2.4. Comet assayHuman lymphocytes w

2.4.

Comet

assay
Human

lymphocytes

were

isolated

according

to

the

procedure

described

by

Jian-
lin

et

al.

[24]

and

Zhang

et

al.

[25],

and

were

resuspended

in

phosphate-buffered
saline

(PBS).

The

cellular

viability

was

measured

using

the

Trypan

blue

test.

The

cel-
lular

viability

of

all

samples

was

≥95%.

The

isolated

lymphocytes

were

immediately
used

for

comet

assay.

The

comet

assay

was

performed

according

to

the

description
by

Singh

et

al.

and

modified

[26].

Slides

were

prepared

in

duplicate

per

person.

The
cells

were

embedded

in

0.5%

low

melting

point

agarose

at

a

final

concentration

of
10 4 cells/ml,

75

l

of

this

cellular

suspension

was

then

spread

onto

a

frosted

slide
that

had

previously

been

covered

with

100

l

of

1%

normal

melting

point

agarose

as
the

first

layer.

Slides

were

immersed

in

freshly

prepared

lysis

solution

(1%

sodium
sarcosinate,

2.5

M

NaCl,

100

mM

Na 2 EDTA,

10

mM

Tris–HCl

pH

10,

1%

Triton

X-
100

and

10%

DMSO)

at

4
◦
C

for

1

h.

Then

the

slides

were

placed

in

a

horizontal
electrophoresis

unit

covered

with

fresh

buffer

(1

mM

Na 2 EDTA,

300

mM

NaOH,

PH
13)

for

20

min

to

allow

DNA

unwinding

and

expression

of

alkali-labile

sites.

Elec-
trophoresis

was

performed

for

30

min

at

20

V

and

300

mA.

Subsequently,

the

slides
were

washed

gently

2

times

in

neutralization

buffer

(0.4

M

Tris–HCl,

PH

7.5).

Each
slide

was

stained

with

40

l

of

ethidium

bromide

(20

g/ml).

All

the

above

steps
were

conducted

under

yellow

light

to

avoid

additional

DNA

damage.

Observations
were

made

at

400×

magnification

using

a

fluorescence

microscope

(Olympus

DP50,
Japan)

equipped

with

a

530

nm

excitation

filter

and

a

590

nm

emission

filter

within
24

h.

The

comet

assay

software

project

(CASP)

was

used

to

analyze

comets.

Three
hundred

cells

per

sample

were

randomly

selected,

i.e.

150

cells

were

from

each

of
two

replicate

slides.

The

percentage

of

DNA

in

the

tail

(%

tail

DNA)

served

as

a

DNA
damage

indicator

[27].

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4 ดาวหาง วิเคราะห์มนุษย์ lymphocytes ถูก แยกต่างหาก ตาม ถึง ที่ ขั้นตอนการ อธิบาย โดย เจียน-หลิน ร้อยเอ็ด อัล [24] และ เตียว ร้อยเอ็ด อัล [25], และ ถูก resuspended ใน ฟอสเฟต bufferedน้ำเกลือ (PBS) ที่ มือถือ ชีวิต ถูก วัด โดยใช้ ที่ Trypan สีน้ำเงิน การทดสอบ ที่ cel-lular ชีวิต ของ ทั้งหมด ตัวอย่าง ถูก ≥95% ที่ แยกต่างหาก lymphocytes ถูก ทันทีใช้ สำหรับ ดาวหาง วิเคราะห์ ที่ ดาวหาง วิเคราะห์ ถูก ดำเนินการ ตาม ถึง ที่ คำอธิบายโดย สิงห์ ร้อยเอ็ด อัล และ modified [26] ภาพนิ่ง ถูก เตรียม ใน ซ้ำ ต่อ บุคคลที่ ที่เซลล์ ถูก ฝัง ใน 0.5% ต่ำสุด ละลาย จุด agarose ที่ การ final ความเข้มข้น ของ10 4 เซลล์/ml 75 l ของ นี้ มือถือ ระบบกันสะเทือน ถูก แล้ว แพร่กระจาย บน การ ฝ้า ภาพนิ่งที่ มี ก่อนหน้านี้ ถูก ครอบคลุม ด้วย 100 l ของ 1% ปกติ ละลาย จุด agarose เป็นที่ first ชั้น ภาพนิ่ง ถูก ดื่มด่ำกับ ใน สดใหม่ เตรียม lysis โซลูชั่น (1% โซเดียมsarcosinate 2.5 M NaCl 100 มม. นา 2 EDTA 10 มม. ทริสเรทติ้ง – HCl pH 10 1% ไตรตั้น X-100 และ 10% DMSO) ที่ 4◦C สำหรับ 1 h แล้ว ที่ ภาพนิ่ง ถูก วาง ใน การ แนวนอนelectrophoresis หน่วย ครอบคลุม ด้วย สด บัฟเฟอร์ (1 มม. นา 2 EDTA 300 มม. NaOH PH13) สำหรับ 20 นาที ถึง อนุญาตให้ ดีเอ็นเอ ผ่อนคลาย และ นิพจน์ ของ ด่าง labile เว็บไซต์ Elec-trophoresis ถูก ดำเนินการ สำหรับ 30 นาที ที่ 20 V และ 300 mA ในเวลาต่อมา ที่ ภาพนิ่งถูก เครื่องซักผ้า เบา ๆ 2 ครั้ง ใน ปฏิกิริยาสะเทิน บัฟเฟอร์ (0.4 M ทริสเรทติ้ง – HCl PH 7.5) แต่ละภาพนิ่ง ถูก สี ด้วย 40 l ของ ethidium โบรไมด์ (20 g/ml) ทั้งหมด ที่ ข้างต้น ขั้นตอนต่อไปถูก ดำเนินการ ภายใต้ สีเหลือง แสง ถึง หลีกเลี่ยงการ เพิ่มเติม ดีเอ็นเอ ความเสียหาย ข้อสังเกตุถูก ทำ ที่ 400 × magnification โดยใช้ การ fluorescence กล้องจุลทรรศน์ (โอลิมปัส DP50ญี่ปุ่น) การติดตั้ง ด้วย การ 530 nm ในการกระตุ้น filter และ การ 590 nm ปล่อยก๊าซ filter ภายใน24 h ที่ ดาวหาง วิเคราะห์ ซอฟต์แวร์ โครงการ (CASP) ถูก ใช้ ถึง วิเคราะห์ ดาวหาง สามร้อย เซลล์ ต่อ ตัวอย่าง ถูก แบบสุ่ม เลือก เช่น 150 เซลล์ ถูก จาก แต่ละ ของสอง จำลอง ภาพนิ่ง ที่ เปอร์เซ็นต์ ของ ดีเอ็นเอ ใน ที่ หาง (% หาง ดีเอ็นเอ) เสิร์ฟ เป็น การ ดีเอ็นเอความเสียหาย ตัวบ่งชี้ [27]

