติมไฟล์ 1 ตาราง S1 ) [ 59 ] พบเครื่องแบบและ
ระดับสูงของ GFP เรืองแสง ( รูปที่ 2A ; ใช่แผง ) .
เพิ่มเติม GFP แสดง volcanii h1206 สายพันธุ์เอช
( psc409gfp )ที่มีเหมือนกันสีแดงขยับ geneproduced GFP อาณานิคมกับสัญญาณที่แตกต่างกันทั้ง
GFP ในความเข้มและการกระจายตัวเชิงพื้นที่ ซึ่งในการเลือกสรร
รูปแบบของ GFP สัญญาณภายในพัฒนาอาณานิคม
( เพิ่มเติมไฟล์ 1 รูป S1 ) การ h1206 ( pjam1020 )
สายพันธุ์จึงเลือกฟิล์มให้ศึกษาส่วนประกอบ
การแสดงออก GFP มั่นคงตลอด

ประชากรของเซลล์เซลล์ในกลุ่มมองเห็น GFP แสดงไบโอฟิล์ม
ถูก colocalized กับสัญญาณจากเท็กซัสแดงคู่
ของเลคตินถูก ( cona ; รูปที่ 2B )
และมีดีเอ็นเอมัดย้อม 4 นั้น 6-diamidino-2-phenylindole ,
( dapi ; รูปที่ 2 C , D , E ) cona เป็นที่รู้จักกัน

และ a-manopyranosyl ผูก a-glucopyranosyl ตกค้างภายใน glyconjugates ของ haloarchaeal ไบโอฟิล์ม [ 38 ] .
dapi ได้รับเลือกเป็นสำคัญ สำหรับการศึกษา DNA คราบ
clsm ของเราเพราะมันเป็นคราบเอ็ดน่า
preferentially ใน haloarchaeal ไบโอฟิล์ม [ 38 ] fr ö LS และ
เพื่อนร่วมงาน [ 38 ] ใช้สามกรดนิวคลีอิกสีย้อมเพื่อแยกแยะระหว่างและเซลล์ที่มีดีเอ็นเอ

ในไบโอฟิล์มก่อตั้งโดย volcanii และสายพันธุ์ haloarchaeal เพิ่มเติม
และพบว่า ( ก )
อะคริดีนสีส้มสดย้อมแต่ละเซลล์ ปรากฏคล้าย
ของเราใช้เซลล์ permeable กรดนิวคลีอิกย้อม syto 9
( เพิ่มเติมไฟล์ 1 รูป S2 ) , ( B ) สัญญาณจาก dapi
ปรากฏคลุมเครือและเม็ดและ colocalized
กับ microcolonies ( C ) พร้อมกัน hydroxy-9h-1-3-dichloro-9,9-dimenthylacridin-2-one ย้อมด้วย 7 -

( ddao ) เป็นกรดนิวคลีอิกย้อมถือว่าสมบูรณ์ผ่าน
กับเซลล์นำไปสู่รูปแบบของสัญญาณการ
เป็นหลักที่เหมือนกันและ ( d ) น้อยมาก ไม่ได้อยู่ภายในเซลล์
h volcanii ไบโอฟิล์ม ( แม้หลังจาก
30 วัน 1 ) แนะนำว่า สังเกต dapi
สัญญาณได้จากเซลล์ที่ตายแล้ว การวิเคราะห์ clsm ของเรายังพบ colocalization ของ dapi คราบ
วัสดุด้วย
microcolonies และการขาดของสัญญาณจากเซลล์แต่ละเซลล์ .
การฟื้นฟูสามมิติเพิ่มเติมของ dapi เปื้อน
GFP แสดงไบโอฟิล์ม พบว่าดีเอ็นเอจาก
ในชั้นพื้นฐานของฟิล์มและแจกจ่าย
เป็นขนนก เช่นโครงสร้างที่ด้านบนของอาคารขนาดใหญ่
( รูปที่ 2 C , D , E ; แผงล่าง )
ขนาดใหญ่โครงสร้างที่พบในผู้ใหญ่ ไบโอฟิล์มด้วย
แสงผ่าน GFP และเรือง
คือยัง colocalized กับสัญญาณจากคองโกแดง ( CR ) และ T
thioflavin ( THT ) คราบเหล่านี้มีลักษณะเป็นแบบตรวจใช้

มีหลากหลายของโปรตีนแอมีลอยด์ รวมถึงการวินิจฉัยและศึกษา
ใน pjam1020 แต่โคลนเข้าสู่พลาสมิด pta409 ,