Melanosomes were isolated using Opt

Melanosomes were isolated using OptiPrep® density gradient centrifugation (Fig 1). The RPE tissue was thawed on ice and suspended into hypotonic buffer containing inhibitors . Cells were disrupted with nitrogen cavitation at 450 psi with 15 min equilibration time. Whole cell lysate was centrifuged at 3000 g for 5 min and the supernatant (crude lysosomal fraction) was removed and pelleted at 20 000 g for 20 min. Crude melanosomal pellet was re-suspended into 50 mM Tris-HCl 150 mM KCl buffer (pH 7.40) and layered on top of discontinuous OptiPrep® gradient. Gradient tubes were centrifuged at 135 000 g for 1 h at + 4°C The melanosomal pellet was recovered and re-suspended into 50 mM Tris-HCl 150 mM KCl buffer (pH 7.40) and re-centrifuged in another OptiPrep® gradient. After the second gradient centrifugation, melanosomes were re-suspended into MES buffer (25 mM MES, 5 mM NaCl, 115 mM KCl, 1.3 mM MgSO4, pH 7.40) and residues of OptiPrep® were removed by two 10 000 g centrifugations. The total protein concentration of the purified melanosomal fraction was measured with the Bradford method

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Melanosomes ถูกแยกโดยใช้ OptiPrep® ความหนาแน่นไล่ระดับหมุนเหวี่ยง (รูปที่ 1) เนื้อเยื่อคลินิกหลายขับบนน้ำแข็ง และถูกระงับลงใสบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วยสารยับยั้ง เซลล์ถูกหยุดชะงักกับไนโตรเจน cavitation ที่ 450 psi มีเวลา equilibration 15 นาที ทั้งเซลล์ lysate ของถูกจากที่ 3000 กรัม 5 นาที และ supernatant (เศษส่วน lysosomal ดิบ) ออก และสัตว์ที่ 20 000 g สำหรับ 20 นาที melanosomal ดิบเม็ดถูกเลื่อนออกไปอีกเป็น 50 มม.ทริสเรทติ้ง HCl 150 mM KCl บัฟเฟอร์ (pH 7.40) และชั้นด้านบนไล่ระดับสี OptiPrep® ไม่ต่อเนื่อง หลอดไล่ระดับสีได้จากที่ 135 000 g สำหรับ 1 ชั่วโมงที่ + 4 ° C เม็ด melanosomal การกู้คืน และถูกระงับลงใน 50 มม.ทริสเรทติ้ง HCl 150 mM KCl บัฟเฟอร์ (pH 7.40) ใหม่ และผลิตภัณฑ์ใหม่ในการไล่ระดับสี OptiPrep® อื่น หลังจากการหมุนเหวี่ยงไล่ระดับสอง melanosomes ได้ถูกระงับลงในบัฟเฟอร์ MES (25mm MES, 5 มม. NaCl, KCl, 1.3 มม. MgSO4, 115 มม. pH 7.40) ใหม่ และตกค้างของ OptiPrep® ถูกลบ โดยสอง 10 000 g centrifugations โดยวัดความเข้มข้นของโปรตีนทั้งหมดของ melanosomal บริสุทธิ์เศษส่วน ด้วยวิธีแบรดฟอร์ด

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

melanosomes ถูกแยกโดยใช้OptiPrep®ความหนาแน่นของการไล่ระดับสีหมุนเหวี่ยง (รูปที่ 1) เนื้อเยื่อ RPE ถ​​ูกละลายน้ำแข็งและระงับลงใน hypotonic บัฟเฟอร์ที่มีสารยับยั้ง เซลล์กระจัดกระจายกับโพรงอากาศไนโตรเจนที่ 450 ปอนด์ต่อตารางนิ้วด้วยเวลา 15 นาทีสมดุล lysate เซลล์ทั้งหมดถูกหมุนเหวี่ยงที่ 3000 กรัมเป็นเวลา 5 นาทีและใส (lysosomal น้ำมันดิบส่วน) จะถูกลบออกและเม็ดที่ 20 000 กรัมเป็นเวลา 20 นาที เม็ด melanosomal น้ำมันดิบเป็นอีกครั้งที่ถูกระงับลงในขนาด 50 มม Tris-HCl 150 มิลลิเมตร KCl บัฟเฟอร์ (pH 7.40) และชั้นบนของการไล่ระดับสีOptiPrep®ต่อเนื่อง หลอดไล่โทนสีถูกหมุนเหวี่ยงที่ 135 000 กรัมเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ + 4 องศาเซลเซียสเม็ด melanosomal หายและ re-ระงับลงในขนาด 50 มม Tris-HCl 150 มิลลิเมตร KCl บัฟเฟอร์ (pH 7.40) และ re-หมุนเหวี่ยงในการไล่ระดับสีOptiPrep®อื่น หลังจากที่ปั่นแยกลาดสอง melanosomes เป็นอีกครั้งที่เข้าระงับ MES บัฟเฟอร์ (25 มิลลิเมตร MES 5 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ 115 มิลลิโพแทสเซียมคลอไรด์ 1.3 มิลลิ MgSO4 ค่า pH 7.40) และสารตกค้างของOptiPrep®ถูกถอดออกโดยสอง 10 000 centrifugations กรัม ความเข้มข้นของโปรตีนรวมของส่วน melanosomal บริสุทธิ์ถูกวัดด้วยวิธี Bradford

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เมลาโนโซมถูกแยกใช้ optiprep ®ความหนาแน่นความลาด ดังนี้ ( ตารางที่ 1 ) การบ่งชี้เนื้อเยื่อถูกละลายน้ำแข็ง และพักงานเป็นไฮโพทอนิก บัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วยตัวยับยั้ง เซลล์มีการหยุดชะงักกับโพรงที่ 450 psi กับไนโตรเจน 15 นาที equilibration ครั้ง lysate เซลล์ทั้งระดับที่ 3 , 000 กรัมเป็นเวลา 5 นาทีและนำ ( ดิบ lysosomal เศษส่วน ) ถูกลบออกและอัดเม็ดที่ 20 , 000 G 20 นาที ดิบ melanosomal เม็ดเป็นอีกครั้งระงับเป็น 50 mm หรือ HCl 150 mm . บัฟเฟอร์ pH 7.40 ) และชั้นบนของความ optiprep ®ลาด . การไล่ระดับสีท่อ คือที่ระดับ 135 000 กรัม 1 H + 4 ° C เม็ด melanosomal ถูกกู้คืนและจะระงับลง 50 มม. โดย HCL 150 mm . บัฟเฟอร์ pH 7.40 ) และไฟฟ้าในอีกระดับ® optiprep . หลังจากปั่นไล่ระดับที่สอง เมลาโนโซมถูกระงับลงในบัฟเฟอร์เป็นเดือน ( 25 มิลลิเมตร เดือน 5 mM NaCl KCl , 115 มิลลิเมตร 1.3 มม. MgSO4 ใ พีเอช 7.40 ) และสารตกค้างของ optiprep ®ถูกลบออกโดยสอง 10 , 000 G centrifugations . โดยความเข้มข้นของสารละลายโปรตีนบริสุทธิ์ melanosomal เศษส่วนวัดด้วยวิธี แบรดฟอร์ด