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

4 2 2

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4 .




คนว่าดาวหางถูก







( แยกตาม










อธิบายขั้นตอนโดยเจี้ยนหลิน

-

-

. .

[ 24 ]





และ จาง และ

. .

[ 25 ] ,

กับ

)





resuspended ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ในน้ำเกลือ ( PBS )










คือ viability ของเซลล์วัด







ใช้ไตรแพน

สีฟ้า

ทดสอบ






บริการดีที่สุด - ของชีวิต







คือตัวอย่างทั้งหมด



≥ 95%





ถูกแยกเม็ดเลือดขาวทันที






ใช้สําหรับดาวหาง

)







เป็นดาวหาง (

)






ตามรายละเอียด






โดย ซิงห์ ร้อยเอ็ด

อัล



และ Modi จึงเอ็ด

[ 26 ] .





เตรียมสไลด์ได้





ซ้ำในคนต่อ








เซลล์ถูกฝังอยู่





ใน 0.5% ต่ำ




ละลายจุด
,

ที่







จึงนาล ความเข้มข้นของ
10 4 เซลล์ / มล.


รายการ L





มือถือของนี้





ถูกระงับแล้ว

กระจาย

บน






ว่าฝ้าสไลด์ได้







ก่อนหน้านี้ถูกปกคลุมด้วย







 100 ลิตรของ

1 %



ปกติละลาย





เป็นจุดเดี่ยว


จึงตัดสินใจเดินทางไป

. .





แช่ภาพนิ่ง )





ที่เตรียมสดใหม่ในการสลาย





( สารละลาย 1 %




sarcosinate โซเดียม , 2.5

m





NaCl 100 mm

นา 2 EDTA ,





10 มม. นอกจากนี้– HCl





อ 101% Triton x -








100 และ DMSO 10%

)




ที่ 4 ◦
C

สำหรับ

1

H

แล้ว







เป็นภาพนิ่งอยู่





ใน แนวนอน




วิธีหน่วยที่ปกคลุมด้วย







( บัฟสด 1

อืมม

นา 2 EDTA , 300 มม.








13 M NaOH )

สำหรับ

20

มิน






ให้ ดีเอ็นเอ





คลี่คลายและการแสดงออกของด่างที่







-
เว็บไซต์ อัตโน trophoresis

ถูก

)





สำหรับ 30 นาที



ที่20

v





และ 300 มา

แล้ว






เป็นภาพนิ่งค่อยๆล้าง







2 ครั้งในการบัฟเฟอร์









( 0.4 M ทริส– HCL


อ 7.5 )





แต่ละภาพนิ่งถูกย้อมด้วย







 40 L





ของทิเดียมโบรไมด์

20

 g / ml ) .

ทุกคน



ข้างบน





มีขั้นตอนคือ


สีเหลืองภายใต้แสง










เพิ่มเติมหลีกเลี่ยงความเสียหายดีเอ็นเอ






ทำให้สังเกตได้




ที่ 400 ×มกนีจึงใช้การ










fl uorescence กล้องจุลทรรศน์ ( Olympus DP50

, ญี่ปุ่น ) พร้อมด้วย











และ 530 nm จึง lter และ











590 นาโนเมตร สารมลพิษ

จึง lter

ภายใน 24 h .










ว่าดาวหางโครงการซอฟต์แวร์



( casp )





ถูกใช้วิเคราะห์






3
ดาวหาง เซลล์ร้อย






ตัวอย่างต่อ




เป็นคนเลือก

I





150 เซลล์ถูก





จากแต่ละของเลียนแบบ




สองภาพนิ่ง







หาของดีเอ็นเอใน







( หางหาง %







บริการ DNA ) เป็น






ความเสียหายดีเอ็นเอบ่งชี้

[ 27 ] .