DNA was extracted from FRESH undist

DNA was extracted from FRESH undisturbed soil using the FastDNA®SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals) and amplified using the primer sets reported in Table 2. For Archaea phylum we used two different primer sets: 1106F/1378R targeting methanogenic as well non-methanogenic archaeal 16S rRNA genes (Feng et al., 2013) was used to detect soil archaeal community whereas 0357F/0691R more specific for methanogenic Archaea 16S rRNA genes, was used to detect soil methanogenic community. Amplification reactions were carried out in a MJ Research PTC- 200™ thermocycler (Bio-Rad) in a 25-ml mixture containing 2 ml of template DNA, 1.5 mmol L 1 MgCl2, 200 mmol L 1 of each deoxynucleotide triphosphate (dNTP) (Promega Corporation), 10 pmol of each primer (TIB MolBiol), 1 green GoTaq®flexi buffer (Promega), 1 U of GoTaq®polymerase (Promega), under reaction conditions of 94 C for 4 min followed by 35 cycles of denaturation at 95 C for 45 s, annealing (specific temperature are reported Table 2) for 45 s, extension at 72 C for 45 s, and final extension at 72 C for 7 min. Three independent PCR amplifications were performed for each primer set and each soil sample and the triplicate amplification products were pooled to minimize the effect of PCR biases. Amplicon yields were estimated by comparison of amplified DNA to Low DNA mass ladder (Invitrogen) using the Chemidoc Apparatus
(Bio-Rad). DGGEs were performed loading 500 ng of amplicons onto a polyacrylamide gel (acrylamide/bis 37,5:1; Euroclone), with a linear denaturing gradients obtained with an 100% denaturing solution containing 40% formamide (Euroclone) and 7 M Urea (Euroclone). The gels were run for 17 h in 1X TAE buffer at constant voltage (80 V) and temperature (60 C), using the INGENY phorU-2 System (Ingeny International BV). At the end, gels were stained with SYBR®GOLD (Molecular Probes) diluted 1:1000 in 1 TAE and the gel images digitalized using the Chemidoc Apparatus.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ดีเอ็นเอที่สกัดจากดินอีกสดใช้ชุด FastDNA ®หมุนดิน (MP Biomedicals) และขยายการใช้ชุดพื้นที่รายงานในตารางที่ 2 ไฟลัมอาร์เคียเราใช้รองพื้นแตกต่างกันสองชุด: 1106F/1378R methanogenic กำหนดเป้าหมายเช่นไม่ methanogenic archaeal 16S rRNA ยีน (Feng et al., 2013) ถูกใช้เพื่อตรวจสอบดิน archaeal ชุมชน โดยเฉพาะสำหรับยีน methanogenic อาร์เคีย 16S rRNA, 0357F/0691R ใช้ในการตรวจสอบดิน methanogenic ชุมชน ปฏิกิริยาขยายได้ดำเนินการ thermocycler ™ MJ วิจัย PTC - 200 (ไบ-Rad) ในมล 2 แม่แบบดีเอ็นเอ mmol 1.5 MgCl2 L 1, 200 mmol L 1 ของแต่ละ deoxynucleotide โนซีนไตรฟอสเฟต (dNTP) (Promega Corporation), 10 pmol (TIB MolBiol), แต่ละพื้นที่ประกอบด้วยส่วนผสม 25 ml 1 สีเขียว GoTaq ® flexi บัฟเฟอร์ (Promega) 1 U GoTaq ®พอลิเมอเรส (Promega), ภายใต้เงื่อนไขปฏิกิริยา C 94 สำหรับตามรอบ 35 ของ denaturation ที่ 95 C สำหรับ 45 นาที 4 s การอบเหนียว (มีอุณหภูมิเฉพาะรายงานตารางที่ 2) สำหรับ 45 s, 72 C สำหรับ 45 s และส่วนขยายสุดท้ายที่ 72 C สำหรับ 7 นาที Amplifications PCR อิสระสามได้ดำเนินการสำหรับแต่ละชุดสีรองพื้น และผลิตภัณฑ์ขยาย triplicate และแต่ละตัวอย่างดินถูกทางถูกพูเพื่อลดผลของ PCR ยอม Amplicon อัตราผลตอบแทนที่ประเมิน โดยการเปรียบเทียบดีเอ็นเอที่เอาต์ไป DNA ต่ำโดยรวมบันได (Invitrogen) โดยใช้เครื่อง Chemidoc(ไบโอ-Rad) DGGEs ดำเนินการโหลด 500 ng amplicons บนเจ polyacrylamide (อะคริลา ไมด์/bis 37, 5:1 Euroclone), มีการเส้น denaturing ไล่ระดับสีได้ 100% denaturing โซลูชันประกอบด้วย formamide 40% (Euroclone) และยูเรีย M 7 (Euroclone) เจถูกเรียกใช้สำหรับ h 17 ในบัฟเฟอร์เต้ X 1 ที่แรงดันไฟฟ้าคง (80 V) และอุณหภูมิ (60 C), ใช้ระบบ phorU 2 INGENY (Ingeny นานาชาติ BV) ในตอนท้าย เจมีสี ด้วย 1:1000 แตกออก SYBR ®ทอง (Probes โมเลกุล) เต้ 1 และเจรูปภาพดิจิทัลโดยใช้เครื่อง Chemidoc

