Microorganisms and culture conditio

Microorganisms and culture conditions
LAB strains (91) isolated from different sources and belonging to the Culture Collection of the Centro de Referencia para Lactobacilos (CRL) (CERELA-CONICET), Tucumán, Argentina, were used (Table 1). The mould strains used in this study were Aspergillus (A.) niger CH 101, Penicillium (P.) sp. CH 102 and Fusarium (F.) graminearum CH 103, previously isolated from contaminated bread; and P. digitatum INTA2 and Geotrichum (G.) citri-aurantii INTA1, isolated from a commercial citrus fruit packing industry of National Agricultural Institute (INTA) Famaillá, Tucumán, Argentina. All fungal strains were used as indicators in the bioassay determinations.
LAB cultures were grown in MRS (De Man et al., 1960) broth (pH 6.5) at 37 C for 24 h without agitation. Cell-free supernatants (CFS) obtained by centrifugation at 9000g for 10 min at 4 C (IEC model B-22 M, International Equipment Company, USA) were filtered (0.2 lm-pore-size, Sartorius AG, Goettingen, Germany) and stored at 20 C until used for antifungal assays.
The fungi strains were grown on Czapek-Dox medium (0.3% NaNO3, 0.1% K2HPO4, 0.05% KCl, 0.05% MgSO4, 0.001 FeSO4, 3% sacarose, 0.5% yeast extract 1.5% agar) at 25 C for 7 days. The conidias were collected in sterile Tween 80 at 0.05% (v v1) and counted at the microscope in a haemacytometer chamber.
Antifungal assay
The antifungal activity of the CFS from the different LAB strains was determined by Microtitre Plate Well Assay (Lavermicocca et al., 2003) as described below. Conidial suspensions (10 ll) containing 104 conidia per ml were added to 190 ll of the CFS of each LAB strain. The assays were performed in sterile multiwell microdilution plates (96 sterile wells) (Corning Incorporated, USA). Fungal growth was determined by measuring the optical density (OD580nm) at 30 C after 48 h in a spectrophotometer (VERSAmax, Molecular Devices, USA). Conidia of each strain inoculated in MRS broth were used as control. The antifungal activity of the LAB strains was expressed as the fungal growth inhibition (%) measured as described above. In all trials, the percentages of inhibition [Inhib% = 100 (DODLAB 100/DODControl)] was determined.
Characterization of the antifungal compounds
The LAB CFS (pH 3.5) were subjected to different treatments to determine the nature of the antifungal compounds: exposure to high temperature (100 C for 10 min), neutralization to pH 7.0 (with 0.1 M NaOH), or subjected to the action of the following enzymes: catalase (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA, pH
7.0), trypsin (Sigma, pH 7.6), pepsin A (Sigma, pH 2.0) or proteinase K (Invitrogen, CA USA, pH 7.6). The pH values of the CFS were adjusted to the optimum pH of each enzyme. The mixture was prepared as follows: 100 lg of each enzyme/ml of CFS incubated 1 h at 37 C (trypsin and pepsin A), or 30 min at 45 C (proteinase K) or 30 min. at 37 C (catalase). The antifungal activity of treated CFS was determined by measuring the OD580nm using the microtiter plate assay as described above.
Organic acids determination
The organic acids present in the 24 h CFS were determined by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and enzymatic methods. Lactic and phenyllactic acids were determined by HPLC (ISCO 2350 model, Nebraska, USA) using an ion-exclusion Aminex 87 H column (300 78 mm, Bio-Rad Laboratories, CA, USA) under the following conditions: mobile phase (2.5 mM) H2SO4; flow rate 0.6 ml/min; temperature of column 45 C. An UV (210 nm) detector (ISCO V4 model) connected to the software (Peak Simple II) for data analyses was used. Acetic acid was determined by a commercial kit (Acetic acid assay, Boehringer Mannheim, Germany).
