2.2. Enzyme extraction and assaysHo

2.2. Enzyme extraction and assays
Homogenized samples of soil or litter material were extracted at
4 ◦C for 2 h on an orbital shaker (100 rpm) with 100mMphosphate
buffer, pH 7 (16:1 w/v), filtered through Whatman #5 filter paper
and desalted using PD-10 desalting columns (Pharmacia, Sweden),
according to the supplier’s protocol, to remove inhibitory smallmolecular-
mass compounds. The desalted samples were kept at
−18 ◦C until enzyme activity analysis.
Laccase (EC 1.10.3.2) activity was measured by monitoring
the oxidation of ABTS (2,2_-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-
6-sulfonic acid) in a citrate–phosphate buffer (100mM citrate,
200mM phosphate, pH 5.0) at 420nm (Bourbonnais
and Paice, 1990). Manganese peroxidase (MnP, EC 1.11.1.13)
was assayed using a succinate–lactate buffer (100mM, pH
4.5) according to the protocol of Ngo and Lenhoff (1980).
MBTH(3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone) andDMAB(3,3-
dimethylaminobenzoic acid) were oxidatively coupled by the
enzymes, and the resulting purple indamine dye was detected
spectrophotometrically at 595 nm. The results were corrected by
the activities of the samples without manganese (for MnP)—the
addition of manganese sulfate was substituted by an equimolar
amount of ethylenediaminetetraacetate (EDTA). One unit of
enzyme activity was defined as the amount of enzyme forming
1_mol of reaction product per min.
The activities of endo-1,4-_-glucanase (EC 3.2.1.4) and endo-
1,4-_-xylanase (EC 3.2.1.8) were measured with azo-dyed
carbohydrate substrates (carboxymethyl cellulose and birchwood
xylan, respectively) using the protocol of the supplier (Megazyme,
Ireland). The reaction mixture contained 0.2 mlof2%dyed substrate
in a 200mMsodium acetate buffer (pH 5.0) and 0.2 ml sample. The
reaction mixture was incubated at 40 ◦C for 60 min. The reaction
was stopped by adding 1ml of ethanol followed by 10 s of vortexing
and 10 min of centrifugation (10,000×g) (Valaˇskova et al.,
2007). The amount of released dye was measured at 595 nm, and
the enzyme activity was calculated according to standard curves
correlating the dye release with the release of reducing sugars.
One unit of enzyme activity was defined as the amount of enzyme
releasing 1_mol of reducing sugars per min.
Cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) was assayed in microplates
using p-nitrophenyl-_-d-cellobioside (PNPC). The reaction mixture
contained 0.16 ml of 1.2mM PNPC in 50mM sodium acetate
buffer (pH 5.0) and 0.04 ml of sample. Reaction mixtures were
incubated at 40 ◦C for 90–120 min. Reactions were stopped by
adding 0.1 ml of 0.5M sodium carbonate, and the absorbance
at 400nm was measured. 1,4-_-glucosidase (EC 3.2.1.21), 1,4-
_-xylosidase (EC 3.2.1.37) and 1,4-_-N-acetylglucosaminidase
(chitinase; EC 3.2.1.52) were assayed using p-nitrophenyl-_-
d-glucoside, p-nitrophenyl-_-d-xyloside and p-nitrophenyl-Nacetyl-
_-d-glucosaminide, respectively, using the same method as
above (Valaˇskova et al., 2007). Acid phosphatase (EC 3.1.3.1) was
assayed using 2 g l−1 p-nitrophenylphosphate in a 50mM sodium
acetate buffer (pH 5.0), as described previously (ˇSnajdr et al.,
2008a). One unit of enzyme activity was defined as the amount of
enzyme releasing 1_mol of p-nitrophenol per min. All spectrophotometric
measurements were done in amicroplate reader (Sunrise,
Tecan) or a UV–VIS spectrophotometer (Lambda 11, Perkin-Elmer)
and expressed per gram of dry mass of the soil or litter material.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2 การสกัดเอนไซม์และการตรวจ
ตัวอย่างหดหายของดินหรือวัสดุครอกถูกสกัดที่
4 ◦ C เป็นเวลา 2 ชั่วโมงเมื่อโคจรปั่น (100 รอบต่อนาที) กับ 100mmphosphate
บัฟเฟอร์ pH 7 (16:01 w / v), กรองผ่าน Whatman #
5 กระดาษกรองและ desalted ใช้ PD-10 คอลัมน์ desalting (Pharmacia, สวีเดน),
ตามโปรโตคอลของซัพพลายเออร์เพื่อลบสารประกอบ smallmolecular-
มวลยับยั้งตัวอย่าง desalted ถูกเก็บไว้ที่ -18
◦ C จนการวิเคราะห์กิจกรรมของเอนไซม์.
