3.2. Analysis of non-fecal preparat

3.2. Analysis of non-fecal preparations by direct PCR (standard protocol)
The feasibility of the APHA1 primers for direct amplification of A. phalloides traces in mixed mushroom (raw, fried and digested) preparations was investigated by a series of experiments. Mixed mushroom samples (~ 1 g total mass) were supplied with 2 ml ATL lysis buffer and homogenized (see Materials and methods). Aliquots from homogenized samples were diluted (1:100, 1:1,000 and
1:10,000) with water. Five-microlitre aliquots of diluted samples were used as template for direct PCR. PCR products of the expected size could be generated with all raw (Fig. 6 of ESM-2) and fried (Fig. 7 of ESM-2) mushroom preparations. In addition, target amplification by direct PCR was observed with diluted artificial gastric content (i.e. a homogenate composed of fried and digested

A. phalloides mixed with an excess of A. bisporus) (Fig. 8 of ESM-2).
3.3. Analysis of vomit and fecal specimens by direct PCR (modified protocol)
In order to enable rapid detection of mushroom traces in stool samples, a short protocol for feces pre-processing (including steps of water-ether sedimentation and cell disruption by bead beating, see 2.4.) was established. Furthermore, our standard recipe for direct PCR (see 2.7.1.) was modified by adding BSA (0.6% wt/vol) and by increasing the reaction volume (from 20 µl to 50 µl). With the use of this combined novel approach, we were able to discover highly diluted A. phalloides traces in spiked stool specimens (Fig. 10 of ESM-2). Notably, results obtained by the direct PCR approach were comparable with the results obtained by PCR using purified DNA from the same samples (data not shown). The modified direct PCR approach was applied to investigate samples (vomit, stool) from clinical cases of suspected mushroom poisoning. Fragments of the expected size were amplified and documented on agarose gel (see Figs. 9 and 11 of ESM-2). PCR products were purified and sequenced. Sequence data were subjected to BLAST analysis and affiliated with rDNA from A. phalloides (a reference sequence can be found in ESM-2).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3.2 การวิเคราะห์ของการเตรียมการที่ไม่อุจจาระโดยตรงโดยวิธี PCR (โปรโตคอลมาตรฐาน)
ความเป็นไปได้ของไพรเมอร์สำหรับการขยาย apha1 โดยตรงของ ร่องรอย phalloides ในเห็ดผสม (ดิบทอดและย่อย) การเตรียมการรับการตรวจสอบโดยชุดการทดลอง ตัวอย่างเห็ดผสม (~ 1 กรัมมวลรวม) มีมาพร้อมกับ 2 มล. บัฟเฟอร์สลาย ATL และหดหาย (ดูวัสดุและวิธีการ)aliquots จากตัวอย่างหดหายถูกเจือจาง (1:100 1:1,000 และ 1:10,000
) ด้วยน้ำ aliquots ห้าไมโครลิตรของสารตัวอย่างที่เจือจางถูกนำมาใช้เป็นแม่แบบสำหรับ pcr โดยตรง pcr ผลิตภัณฑ์ของขนาดที่คาดว่าอาจจะเกิดขึ้นกับทุกดิบ (รูปที่ 6 จาก esm-2) และทอด (รูปที่ 7 จาก esm-2) การเตรียมเห็ด ในนอกจากนี้ขยายเป้าหมายโดยวิธี PCR โดยตรงก็พบกับเนื้อหาในกระเพาะอาหารเจือจางเทียม (เช่น homogenate ประกอบด้วยทอดและย่อย