Determination of the antifungal peptide/s molecular weight
The separation of the metabolites present in the CFS (48 h) of Lactobacillus fermentum CRL 251 and non-fermented MRS medium (control) according to their molecular weight were performed by ultrafiltration using Centricon (10 kDa Ultracel YM membranes, Millipore) non-sterile filters. The CFS (1.5 ml) was placed in the sample reservoir and centrifuged (IEC Multi RF) at 3500g at 10 C for 2 h to avoid possible inactivation of the biofungicides. The metabolites higher than 10 kDa were retained in the membrane and re-suspended in MRS without acetate. Both fractions, peptides >10 kDa and 10 and

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

จุลินทรีย์และสภาพวัฒนธรรม ห้องปฏิบัติการสายพันธุ์ (91) แยกต่างหากจากแหล่งต่าง ๆ และเป็นการรวบรวมวัฒนธรรมของเซ็นโทรเดอ Referencia พารา Lactobacilos (CRL) (CERELA-CONICET), Tucumán อาร์เจนตินา ใช้ (ตารางที่ 1) สายพันธุ์แม่พิมพ์ที่ใช้ในการศึกษานี้มี Aspergillus (A.) ไนเจอร์ CH 101, Penicillium (พี) sp. CH 102 และ Fusarium graminearum (F.) CH 103 ก่อนหน้านี้ แยกต่างหากจากขนมปังปนเปื้อน และ P. digitatum Geotrichum (กรัม) และ INTA2 citri aurantii INTA1 แยกต่างหากจากผลไม้ส้มค้าส่งอุตสาหกรรมของชาติเกษตรสถาบัน (INTA) Famaillá, Tucumán อาร์เจนติน่า สายพันธุ์เชื้อราทั้งหมดถูกใช้เป็นตัวบ่งชี้ใน bioassay determinations ปฏิบัติวัฒนธรรมถูกปลูกใน MRS (เดคนร้อยเอ็ด al., 1960) ซุป (pH 6.5) ที่ 37 C ใน 24 ชมโดยไม่มีอาการกังวลต่อการ รับฟรีเซลล์ supernatants (CFS) โดย centrifugation ที่ 9000g ใน 10 นาทีที่ 4 C (IEC รุ่น B-22 M อุปกรณ์ต่างประเทศบริษัท สหรัฐอเมริกา) มีกรอง (0.2 lm-รูขุมขนขนาด บริษัทซาร์โทเรียส AG, Goettingen เยอรมนี) และจัดเก็บที่ 20 C จนกระทั่งใช้ assays ต้านเชื้อรา สายพันธุ์เชื้อราเติบโตบนกลาง Czapek Dox (0.3% NaNO3, 0.05%, 0.1% K2HPO4 KCl, 0.05% MgSO4, 0.001 FeSO4, sacarose 3%, 0.5% ยีสต์สกัด 1.5% agar) ที่ 25 C 7 วัน Conidias ถูกรวบรวมไว้ในฆ่าเชื้อ Tween 80 0.05% (v v1) และนับที่กล้องจุลทรรศน์ในห้อง haemacytometer ทดสอบต้านเชื้อรา กิจกรรมอาการของ CFS จากสายพันธุ์ห้องปฏิบัติการต่าง ๆ ถูกกำหนด โดย Microtitre จานดีวิเคราะห์ (Lavermicocca et al., 2003) ตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง บริการ conidial (10 จะ) conidia มี 104 ต่อ ml เพิ่มเข้า 190 จะ CFS ของต้องใช้ห้องปฏิบัติการแต่ละ Assays ที่ดำเนินในแผ่น microdilution multiwell กอซ (96 ใส่บ่อ) (คอร์นทำ Incorporated สหรัฐอเมริกา) เจริญเติบโตของเชื้อราที่ถูกกำหนด โดยการวัดความหนาแน่นออปติคอล (OD580nm) ที่ 30 C หลังจาก 48 h ในเครื่องทดสอบกรดด่าง (VERSAmax อุปกรณ์โมเลกุล