กิจกรรมเอนไซม์แลคเคส (EC 1.10.3.2) โดยวัดจากการตรวจสอบ
ออกซิเดชันของ ABTS (2,2-_ azinobis-3-ethylbenzothiazoline-
6 กรดซัลโฟ ) ในบัฟเฟอร์ซิเตรตฟอสเฟต (citrate 100mm, 200mm
ฟอสเฟต, pH 5.0) ที่ 420nm (แบรดลี
และ Paice, 1990) แมงกานีส peroxidase (MNP, EC 1.11.1.13)
ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้บัฟเฟอร์ succinate แลคเตต (ph, 100mm
4.5) ตามโปรโตคอลขององค์กรพัฒนาเอกชนและ lenhoff (1980)
mbth (3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone) anddmab. (3,3 -
กรด dimethylaminobenzoic) เป็น ควบคู่ออกซิเจนโดยเอนไซม์
และสีย้อมสีม่วง indamine ส่งผลให้ถูกตรวจพบ
spectrophotometrically ที่ 595 นาโนเมตร ผลที่ได้รับการแก้ไขโดย
กิจกรรมของกลุ่มตัวอย่างโดยไม่ต้องแมงกานีส (สำหรับ MNP) นอกจากนี้
แมงกานีสซัลเฟตถูกสับเปลี่ยนตามจำนวนเงิน
equimolar ของ ethylenediaminetetraacetate (EDTA) หน่วยหนึ่งของกิจกรรมของเอนไซม์
ถูกกำหนดเป็นจำนวนของเอนไซม์สร้าง 1_mol
ของผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาต่อนาที.
กิจกรรมของ Endo-1 ,4-_-glucanase (EC 3.2.1.4) และ Endo-
1,4-_ -ไซลาเนส (EC 3.2.1.8) มีวัดที่มี azo ย้อม
พื้นผิวคาร์โบไฮเดรต (Carboxymethyl เซลลูโลสและไซแลน Birchwood
ตามลำดับ) โดยใช้โปรโตคอลของการจัดหา (megazyme
ไอร์แลนด์) ผสมปฏิกิริยาที่มีสารตั้งต้นที่ 0.2%
mlof2 ย้อมในซีเทตบัฟเฟอร์ 200mmsodium (pH 5.0) และตัวอย่าง มล. 0.2 ผสมปฏิกิริยา
ถูกบ่มที่อุณหภูมิ 40 ◦ C เป็นเวลา 60 นาที
ปฏิกิริยาก็หยุดโดยการเพิ่ม 1ml ของเอทานอลตามด้วย 10 ของ vortexing
และ 10 นาทีของการหมุนเหวี่ยง (10,000 × g) (valaskova et al.
2007) ปริมาณของสีย้อมที่ปล่อยออกมาเป็นวัดที่ 595 นาโนเมตรและ
เอนไซม์ที่คำนวณตามเส้นโค้งมาตรฐานเทียบเคียง
ปล่อยย้อมด้วยความเป็นอิสระของการลดน้ำตาล.
หน่วยหนึ่งของกิจกรรมของเอนไซม์ถูกกำหนดเป็นจำนวนของเอนไซม์
ปล่อย 1_mol ของการลดน้ำตาลต่อนาที.
cellobiohydrolase (EC 3.2.191) ได้รับการวิเคราะห์ใน microplates
ใช้ p-nitrophenyl-_-D-cellobioside (pnpc)
ผสมปฏิกิริยาที่มี 0.16 มิลลิลิตร pnpc 1.2mm ในน้ำนมโซเดียม 50mm บัฟเฟอร์
(pH 5.0) และ 0.04 มิลลิลิตร ผสมปฏิกิริยาถูก
บ่มที่อุณหภูมิ 40 ◦ C เป็นเวลา 90-120 นาที ปฏิกิริยาที่ถูกหยุดการทำงานโดย
เพิ่ม 0.1 มล. ของโซเดียมคาร์บอเนต 0.5m และ
การดูดกลืนแสงที่ 400nm วัด 1,4-_-glucosidase (EC 3.2.1.21), 1,4 -
_-xylosidase (EC 3.2.1.37) และ 1,4-_-n-acetylglucosaminidase
(ไคติเนส; EC 3.2.1.52) ถูก assayed ใช้ p-nitrophenyl-_-
d-glucoside, p-nitrophenyl-_-D- xyloside และ p-nitrophenyl-nacetyl-
_-D-glucosaminide ตามลำดับโดยใช้วิธีการเช่นเดียวกับข้างต้น
(valaskova et al., 2007) กรดฟอส (EC 3.1.3.1) เป็น
assayed ใช้ 2 GL-1 p nitrophenylphosphate-50mm โซเดียมในซีเทตบัฟเฟอร์
(pH 50) ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (snajdr et al.