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ดีเอ็นเอที่สกัดจากดินที่ไม่ถูกรบกวนสดโดยใช้FastDNA®SPINชุดดิน (MP Biomedicals) และขยายการใช้ชุดไพรเมอร์ที่มีการรายงานในตารางที่ 2 สำหรับเคีประเภทที่เราใช้สองชุดไพรเมอร์ที่แตกต่างกัน 1106F / 1378R กำหนดเป้าหมายมีเทนเช่นเดียวกับที่ไม่มีเทน archaeal ยีน 16S rRNA (ฮ et al., 2013) ถูกนำมาใช้ในการตรวจสอบดินในขณะที่ชุมชน archaeal 0357F / 0691R เฉพาะเจาะจงมากขึ้นสำหรับมีเทนเคียีน 16S rRNA ถูกนำมาใช้ในการตรวจสอบดินชุมชนมีเทน ปฏิกิริยาขยายได้ดำเนินการใน MJ วิจัย PTC- 200 ™ thermocycler (Bio-Rad) ในส่วนผสม 25 มล. มี 2 มิลลิลิตรดีเอ็นเอแม่แบบ 1.5 มิลลิโมล L 1 MgCl2 200 มิลลิโมล L 1 ของแต่ละ deoxynucleotide triphosphate (dNTP) ( Promega คอร์ปอเรชั่น), 10 pmol ของแต่ละไพรเมอร์ (TIB MolBiol) บัฟเฟอร์GoTaq®flexi 1 สีเขียว (Promega) 1 ยูGoTaq®polymerase (Promega) ภายใต้เงื่อนไขการเกิดปฏิกิริยาของ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 4 นาที 35 ตามด้วยรอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 45 วินาที, การอบ (อุณหภูมิที่ระบุจะมีการรายงานตารางที่ 2) เป็นเวลา 45 วินาที, นามสกุลที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 45 วินาที, และการขยายสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 7 นาที สามเครื่องขยายเสียงที่เป็นอิสระ PCR ได้ดำเนินการสำหรับแต่ละไพรเมอร์ตั้งค่าและตัวอย่างดินในแต่ละผลิตภัณฑ์และการขยายเพิ่มขึ้นสามเท่าถูกรวบรวมเพื่อลดผลกระทบจากอคติ PCR อัตราผลตอบแทนอยู่ที่ประมาณ Amplicon โดยเปรียบเทียบดีเอ็นเอขยายไปยังขั้นบันไดมวลดีเอ็นเอต่ำ (Invitrogen) โดยใช้เครื่องมือ Chemidoc
(Bio-Rad) DGGEs ได้ดำเนินการโหลด 500 นาโนกรัมของ amplicons บนเจลอะคริเลต (ที่ริลาไมด์ / ทวิ 37,5: 1; Euroclone) กับการไล่ระดับสี denaturing เชิงเส้นได้รับกับวิธีการแก้ปัญหาเสียสภาพ 100% มี 40% formamide (Euroclone) และ 7 M ยูเรีย (Euroclone ) เจลถูกเรียกใช้สำหรับ 17 ชั่วโมงในบัฟเฟอร์ 1X TAE ที่แรงดันคงที่ (80 V) และอุณหภูมิ (60 C) โดยใช้ INGENY phorU-2 ระบบ (Ingeny International BV) ในตอนท้ายเจลถูกย้อมด้วยสีSYBR®GOLD (วัดระดับโมเลกุล) เจือจาง 1: 1,000 ใน 1 TAE และภาพเจล digitalized ใช้เครื่องมือ Chemidoc

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ดีเอ็นเอจากดินสดใช้ fastdna ®ปั่นชุดดิน ( MP biomedicals ) และขยายการใช้ไพรเมอร์ชุดรายงานในตารางที่ 2 สำหรับอาร์เคียไฟลัมเราใช้สองชุดไพรเมอร์ที่แตกต่างกัน : 1106f / 1378r เป้าหมายจุลินทรีย์จุลินทรีย์เช่นกัน ไม่ archaeal เบส 16S rRNA ยีน ( ฟง et al . ,