Total nucleicacids were extracted f

Total nucleic
acids were extracted from the filters and planktonic cultures of the biotransformation
experiments (day 33) as described previously (16). Cells
were eluted from filters by suspension in 4 ml of lysis buffer (100 mM
Tris-HCl, 50 mM NaCl, 50 mM EDTA, pH 8.0) and vortexing for 2 min.
DNA was extracted from isolates as previously described by (16). PCR
amplifications were performed using primers F341-GC and R534 (17) for
bacteria and ITS3 with a GC clamp (sequence as for F341-GC) and ITS4
(18) for fungal denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis.
Primers 27F and 1492R (19) were used for amplifying the 16S rRNA gene
from bacterial isolates for partial sequencing by Sanger sequencing
(GATC Biotech, Germany).
All PCR amplifications were performed using a Gene Amp PCR system
9700 thermocycler (Applied Biosystems). Each 50-l PCR mixture
contained 50 to 100 ng of DNA, primers (0.4 M), deoxynucleoside
triphosphates (dNTPs) (0.1 mM), Taq polymerase (1.25 U) (Qiagen), and
1PCR buffer (Qiagen). For primers F341-GC and R534, thermocycling
consisted of 95°C for 5 min followed by 35 cycles of 95°C for 30 s, 57°C for
30 s, and 72°C for 1.5 min, ending with 72°C for 10 min. For primers 27F
and 1492R, cycling conditions consisted of 94°C for 5 min followed by 30
cycles of 94°C for 30 s, 57°C for 45 s, and 72°C for 90 s, ending with 72°C
for 10 min. For primers ITS3-GC and ITS4 cycling conditions consisted of
95°C for 2 min followed by 36 cycles of 94°C for 30 s, 55°C for 30 s, and
72°C for 1 min, with a final extension at 72°C for 5 min. PCR products
were analyzed on a 1% (wt/vol) 1 TAE (40 mM Tris base, 1 mM EDTA [pH 8]) agarose gel stained with ethidium bromide (10 mg ml1) and
viewed under UV transillumination (Alpha Innotech).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

รวม nucleicกรดที่ถูกสกัดจากตัวกรองและการเปลี่ยนรูปทางชีวภาพวัฒนธรรม planktonicทดลองการ (33 วัน) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (16) เซลล์ถูก eluted จากตัวกรอง โดยระบบกันสะเทือนใน 4 ml ของ lysis บัฟเฟอร์ (100 มมTris-HCl, NaCl, EDTA, 50 มม. 50 มม. pH 8.0) และ vortexing สำหรับ 2 นาทีดีเอ็นเอถูกแยกจากแยกอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดย (16) PCRamplifications ดำเนินการโดยใช้ไพรเมอร์ F341-GC และ R534 (17) สำหรับแบคทีเรียและ ITS3 ด้วยคีมหนีบ GC (ลำดับสำหรับ F341 GC) และ ITS4(18) สำหรับเชื้อราไล่ระดับ denaturing เจวิเคราะห์อิ (DGGE)ไพรเมอร์ 27F และ 1492R (19) ใช้สำหรับขยายยีน 16S rRNAจากเชื้อแบคทีเรียที่แยกได้สำหรับ sequencing บางส่วนโดย Sanger ลำดับ(GATC เทคโนโลยีชีวภาพ เยอรมนี)Amplifications PCR ทั้งหมดดำเนินการโดยใช้ระบบยีน Amp PCR9700 thermocycler (ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ) ส่วนผสม PCR แต่ละ 50 ลิตรมีอยู่ 50-100 ฉบับของดีเอ็นเอ ไพรเมอร์ (0.4 M), deoxynucleosidetriphosphates (dNTPs) (0.1 mM) Taq พอลิเมอเรส (1.25 U) (Qiagen), และ1 บัฟเฟอร์ PCR (Qiagen) สำหรับไพรเมอร์ F341-GC และ R534 เทอร์โม゚ประกอบด้วย 95° C เป็นเวลา 5 นาทีตาม ด้วยรอบ 35 95° c 30 s, 57° C สำหรับ30 s และ 72° C 1.5 นาที ลงท้าย ด้วย 72° C เป็นเวลา 10 นาที สำหรับไพรเมอร์ 27Fและขี่จักรยานเงื่อนไขที่ประกอบด้วย 1492R, 94° C เป็นเวลา 5 นาทีตาม ด้วย 30รอบที่ 94° C 30 s, 57° C 45 s และ 72° C 90 s, 72° C ที่สิ้นสุดสำหรับ 10 นาที สำหรับไพรเมอร์ ITS3-GC และ ITS4 ขี่จักรยานเงื่อนไขประกอบด้วย95° C เป็นเวลา 2 นาทีตาม ด้วยรอบ 36 94° c 30 s, 55° C 30 s และ72° C เป็นเวลา 1 นาที ขยาย 72° c สำหรับผลิตภัณฑ์ PCR 5 นาทีสุดท้ายได้วิเคราะห์แบบ 1% (wt/vol) 1 เจ agarose TAE (40 มม.ฐานทริสเรทติ้ง 1 mM EDTA [pH 8]) ย้อม ด้วยโบรไมด์ ethidium (มก. 10 มิลลิลิตร 1) และดูภายใต้ UV transillumination (อัลฟา Innotech)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

นิวคลีอิกรวม
กรดถูกสกัดจากฟิลเตอร์และวัฒนธรรม planktonic เปลี่ยนรูปทางชีวภาพของ
การทดลอง (วันที่ 33) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (16) เซลล์
ถูกชะจากตัวกรองโดยการระงับใน 4 มล. ของบัฟเฟอร์สลาย (100 มิลลิเมตร
Tris-HCl 50 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ 50 มิลลิ EDTA, ค่า pH 8.0) และ vortexing เป็นเวลา 2 นาที.
ดีเอ็นเอที่สกัดจากสายพันธุ์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดย (16) PCR
เครื่องขยายเสียงได้ดำเนินการโดยใช้ไพรเมอร์ F341-GC และ R534 (17) สำหรับ
เชื้อแบคทีเรียและ ITS3 กับยึด GC (ลำดับสำหรับ F341-GC) และ ITS4
(18) สำหรับเชื้อรา denaturing ลาด gel electrophoresis (DGGE) การวิเคราะห์.
ไพรเมอร์ 27 และ 1492R (19) ถูกนำมาใช้สำหรับการขยายยีน 16S rRNA
จากแบคทีเรียสำหรับลำดับบางส่วนโดยลำดับแซงเจอร์
(GATC ไบโอเทค, เยอรมนี).
ทั้งหมด PCR เครื่องขยายเสียงได้ดำเนินการโดยใช้ยีน Amp PCR ระบบ
9700 thermocycler (Applied Biosystems) แต่ละส่วนผสม 50-? L PCR
มี 50-100 NG ดีเอ็นเอไพรเมอร์ (0.4? m) deoxynucleoside
triphosphates (dNTPs) (0.1 มิลลิเมตร) Taq โพลิเมอร์ (1.25 U) (Qiagen) และ
1 PCR บัฟเฟอร์ (Qiagen) . สำหรับไพรเมอร์ F341-GC และ R534, thermocycling
ประกอบด้วย 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีตามด้วย 35 รอบจาก 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที, 57 ° C เป็นเวลา
30 วินาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1.5 นาที, ที่ลงท้ายด้วย 72 องศาเซลเซียส 10 นาที สำหรับไพรเมอร์ 27
และ 1492R เงื่อนไขการขี่จักรยานประกอบด้วย 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีตามด้วย 30