2008A) หน่วยหนึ่งของกิจกรรมของเอนไซม์ที่ถูกกำหนดให้เป็นจำนวน
1_mol ปล่อยเอนไซม์ p-nitrophenol ต่อนาที ทุกวัด
spectrophotometric ได้ทำใน amicroplate ผู้อ่าน (พระอาทิตย์ขึ้น
tecan) หรือวัสดุ UV-Vis (แลมบ์ดา 11, Perkin-Elmer)
และแสดงต่อกรัมของมวลแห้งของดินหรือวัสดุครอก.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2. เอนไซม์สกัดและ assays
ตัวอย่างดินหรือแคร่ Homogenized ถูกสกัดที่
◦C 4 สำหรับ h 2 ในเชคเกอร์ของวงโคจรที่ (100 รอบต่อนาที) ด้วย 100mMphosphate
บัฟเฟอร์ ค่า pH 7 (16:1 w/v), กรองโดยใช้กระดาษกรอง #5 Whatman
และ desalted ใช้ PD-10 คอลัมน์ desalting (Pharmacia สวีเดน),
ตามโพรโทคอของซัพพลายเออร์ การเอาลิปกลอสไข smallmolecular-
มวลสาร ตัวอย่าง desalted ได้เก็บไว้ที่
−18 ◦C จนวิเคราะห์กิจกรรมเอนไซม์
กิจกรรม Laccase (EC 1.10.3.2) ถูกวัด โดยการตรวจสอบ
ออกซิเดชันของรเรียน (2,2_-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-
6-sulfonic กรด) ในบัฟเฟอร์ citrate–phosphate (100 มม.ซิเตรต,
ฟอสเฟต 200mM ค่า pH 5.0) ที่ 420nm (Bourbonnais
และ Paice, 1990) แมงกานีส peroxidase (MnP, EC 1.11.1.13)
ถูก assayed ใช้บัฟเฟอร์ succinate–lactate (100 มม. ค่า pH
4.5) ตามโพรโทคอลของ Ngo และ Lenhoff (1980) .
andDMAB MBTH (3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone) (3,3-
dimethylaminobenzoic กรด) ถูกควบคู่ oxidatively โดย
เอนไซม์ และย้อมสีม่วง indamine ได้พบ
spectrophotometrically ที่ 595 nm ผลได้รับการแก้ไขโดย
กิจกรรมตัวอย่างโดยแมงกานีส (สำหรับ MnP) — การ
แห่งแมงกานีสซัลเฟตถูกแทน โดยการ equimolar
จำนวน ethylenediaminetetraacetate (EDTA) หนึ่งหน่วย
เอนไซม์ถูกกำหนดเป็นยอดของเอนไซม์
1_mol ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาต่อนาที
กิจกรรมของ endo-1,4-_-คัด (EC 3.2.1.4) และ endo-
1 ไซลา 4-_-เนส (EC 3.2.1.8) ถูกวัด ด้วยย้อม azo
พื้นผิวของคาร์โบไฮเดรต (carboxymethyl เซลลูโลสและเบิร์ชวู้ด
xylan ตามลำดับ) โดยใช้โพรโทคอลของซัพพลายเออร์ (Megazyme,
ไอร์แลนด์) ปฏิกิริยาผสมอยู่ 0.2% ของ mlof2 ที่ย้อมพื้นผิว
200mMsodium acetate บัฟเฟอร์ (pH 5.0) และตัวอย่าง 0.2 ml ใน
ผสมปฏิกิริยาถูก incubated ที่ ◦C 40 สำหรับ 60 นาที ปฏิกิริยา
ถูกหยุดลง โดยเพิ่ม 1ml ของเอทานอลตาม ด้วย 10 ของ vortexing
และ 10 นาทีของ centrifugation (10, 000 ซื้อ g) (Valaˇskova et al.,
2007) จำนวนสีที่ออกที่วัดที่ 595 nm และ
เอนไซม์จะถูกคำนวณตามเส้นโค้งมาตรฐาน