สหรัฐอเมริกา) Conidia ต้องใช้แต่ละ inoculated ในซุป MRS ถูกใช้เป็นตัวควบคุม กิจกรรมต้านเชื้อราของสายพันธุ์ห้องปฏิบัติที่แสดงเป็นยับยั้งเชื้อราเจริญเติบโต (%) วัดที่อธิบายข้างต้น ในการทดลองทั้งหมด เปอร์เซ็นต์การยับยั้ง [Inhib % = 100 (100 DODLAB DODControl)] ได้กำหนดไว้ คุณสมบัติของสารต้านเชื้อรา CFS แล็บ (pH 3.5) อยู่ภายใต้การรักษาแตกต่างกันในการกำหนดลักษณะของสารต้านเชื้อรา: สัมผัสกับอุณหภูมิสูง (100 C สำหรับ 10 นาที), ปฏิกิริยาสะเทินกับค่า pH 7.0 (ด้วย 0.1 M NaOH), หรือการกระทำของเอนไซม์ต่อไปนี้: catalase (ซิกเคมี บริษัท St. Louis, MO สหรัฐอเมริกา ค่า pH 7.0), ทริปซิน (ซิก pH 7.6) เพพซิน (ซิก pH 2.0) หรือ proteinase K (Invitrogen, CA USA ค่า pH 7.6) ค่า pH ของ CFS ถูกปรับค่า pH ที่เหมาะสมของเอนไซม์แต่ละ ส่วนผสมเตรียมไว้ดังนี้: lg 100 ของแต่ละ เอนไซม์/ml ของ CFS incubated h ที่ 37 C (ทริปซินและเพพซิน A), หรือ 30 นาทีที่ 45 C (proteinase K) หรือ 30 นาทีที่ 37 C (catalase) 1 กำหนดกิจกรรมอาการของ CFS บำบัด โดยวัด OD580nm ใช้ทดสอบแผ่น microtiter ที่อธิบายข้างต้น กำหนดกรดอินทรีย์ กรดอินทรีย์ที่อยู่ใน 24 h CFS ได้ตามสูงประสิทธิภาพของเหลว Chromatography (HPLC) และเอนไซม์ในระบบวิธี กรดแลกติกและ phenyllactic ถูกกำหนด โดย HPLC (ISCO 2350 รุ่น รัฐเนแบรสกา สหรัฐอเมริกา) โดยใช้คอลัมน์ Aminex 87 H การแยกไอออน (300 mm 78 ห้องปฏิบัติการชีวภาพ Rad, CA, USA) ภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้: ระยะเคลื่อน (2.5 mM) กำมะถัน กระแสอัตรา 0.6 ml/min อุณหภูมิของคอลัมน์ c 45 มี UV (210 nm) ใช้เครื่องตรวจจับ (ISCO V4 รุ่น) เชื่อมต่อกับซอฟต์แวร์ (Peak II ง่าย) สำหรับวิเคราะห์ข้อมูล กรดอะซิติกที่ถูกกำหนด โดยชุดพาณิชย์ (วิเคราะห์กรดอะซิติก Boehringer มันน์ไฮม์ ประเทศเยอรมนี) กำหนดน้ำหนักโมเลกุล s อาการเพปไทด์ ดำเนินแยกของ metabolites ใน CFS (48 h) ของแลคโตบาซิลลัส fermentum CRL 251 และไม่หมัก MRS ปานกลาง (ควบคุม) ตามน้ำหนักของโมเลกุล โดยใช้ Centricon ultrafiltration (10 kDa Ultracel YM สาร มาก) ไม่ใส่กรอง CFS (1.5 ml) ถูกวางไว้ในอ่างเก็บน้ำตัวอย่าง และ centrifuged (IEC หลาย RF) ที่ 3500g ที่ C 10 สำหรับ h 2 หลีกเลี่ยงการยกเลิกการเรียกเป็นไปได้ของ biofungicides Metabolites สูงกว่า 10 kDa ถูกเก็บไว้ในเมมเบรน และชั่วคราวอีกครั้งในนาง โดย acetate เศษส่วน เปปไทด์ > 10 kDa และ < 10 kDa ถูก sterilized โดยการกรอง ($ 0.22 lm) และ neutralized กับค่า pH 7.0 เพื่อกำจัดผลของกรดอินทรีย์ กิจกรรมกับพันธุ์เห็ดรา assayed สุดทน A. ไนเจอร์ CH 101 ต้านเชื้อราที่ถูกกำหนด โดยการวัด OD580nm ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ส่วนเปปไทด์ (เปปไทด์ > 10 และ < 10 kDa) ได้จากหมักไม่ใช่กลาง MRS ถูกใช้เป็นตัวควบคุม วิเคราะห์ทางสถิติ Assays ทั้งหมดได้ดำเนินการทดลองอิสระสาม และค่าเฉลี่ยส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน± (SD) ได้ ข้อมูลเปรียบเทียบผลต่างของการวิเคราะห์ (วิเคราะห์ความแปรปรวน) และ t-ทดสอบ Dunnett นัยสำคัญทางสถิติ (p < 0.05) ที่ถูกกำหนดโดยซอฟต์แวร์ 2006p.3 InfoStat ส่วนประกอบหลัก (PCA) และแบ่งใช้ข้อมูลห้องปฏิบัติการกิจกรรมต้านเชื้อรา

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

จุลินทรีย์และเงื่อนไขในการเพาะเลี้ยง
สายพันธุ์ LAB (91) ที่แยกได้จากแหล่งที่มาที่แตกต่างกันและเป็นของสะสมวัฒนธรรมพิทักษ์ Lactobacilos Centro de Referencia (CRL) (CERELA-CONICET) Tucumán, อาร์เจนตินา, ถูกนำมาใช้ (ตารางที่ 1) สายพันธุ์แม่พิมพ์ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้มีเชื้อรา Aspergillus (ก) ไนเจอร์ CH 101, Penicillium (P. ) Sp CH 102 และ Fusarium (เอฟ) graminearum CH 103, แยกก่อนหน้านี้จากการปนเปื้อนขนมปัง; และ INTA2 P. digitatum และ Geotrichum (G. ) citri-Aurantii INTA1 แยกจากผลไม้ส้มอุตสาหกรรมบรรจุภัณฑ์ในเชิงพาณิชย์ของสถาบันการเกษตรแห่งชาติ (INTA) Famaillá, Tucumán, อาร์เจนตินา ทุกสายพันธุ์ของเชื้อราถูกนำมาใช้เป็นตัวชี้วัดในการตรวจวัดชีวภาพ
วัฒนธรรม LAB ถูกปลูกใน MRS (De Man et al., 1960) น้ำซุป (pH 6.5) ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมงโดยไม่ต้องปั่นป่วน supernatants เซลล์ฟรี (CFS) ที่ได้จากการหมุนเหวี่ยงที่ 9000g เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิ 4 C (IEC แบบ B-22 M, อุปกรณ์อินเตอร์เนชั่นแนล, สหรัฐอเมริกา) ได้รับการกรอง (0.2 LM-รูขุมขนขนาด Sartorius AG, Goettingen, เยอรมนี) และ เก็บไว้ที่ 20 C จนกว่าจะใช้สำหรับการตรวจเชื้อรา
สายพันธุ์เชื้อราถูกปลูกใน Czapek-Dox ปานกลาง (0.3% NaNO3, 0.1% K2HPO4, 0.05% โพแทสเซียม 0.05% MgSO4, 0.001 FeSO4, 3% sacarose, 0.5% สารสกัดจากยีสต์ 1.5% วุ้น) ที่ 25 C เป็นเวลา 7 วัน conidias ถูกเก็บไว้ในหมัน Tween 80 ที่ระดับ 0.05% (V V1) และนับที่กล้องจุลทรรศน์ในห้อง haemacytometer
ต้านเชื้อรา assay
กิจกรรมต้านเชื้อราของ CFS จากสายพันธุ์ LAB ที่แตกต่างกันถูกกำหนดโดย microtitre จานดี Assay (Lavermicocca และคณะ 2003) ตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง สารแขวนลอยเชื้อรา (10 LL) ที่มี 104 สปอร์ต่อมิลลิลิตรถูกเพิ่มถึง 190 LL ของ CFS ของสายพันธุ์ LAB แต่ละ การตรวจที่ได้รับการดำเนินการในการฆ่าเชื้อแผ่น microdilution multiwell (96 บ่อหมัน) (Corning Incorporated, ประเทศสหรัฐอเมริกา) เจริญเติบโตของเชื้อราได้รับการกำหนดโดยการวัดความหนาแน่นของออปติคอล (OD580nm) ที่ 30 C หลังจาก 48 ชั่วโมงใน Spectrophotometer (VERSAmax อุปกรณ์โมเลกุล, ประเทศสหรัฐอเมริกา) สปอร์ของสายพันธุ์เชื้อในน้ำซุป MRS แต่ละถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุม กิจกรรมต้านเชื้อราสายพันธุ์ LAB ถูกแสดงเป็นยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อรา (%) วัดตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ในการทดลองทั้งหมดร้อยละของการยับยั้ง [Inhib% = 100 (DODLAB 100 / DODControl)] ถูกกำหนด