รอบจาก 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที, 57 ° C เป็นเวลา 45 วินาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 90 วินาที, ที่ลงท้ายด้วย 72 องศาเซลเซียส
เป็นเวลา 10 นาที สำหรับไพรเมอร์ ITS3-GC และ ITS4 เงื่อนไขการขี่จักรยานประกอบด้วย
95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีตามด้วย 36 รอบจาก 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที, 55 ° C เป็นเวลา 30 วินาทีและ
72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีที่มีนามสกุลสุดท้ายที่ 72 ° C เป็นเวลา 5 นาที ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์
ถูกนำมาวิเคราะห์ใน 1% (น้ำหนัก / ปริมาตร) 1? TAE (40 มิลลิเมตร Tris ฐาน 1 มิ EDTA [ค่า pH 8]) agarose เจลย้อมด้วย ethidium bromide (10 มก. มล. 1) และ
ดูภายใต้ transillumination UV (อัลฟา Innotech)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

รวมโครงการกรดที่สกัดจากสิ่งมีชีวิตขนาดเล็กมากในน้ำกรอง และ วัฒนธรรมของการการทดลอง ( 33 วัน ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( 16 ) เซลล์มีตัวอย่างจากใน 4 มิลลิลิตร กรองด้วยการระงับการสลายบัฟเฟอร์ ( 100 มม.บริษัท HCl , เกลือ 50 mm , 50 mM EDTA pH 8.0 ) และ vortexing เป็นเวลา 2 นาทีดีเอ็นเอจากเชื้อตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า ( 16 ) ดีเอ็นเอamplifications การใช้ไพรเมอร์และ f341-gc r534 ( 17 )แบคทีเรียและ its3 กับ GC หนีบ ( ลำดับสำหรับ f341-gc ) และ its4( 18 ) สำหรับเชื้อราี่ลาด gel electrophoresis ( การทดลอง ) วิเคราะห์ไพรเมอร์และ 27f 1492r ( 19 ) ใช้สำหรับ amplifying 16S rRNA ยีนจากเชื้อที่แยกได้ในบางส่วน โดยการเรียงลำดับ แซงเกอร์( gatc Biotech , เยอรมัน )amplifications PCR มีการปฏิบัติใช้ระบบตรวจยีนจำกัด9700 เทอร์มอไซเคล ์ ( Applied Biosystems ) แต่ละ 50-l เทคนิคผสมที่อยู่ 50 ถึง 100 นาโนดีเอ็นเอไพรเมอร์ ( 0.4 เมตร ) deoxynucleosideไตรฟ เฟต ( dntps ) ( 0.1 mm ) , แท็กการ ( 1.25 u ) ( เพิ่ม )1pcr บัฟเฟอร์ ( เพิ่ม ) สำหรับ f341-gc r534 ไพรเมอร์และผื่นแดง ,จำนวน 95 องศา C เป็นเวลา 5 นาที ตามด้วย 35 รอบ 95 องศา C 30 , 57 องศา C สำหรับ30 , และ 72 ° C เป็นเวลา 1.5 นาที จบด้วย 72 ° C เป็นเวลา 10 นาที สำหรับไพรเมอร์ 27fและ 1492r สภาพจักรยานจำนวน 94 ° C เป็นเวลา 5 นาที ตามด้วย 30วงจรของ 94 ° C 30 , 57 องศา C เป็นเวลา 45 วินาที และ 72 ° C เป็นเวลา 90 วินาที กับ 72 ° C , สิ้นสุด10 นาที และไพรเมอร์ its3-gc its4 สภาพจักรยานประกอบด้วย95 องศา C เป็นเวลา 2 นาที ตามด้วย 36 รอบ 94 ° C 30 S 55 ° C เป็นเวลา 30 วินาที และ72 ° C เป็นเวลา 1 นาทีด้วยส่วนขยายสุดท้ายที่ 72 ° C เป็นเวลา 5 นาที โดยผลิตภัณฑ์ข้อมูลที่ 1 % ( น้ำหนัก / ปริมาตร ) แท ( 40 มม. นอกจากนี้ ฐาน 1 mM EDTA pH [ 8 ] ) เจลเปื้อนทิเดียมโบรไมด์ ( 10 มิลลิกรัม ml1 ) และดูใน transillumination UV ( เป็นชุด )