กำลังรวบรวมนำย้อม ด้วยลดน้ำตาล
หน่วยหนึ่งของเอนไซม์ถูกกำหนดเป็นจำนวนเอนไซม์
ปล่อย 1_mol ลดน้ำตาลต่อนาที
Cellobiohydrolase (EC 3.2.191) ถูก assayed ใน microplates
ใช้ p-nitrophenyl-_-d-cellobioside (PNPC) ผสมปฏิกิริยา
อยู่ 0.16 มล. 1.2 มม. PNPC acetate โซเดียม 50 มม.ใน
บัฟเฟอร์ (pH 5.0) และ 0.04 ml ของตัวอย่าง มีส่วนผสมของปฏิกิริยา
incubated ที่ ◦C 40 สำหรับปฏิกิริยาต่ำสุดได้หยุดโดย 90–120
เพิ่ม 0.1 มล. 0.5M โซเดียมคาร์บอเนต และ absorbance ที่
ที่ 400nm ที่วัด 1,4-_-glucosidase (EC 3.2.1.21), 1,4-
_-xylosidase (EC 3.2.1.37) และ
(chitinase; 1,4-_-N-acetylglucosaminidase EC 3.2.1.52) ถูก assayed ใช้ p-nitrophenyl-_-
d glucoside, p-nitrophenyl-_-d-xyloside และ p-nitrophenyl-Nacetyl-
_-d-glucosaminide ตามลำดับ ใช้วิธีการเดียวกันเป็น
ข้างบน (Valaˇskova et al., 2007) กรดฟอสฟาเตส (EC 3.1.3.1) ถูก
assayed ใช้ 2 g l−1 p nitrophenylphosphate ในเกลือแร่ 50mM
acetate บัฟเฟอร์ (pH 50), ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (ˇSnajdr et al.,
2008a) หน่วยหนึ่งของเอนไซม์ถูกกำหนดเป็นจำนวน
เอนไซม์ปล่อย 1_mol ของ p-nitrophenol ต่อนาที ทั้งหมด spectrophotometric
วัดทำใน amicroplate อ่าน (ซันไรส์,
Tecan) หรือ UV–VIS เครื่องทดสอบกรดด่าง (แลมบ์ดา 11 เพอร์เอลเมอ)
และแสดงต่อกรัมของมวลแห้งของวัสดุดินหรือแคร่

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2 . เอนไซม์การขุดเจาะและ assays
สดพร่องมันเนยเป็นตัวอย่างของดินหรือวัสดุเชื่อมต่อในเปลหามออกมาเป็นที่ 4 ◦c
สำหรับ 2 ชั่วโมงบนเครื่องเขย่าที่เกี่ยวกับการโคจร( 100 รอบต่อนาที) 100 mmphosphate
buffer , pH 7 ( 16 : 1 w / v ),ที่กรองแล้วผ่าน whatman # 5 ถ้วยกรองกระดาษ
และ desalted โดยใช้ PD desalting 10 คอลัมน์(ในบริเวณใกล้เคียงใน,สวีเดน),
ตามที่ผู้จัดให้บริการของโปรโตคอล,การถอด inhibitory smallmolecular -
มวลชนสารประกอบ.ที่ desalted ตัวอย่างเป็นที่
- 18 ◦c จนกว่าการทำงานของเอนไซม์การวิเคราะห์
laccase ( EC 1.10.3.2 )กิจกรรมวัดได้จากการติดตาม
ซึ่งจะช่วยให้ออกซิไดส์การ abts ( 2,2 _ - azinobis - 3 - ethylbenzothiazoline -
6 - sulfonic กรด)ใน citrate - ฟอสเฟต Buffer ( 100 มม. citrate ,
ฟอสเฟต 200 มม., pH 5.0 )ที่ 420 nm ( bourbonnais
และ paice , 1990 ) แมงกานีส, peroxidase (ลิงค์ ภายนอก MNP EC 1.11.1.13 )
ก็เพียรพยายามโดยใช้ succinate - lactate Buffer ( 100 มม., pH
4.5 )ตามที่โปรโตคอล(กป.อพช.)และ lenhoff ( 1980 )..