ลักษณะของเชื้อราสาร
LAB CFS (pH 3.5) ถูกยัดเยียดให้การรักษาที่แตกต่างกันเพื่อกำหนดลักษณะของสารต้านเชื้อราสาร อุณหภูมิสูง (100 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที), การวางตัวเป็นกลางค่าพีเอช 7.0 (0.1 M NaOH) หรือภายใต้การกระทำของเอนไซม์ดังต่อไปนี้: catalase (Sigma เคมิคอล จำกัด , เซนต์หลุยส์, MO, USA, pH
7.0), trypsin (Sigma, pH 7.6), น้ำย่อย (Sigma, pH 2.0) หรือโปร K (Invitrogen, แคลิฟอร์เนียสหรัฐอเมริกา, pH 7.6) ค่าพีเอชของ CFS ถูกปรับค่า pH ที่เหมาะสมของแต่ละเอนไซม์ ส่วนผสมที่ได้รับการจัดทำขึ้นดังต่อไปนี้: 100 LG ของแต่ละเอนไซม์ / ml CFS บ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 C (trypsin และน้ำย่อย) หรือ 30 นาทีที่ 45 C (โปร K) หรือ 30 นาที ที่อุณหภูมิ 37 C (catalase) กิจกรรมต้านเชื้อราของ CFS ได้รับการรักษาที่ถูกกำหนดโดยการวัด OD580nm โดยใช้การทดสอบแผ่นไมโครตามที่อธิบายไว้ข้างต้น
กำหนดกรดอินทรีย์
กรดอินทรีย์ที่อยู่ใน 24 ชั่วโมง CFS ถูกกำหนดโดยของเหลวสมรรถนะสูง Chromatography (HPLC) และวิธีการของเอนไซม์ กรดแลคติกและ Phenyllactic ถูกกำหนดโดยวิธี HPLC (ISCO 2350 รุ่นเนบราสก้าสหรัฐอเมริกา) ใช้ไอออนยกเว้น Aminex 87 H คอลัมน์ (300 78 มมชีวภาพ -Rad ห้องปฏิบัติการ, CA, USA) ภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้: เฟสเคลื่อนที่ (ขนาด 2.5 มม ) H2SO4; อัตราการไหล 0.6 มิลลิลิตร / นาที; อุณหภูมิของคอลัมน์ 45 ซียูวี (210 นาโนเมตร) เครื่องตรวจจับ (ISCO แบบ V4) เชื่อมต่อกับซอฟแวร์ (พีคครั้งที่สองง่าย) สำหรับการวิเคราะห์ข้อมูลที่ใช้ กรดอะซิติกถูกกำหนดโดยชุดในเชิงพาณิชย์ (อะซิติกกรดทดสอบ, Boehringer Mannheim, เยอรมนี)
การกําหนดเปปไทด์ต้านเชื้อรา / วินาทีน้ำหนักโมเลกุล
การแยกสารที่มีอยู่ใน CFS (48 ชั่วโมง) ของแลคโตบาซิลลัส fermentum CRL 251 และไม่หมัก MRS ปานกลาง (ควบคุม) ตามน้ำหนักโมเลกุลของพวกเขาได้รับการดำเนินการโดยใช้กรอง Centricon (10 กิโลดาลตันเยื่อ Ultracel YM, ค) ตัวกรองที่ไม่ผ่านการฆ่าเชื้อ CFS (1.5 ml) วางอยู่ในอ่างเก็บน้ำตัวอย่างและหมุนเหวี่ยง (IEC หลาย RF) ที่ 3500g ที่ 10 C เป็นเวลา 2 ชั่วโมงเพื่อหลีกเลี่ยงการใช้งานเป็นไปได้ของ biofungicides สารสูงกว่า 10 กิโลดาลตันได้รับการเก็บรักษาไว้ในเมมเบรนและอีกครั้งที่ลอยอยู่ใน MRS โดยไม่ต้องอะซิเตท เศษส่วนทั้งเปปไทด์> 10 กิโลดาลตันและ <10 กิโลดาลตันได้รับการฆ่าเชื้อโดยการกรอง (0.22 LM) และเป็นกลางจะมีค่า pH 7.0 ที่จะลดผลกระทบของกรดอินทรีย์ กิจกรรมต้านเชื้อรากับสายพันธุ์ทนมากที่สุด assayed เชื้อรา A. ไนเจอร์ CH 101, ถูกกำหนดโดยการวัด OD580nm ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ เศษส่วนเปปไทด์ (เปปไทด์> 10 <10 กิโลดาลตัน) ได้รับจากการที่ไม่ได้หมักกลาง MRS ถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุม
การวิเคราะห์สถิติ
การวิเคราะห์ทั้งหมดถูกดำเนินการในสามการทดลองที่เป็นอิสระและค่าเฉลี่ย±ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) จะได้รับ ข้อมูลที่ถูกนำมาเปรียบเทียบโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวน (Anova) และ Dunnett t-test นัยสำคัญทางสถิติ (p <0.05) ถูกกำหนดโดยใช้ซอฟต์แวร์ 2006p.3 InfoStat องค์ประกอบหลัก (PCA) และการวิเคราะห์กลุ่มถูกนำไปใช้กับ LAB ข้อมูลกิจกรรมต้านเชื้อรา

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

จุลินทรีย์ และสภาพการเลี้ยง
Lab สายพันธุ์ ( 91 ) ที่แยกได้จากแหล่งที่แตกต่างกันของวัฒนธรรมและคอลเลกชันของ Centro de referencia พารา lactobacilos ( CRL ) ( cerela-conicet ) , argentina . kgm อาร์เจนตินา ใช้ ( ตารางที่ 1 ) แม่พิมพ์ที่ใช้ในการศึกษา คือ สายพันธุ์ Aspergillus ไนเจอร์ ( A ) CH 101 , Penicillium sp . ( หน้า 102 ) และ ฟูซาเรียม ( F . ) graminearum CH 103 ,แยกก่อนหน้านี้จากขนมปังปนเปื้อน ; และ P . digitatum inta2 geotrichum ( กรัม ) และ citri aurantii inta1 , แยกจากส้มบรรจุผลไม้เชิงพาณิชย์อุตสาหกรรมของสถาบันการเกษตรแห่งชาติ ( inta ) . kgm famaill , argentina . kgm , อาร์เจนตินา สายพันธุ์เชื้อราทั้งหมดถูกใช้เป็นตัวชี้วัดในวิธีข้างต้น .
ห้องทดลองวัฒนธรรมถูกปลูกในนาง ( de Man et al . , 1960 ) น้ำ ( pH 65 ) ที่อุณหภูมิ 37 24 ชั่วโมงโดยไม่มีการกวน เซลล์ supernatants ฟรี ( CFS ) ที่ได้จาก 3 ที่ 9000g สำหรับ 10 นาทีที่ 4 C ( แบบ IEC b-22 M , บริษัท , อุปกรณ์ระหว่างประเทศสหรัฐอเมริกา ) กรอง ( 0.2 LM ขนาดรูพรุน sartorius , AG , เกิททิงเกน , เยอรมนี ) และเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส ถึงใช้ยา ) .
เชื้อราสายพันธุ์ที่ปลูกในอาหาร Czapek Dox ขนาดกลาง ( 0.3% NaNO3 0.1 % k2hpo4 KCl 0.05 % 005 % MgSO4 ใ 0.001 feso4 3 % sacarose 0.5 % สารสกัดจากยีสต์ 1.5% วุ้น ) ที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 7 วัน การ conidias เก็บตัวเป็นหมัน Tween 80 0.05% ( V V1 ) และนับในกล้องจุลทรรศน์ใน haemacytometer Chamber

ในการทดสอบฤทธิ์ต้านราของโฆษณาจากสายพันธุ์ที่ห้องปฏิบัติการต่าง ๆถูกกำหนดจาก microtitre จานดี assay ( lavermicocca et al . , 2003 ) ตามที่อธิบายไว้ด้านล่างรับน้ำหนักได้ดี ( จะ ) ที่มีต่อ 104 สร้างมลเพิ่ม 190 จะโฆษณาของแต่ละห้องปฏิบัติการ ความเครียด หรือมีการปฏิบัติในงาน multiwell microdilution แผ่น ( 96 ฆ่าเชื้อบ่อ ) ( Corning Incorporated , USA ) เชื้อราได้ถูกกำหนดโดยการวัดความหนาแน่นของแสง ( od580nm ) ที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส หลังจาก 48 ชั่วโมงในเครื่อง ( versamax โมเลกุล , อุปกรณ์ , USA )ชนิดของเชื้อแต่ละสายพันธุ์ใน MRS broth ที่ใช้ควบคุม กิจกรรมของห้องปฏิบัติการเชื้อราสายพันธุ์ถูกแสดงเป็นยับยั้งเชื้อรา ( % ) วัดตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ในการทดลอง เปอร์เซ็นต์การยับยั้ง [ inhib % = 100 ( dodlab 100 / dodcontrol ) ] คือกำหนด