phalloides. ผสมกับส่วนเกินของ bisporus.) (รูปที่ 8 จาก esm-2)
3.3 การวิเคราะห์อาเจียนและตัวอย่างอุจจาระโดยวิธี PCR โดยตรง (โปรโตคอลการแก้ไข)
เพื่อให้การตรวจสอบอย่างรวดเร็วของร่องรอยเห็ดในตัวอย่างอุจจาระโพรโทคอสั้นสำหรับอุจจาระก่อนการประมวลผล (รวมถึงขั้นตอนของการตกตะกอนน้ำอีเทอร์และการหยุดชะงักของเซลล์โดยลูกปัดเต้นให้ดู 2.4.) ก่อตั้งขึ้น นอกจากนี้สูตรมาตรฐานของเรา pcr โดยตรง (ดู 2.7.1.) มีการปรับเปลี่ยนโดยการเพิ่ม BSA (0.6% น้ำหนัก / ปริมาตร) และโดยการเพิ่มปริมาณการเกิดปฏิกิริยา (จาก 20 ไมโครลิตรถึง 50 ไมโครลิตร) ด้วยการใช้วิธีการใหม่นี้รวมกันเราสามารถที่จะค้นพบเจือจางสูง phalloides ร่องรอยอยู่ในอุจจาระได้ถูกแทง (รูปที่ 10 จาก esm-2) โดยเฉพาะอย่างยิ่งผลที่ได้รับโดยวิธี PCR โดยตรงถูกเปรียบเทียบกับผลที่ได้จากการใช้ dna pcr บริสุทธิ์จากตัวอย่างเดียวกัน (ไม่ได้แสดงข้อมูล) วิธี PCR โดยตรงแก้ไขถูกนำมาใช้ในการตรวจสอบตัวอย่าง (อาเจียนอุจจาระ) จากกรณีที่ทางคลินิกของการเป็นพิษเห็ดที่น่าสงสัย ชิ้นส่วนของขนาดที่คาดว่าจะถูกขยายและจัดทำเอกสารเกี่ยวกับการเจล agarose (ดูมะเดื่อ. 9 และ 11 จาก esm-2) ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกทำให้บริสุทธิ์และติดใจ ข้อมูลลำดับถูกยัดเยียดให้การวิเคราะห์การระเบิดและมีส่วนเกี่ยวข้องกับ rDNA จาก phalloides (ลำดับการอ้างอิงสามารถพบได้ใน esm-2)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3.2 การวิเคราะห์ของเตรียมไม่ใช่ fecal โดย PCR โดยตรง (โพรโทคอลมาตรฐาน)
ความเป็นไปได้ของไพรเมอร์ APHA1 สำหรับขยายโดยตรงของร่องรอย A. phalloides ในผสมเห็ด (วัตถุดิบ ทอด และ digested) เตรียมถูกสอบสวน โดยชุดการทดลอง ผสมตัวอย่างเห็ด (~ 1 กรัมรวมมวล) ให้มาพร้อมกับบัฟเฟอร์ lysis ATL 2 ml และ homogenized (ดูวัสดุและวิธีการ) Aliquots จาก homogenized เป็นกลุ่มตัวอย่างถูกทำให้เจือจาง (1: 100, 1:1,000 และ
1:10, 000) กับน้ำ Microlitre 5 aliquots แตกออกอย่างถูกใช้เป็นแม่แบบสำหรับ PCR โดยตรง ผลิตภัณฑ์ PCR ขนาดคาดอาจถูกสร้างขึ้น ด้วยวัตถุดิบทั้งหมด (Fig. 6 2 ESM) และทอดเตรียมเห็ดกิน 7 ESM-2) นอกจากนี้ ขยายเป้าหมาย โดย PCR โดยตรงถูกตรวจสอบกับเนื้อหาในกระเพาะอาหารเทียมแตกออก (เช่น homogenate การประกอบทอด และเจ่า

A. phalloides ผสมกับมากเกิน A. bisporus) (Fig. 8 2 ESM)
3.3 วิเคราะห์ vomit fecal specimens โดย PCR โดยตรง (ปรับเปลี่ยนโพรโทคอล)
เพื่อเปิดใช้งานการตรวจหาร่องรอยเห็ดในตัวอย่างอุจจาระ อย่างรวดเร็ว โพรโทคอสั้นสำหรับอุจจาระไว้ก่อน (รวมถึงขั้นตอนการตกตะกอนน้ำอีเทอร์ และเซลล์ทรัพย โดยเต้นลูกปัด ดู 2.4) ก่อตั้งขึ้น นอกจากนี้ สูตรของเรามาตรฐานสำหรับ PCR โดยตรง (ดู 2.7.1) ถูกปรับเปลี่ยน โดยเพิ่มบีเอสเอ (0.6% wt/vol) โดยเพิ่มปริมาณปฏิกิริยา (จาก µl 20 กับ 50 µl) มีการใช้วิธีนี้นวนิยายรวม เราไม่สามารถค้นพบร่องรอยของ A. phalloides สูงแตกออกในไว้เป็นตัวอย่างอุจจาระถูกแทง (Fig. 10 ESM-2) ยวด ผลลัพธ์ที่ได้ โดยวิธี PCR โดยตรงถูกเปรียบเทียบกับผลได้รับ โดย PCR โดยใช้ดีเอ็นเอบริสุทธิ์จากตัวอย่างเดียวกัน (ข้อมูลไม่แสดง) ปรับเปลี่ยนวิธีการ PCR โดยตรงใช้การตรวจสอบตัวอย่าง (vomit เดิน) จากกรณีที่สงสัยว่าเป็นเห็ดพิษทางคลินิก ขนาดที่คาดถูกขยาย และจัดทำเอกสารบน agarose เจ (ดู Figs. 9 และ 11 ของ ESM-2) ผลิตภัณฑ์ PCR ได้บริสุทธิ์ และเรียงลำดับ ลำดับข้อมูลที่ต้องวิเคราะห์ระเบิด และสังกัด rDNA จาก A. phalloides (ลำดับการอ้างอิงสามารถพบใน ESM-2)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