mbth ( 3 - ไม 2 - benzothiazolinone hydrazone ) anddmab ( 3,3 -
dimethylaminobenzoic กรด)เป็น oxidatively ประกอบโดย
เอ็นไซม์,และส่งผลให้สีม่วงสีย้อม indamine ตรวจพบว่า
spectrophotometrically ที่ 595 นิวตันเมตร ผลที่ได้จะได้รับการแก้ไขโดย
ตามมาตรฐานกิจกรรมต่างๆที่ของตัวอย่างที่ไม่มีแมงกานีส,(สำหรับลิงค์ ภายนอก MNP ) - จุนสี
ซึ่งจะช่วยเพิ่มการแมงกานีส,ที่ถูกแทนที่โดย equimolar
จำนวนของ ethylenediaminetetraacetate ( edta ) หนึ่งชุดของเอนไซม์
ซึ่งจะช่วยกิจกรรมถูกกำหนดเป็นจำนวนเงินของเอนไซม์สร้าง
1 _mol จากปฏิกิริยาของ ผลิตภัณฑ์ ต่อนาที
กิจกรรมของ Endo -1,4 - ,_, - glucanase ( EC 3.2.1.4 )และ Endo -
1,4 - ,_, - xylanase ( EC 3.2.1.8 )วัดด้วย azo - ย้อม
substrates คาร์โบไฮเดรต(เซลลูโลส carboxymethyl และ birchwood
xylan ตามลำดับ)โดยใช้โปรโตคอลของผู้จัดให้บริการ( megazyme
ไอร์แลนด์เหนือ) การผสมผสานกันระหว่างการตอบสนองที่มีอยู่ 0.2 mlof 2% ย้อมสีสาร
ใน 200 mmsodium เช่นอะคีเทต Buffer ( PH 5.0 )และ 0.2 ตัวอย่างมล. การผสมผสานกันระหว่าง
ปฏิกริยาดังกล่าวถูก incubated ที่ 40 ◦c สำหรับ 60 นาทีปฏิกริยาที่
หยุดโดยการเพิ่ม 1 มล.ของเอทานอลตามด้วย 10 S ของ vortexing
และ 10 นาทีของผลิต( 10 , 000 X กรัม)( valaˇskova et al .
2007 ) จำนวนของออกสีย้อมวัดได้ 595 nm ,และ
ซึ่งจะช่วยให้การทำงานของเอนไซม์จะคำนวณตามมาตรฐานตามความโค้งมน
ซึ่งจะช่วยให้สีย้อม correlating วางด้วยการลดน้ำตาล.
หนึ่งชุดของเอนไซม์กิจกรรมถูกกำหนดเป็นจำนวนเงินของเอนไซม์
ปล่อย 1 _mol ของการลดน้ำตาลต่อนาที
cellobiohydrolase ( EC 3.2.1 .91 )ได้เพียรพยายามใน microplates
การใช้ P - nitrophenyl - ,_, - D - cellobioside ( pnpc ) ปฏิกริยาที่ผสมผสาน
มีอยู่ 0.16 มล.ของ 1.2 มม. pnpc ใน 50 เช่นอะคีเทต(มม.
Buffer ( PH 5.0 )และ 0.04 มล.ของตัวอย่าง ส่วนผสมการตอบสนองเป็น
incubated ที่ 40 ◦c สำหรับ 90-120 ปฏิกิริยานาทีก็หยุดโดย
ซึ่งจะช่วยเพิ่ม 0.1 มล.ของแมกนีเซียมคาร์บอเนตหรือ 0.5 ม.(และ absorbance ที่
ที่ 400 nm วัดได้ 1,4 - ,_, - glucosidase ( EC 3.2.1.21 ) 1,4 -
___ - xylosidase ( EC 3.2.1.37 )และ 1,4 - ,_, - n - acetylglucosaminidase
( chitinase ; EC 3.2.1.52 )ได้เพียรพยายามใช้ P - nitrophenyl - ,_, -
D - glucoside , P - nitrophenyl - ,_, - D - xyloside และ P - nitrophenyl - nacetyl -
___ - D - glucosaminide ,ตามลำดับโดยใช้วิธีการเดียวกันเป็น
เหนือ( valaˇskova et al ., 2007 ) แบตเตอรี่ชนิดตะกั่วกรดแบบซีล phosphatase ( EC 3.1.3.1 )เป็น
เพียรพยายามโดยใช้ 2 G L - 1 P - nitrophenylphosphate ในบัฟเฟอร์ 50 มม.(
เช่นอะคีเทต( PH 50 )ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้( ˇsnajdr et al .
2008 ) หนึ่งชุดของเอนไซม์กิจกรรมถูกกำหนดเป็นจำนวนเงินของ
เอนไซม์การวาง 1 _mol ของ P - nitrophenol ต่อนาทีทั้งหมด spectrophotometric
ซึ่งจะช่วยการวัดได้ทำใน amicroplate เครื่องอ่าน(พระอาทิตย์ขึ้น,
tecan )หรือ UV - VIS ตรวจสอบ( lambda 11 , perkin-elmer )
และแสดงต่อกรัมของแห้งจำนวนมากของที่ดินหรือเสลี่ยงวัสดุ.