ลักษณะของสารประกอบในแล็บ CFS ( pH 35 ) กลุ่มนี้ได้รับการรักษาที่แตกต่างกันเพื่อกำหนดลักษณะของสารประกอบยา : การเปิดรับแสงที่อุณหภูมิสูง ( 100 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที ) เป็นกลาง pH 7.0 ( 0.1 M NaOH ) หรือภายใต้การกระทำของเอนไซม์คะตะเลส ( Sigma เคมีดังต่อไปนี้ บริษัท เซนต์ หลุยส์ โม , สหรัฐอเมริกา , pH
7.0 ) , ทริปซิน ( Sigma , pH 7.6 ) เปปซิน ( Sigma , pH 2.0 ) หรือโปรตีน K ( Invitrogen , CA USA , pH 76 ) ความเป็นกรดของ CFS กำลังปรับพีเอชที่เหมาะสมของแต่ละเอนไซม์ ส่วนผสมที่เตรียมไว้ ดังนี้ 100 LG ของแต่ละเอนไซม์ / ml ของ CFS ) 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 37 ( ทริปเพพซิน ) หรือ 30 นาทีที่ 45 C ( โปร K ) หรือ 30 นาที ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ( Catalase ) กิจกรรมของเชื้อรา CFS ถือว่าถูกกำหนดโดยการวัด od580nm โดยใช้ไมโครเพลท ( ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น
ปริมาณกรดอินทรีย์กรดอินทรีย์
ปัจจุบันใน 24 ชั่วโมงโฆษณาตัวอย่างโดยวิธีโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง ( HPLC ) และวิธีเอนไซม์ . กรดแลคติกและ phenyllactic วิเคราะห์โดย HPLC ( isco 2350 รูปแบบเนบราสก้า สหรัฐอเมริกา ) โดยใช้ไอออนยกเว้น aminex 87 H คอลัมน์ ( 300 78 มม. , ห้องปฏิบัติการ , เรด ไบโอ แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา ) ภายใต้เงื่อนไขดังต่อไปนี้ : เฟสเคลื่อนที่ ( 2.5 มม. ) กรดซัลฟิวริก ;0.6 มิลลิลิตร / นาทีอัตราการไหล อุณหภูมิของคอลัมน์ 45 องศาเป็น UV ( 210 nm ) เครื่องตรวจจับ ( isco V4 รุ่น ) ที่เชื่อมต่อกับซอฟต์แวร์ ( ยอดง่าย 2 ) การวิเคราะห์ข้อมูลใช้ กรดอะซิติกถูกกำหนดโดยชุดพาณิชย์ ( กรดน้ำส้ม ) , Boehringer Mannheim , เยอรมัน ) ปริมาณของเชื้อรา
/ s
โมเลกุลเปปไทด์การแยกของสารที่มีอยู่ในโฆษณา ( 48 ชั่วโมง ) ของ Lactobacillus fermentum CRL 251 และไม่หมักคุณนายขนาดกลาง ( ควบคุม ) ตามน้ำหนักของโมเลกุลได้ผสมใช้ centricon ( 10 กิโล ) ultracel membranes มิลลิ ) ไม่ใช่ตัวกรองที่เป็นหมัน โฆษณา ( 15 ml ) อยู่ในตัวอย่างน้ำไฟฟ้า ( IEC หลาย RF ) ที่ 3500g 10 C 2 H เพื่อหลีกเลี่ยงการทำให้เป็นไปได้ของ biofungicides . ส่วนสารสูงกว่า 10 กิโลดาลตันถูกเก็บไว้ในเมมเบรนและแขวนลอยอยู่ในของนางโดยไม่อะซิเทต ทั้งเศษส่วนเปปไทด์ 10 kDa และ < 10 กิโลดาลตันถูกฆ่าเชื้อโดยการกรอง ( 0.22 LM ) และเป็นกลาง pH 7