3.2 . การวิเคราะห์ของไม่ใช่อุจจาระการเตรียมตัวโดยตรง pcr (โปรโตคอลมาตรฐาน)
ความเป็นไปได้ของที่ apha 1 primers โดยตรงสำหรับการขยายสัญญาณเสียงของ A . phalloides ลายวงจรขาดในแบบผสมเห็ดฟาง(วัตถุดิบ,ทอดและย่อย)การเตรียมตัวเป็นการสอบสวนโดยชุดการทดลอง. ตัวอย่างเห็ดแบบผสม(~ 1 มวลชนรวม G )ได้มาพร้อมด้วย 2 มล. ATL lysis บัฟเฟอร์และสดพร่องมันเนยเป็น(ดูวิธีการและวัสดุ)จากตัวอย่าง aliquots สดพร่องมันเนยเป็นคนเจือจาง( 1 : 1001 : 1 , 000 และ
1 : 10 , 000 )พร้อมด้วยน้ำ aliquots ห้า - microlitre ของตัวอย่างเจือจางได้ถูกนำมาใช้เป็นเทมเพลตสำหรับ pcr. โดยตรง ผลิตภัณฑ์ pcr ขนาดคาดว่าจะถูกสร้างขึ้นด้วยวัตถุดิบ(รูปทั้งหมด 6 ของ esm 2 )และทอด(รูปที่ 7 ของ esm 2 )เห็ดฟางการเตรียมตัว. ในการเพิ่มการขยายเป้าหมายโดย pcr โดยตรงพบว่ามีเนื้อหาย่อยเทียมเจือจาง(เช่น homogenate ประกอบไปด้วย phalloides

A .ทอดและย่อยผสมกับส่วนเกินของ bisporus A )(รูปที่ 8 ของ esm 2 )
3.3 . การวิเคราะห์ของอาเจียนและเป็นตัวอย่างอุจจาระโดยตรง pcr (แก้ไขโปรโตคอล)
ในการสั่งซื้อเพื่อเปิดใช้งานการตรวจจับอย่างรวดเร็วของเห็ดลายวงจรขาดในตัวอย่างเก้าอี้โปรโตคอลเพื่อไปถึงได้ไม่ไกลนักสำหรับอุจจาระ Pre - การประมวลผล(รวมถึงขั้นตอนของตะกอนน้ำ - อากาศธาตุและการหยุดชะงักเซลล์โดยการตีลูกปัดดู 2.4 .)ได้รับการสถาปนาขึ้นมา ยิ่งไปกว่านั้นสูตรมาตรฐานของเราโดยตรงสำหรับ pcr (ดู 2.7.1 .)มีการเปลี่ยนแปลงโดยการเพิ่ม BSA ( 0.6% WT / vol )และโดยการเพิ่มระดับเสียงปฏิกริยาที่(จาก 20 μ L ถึง 50 μ L ) พร้อมด้วยการใช้วิธีการใหม่นี้ประกอบด้วยเราก็สามารถเพื่อสำรวจร่องรอย phalloides เจือจางเป็นอย่างสูงในตัวอย่างเก้าอี้เครื่องเซ่นไหว้(รูปที่ 10 ของ esm 2 ) โดยเฉพาะผลการได้รับโดยวิธีการ pcr โดยตรงได้ใกล้เคียงกับผลที่ได้รับจากการใช้ดีเอ็นเอ pcr บริสุทธิ์จากตัวอย่างเดียวกันได้(ข้อมูลไม่มีใน ภาพ ประกอบ) วิธีการ pcr โดยตรงได้รับการแก้ไขนั้นก็นำมาใช้ในการสืบสวนสอบสวนตัวอย่าง(อ้วกเก้าอี้)จากกรณีทางการแพทย์ของเห็ดพิษสงสัย เศษคาดว่าจะมีขนาดของที่มีแอมพลิฟายและเอกสารบน agarose เจล(ดูมะเดื่อ 9 และ 11 ของ esm 2 ) ผลิตภัณฑ์ pcr ก็บริสุทธิ์และอักษรเรียงลำดับ\ ข้อมูลตามลำดับก็ต้องตกอยู่ในการวิเคราะห์ระเบิดและเข้าร่วมด้วย rdna จาก phalloides . A .(หมายเลขอ้างอิงที่สามารถพบได้ใน esm 2 )