1. IntroductionThe genus Entamoeba

1. Introduction

The genus Entamoeba contains many species, six of which are found in the human intestinal tract: Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, Entamoeba moshkovskii, Entamoeba coli, Entamoeba hartmanni, and Entamoeba polecki. Of these species, only E. histolytica is associated with pathological injuries; the others are considered to be nonpathogenic species [1]. E. histolytica is responsible for approximately 50 million cases of amoebiasis worldwide each year, resulting in up to 100,000 deaths [2, 3]. Because of these characteristics, E. histolytica is globally considered to be a leading parasitic cause of human mortality [1]. However, historical epidemiological data concerning E. histolytica infections can lead to overestimates because they were obtained before the formal separation of this parasite into two morphologically identical species: the potentially pathogenic E. histolytica and the nonpathogenic E. dispar [4]. More importantly, it is also estimated that 90% of diagnosed infections are caused by E. dispar [5].

Diagnosis of E. histolytica has historically relied on microscopic examination of protozoan morphology. Optical microscopy is a very useful tool for the diagnosis of amoebiasis because it is simple and cheap to execute. However, concentration techniques and stained smears are required to increase its low sensitivity [1, 6]. It is also influenced by the intermittent release of cysts, requiring the examination of multiple samples from different days [7]. Moreover, this method cannot differentiate between morphologically identical species such as E. dispar and E. moshkovskii, and the proficiency of the examiner can also be crucial for precise identification, as other Entamoeba species can present structures very similar to the features of E. histolytica [2, 8, 9].

Entamoeba hartmanni is one of these species with similar morphological forms because its cysts share characteristics with those of the E. histolytica/E. dispar/E. moshkovskii complex. The major difference between these species is the size of the cysts, which in E. hartmanni are generally smaller than in those from the complex [4, 10]. For this differentiation to be conducted by microscopy, an appropriate microscope capable of performing morphometric analysis is also required. Given that, this organism can still be difficult to identify depending on the circumstances and the condition of the sample. Contractile trophozoites or cysts of E. histolytica can be erroneously identified as E. hartmanni, and larger structures of E. hartmanni can also be misdiagnosed as the pathogenic species. Alternative molecular methods could be helpful to provide accurate and reliable identification of Entamoeba species. Polymerase Chain Reaction (PCR), including real-time PCR, has provided the means to identify E. histolytica, E. dispar, and E. moshkovskii in a variety of samples [11–17]. However, little attention has been devoted to the possibility of identifying E. hartmanni, whose structures confuse examiners at different proficiency levels [8]. Previously, data determined by microscopic examination have demonstrated a prevalence of E. hartmanni of 13.3% in HIV patients and 2.5% in children in Brazilian groups [18, 19]. Identification of Entamoeba species other than the complex using molecular techniques has been conducted in only a single study in Brazil, in which the evaluation of Brazilian clinical samples previously identified as positive for the complex by microscopic examination demonstrated the presence of E. hartmanni DNA in more than one sample, while E. moshkovskii DNA was not detected among the samples analyzed [20]. These results showed the presence of E. hartmanni in Brazil but yielded no data about E. moshkovskii.

Real-time PCR is a very sensitive methodology that could become an important tool to achieve these goals, and SYBR Green (N′,N′-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine) technology with its probe-free assays is a less expensive choice for establishing more efficient protocols in developing countries [12]. Because of these possibilities, the objectives of this study were to standardize SYBR Green real-time PCR protocols for the identification of E. histolytica, E. dispar, and E. hartmanni and to evaluate their efficiency on clinical stool samples.

2. Material and Methods

2.1. DNA Samples

The positive controls used in the SYBR Green multiplex real-time PCR were genomic DNA from the standard strain of E. histolytica HM1-IMSS and E. dispar P2 (a strain isolated from patient samples in Piauí, Brazil). The DNA was measured in a Qubit fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), and 2-fold dilutions in water were prepared for testing using the SYBR Green real-time PCR protocol. For E. hartmanni, however, a cloning procedure was necessary to obtain a positive control because a protozoan culture of E. hartmanni was not available. For this process, positive DNA samples characterized in a previous study were used [20]. The specific E. hartmanni sequence was amplified with primers EhartF and EhartR2; this fragment was then cloned using the pCR 2.1-TOPO vector as described in the protocol with the pCR 2.1-TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen). The extraction and purification of plasmid DNA containing the cloned fragment were performed using the Illustra PlasmidPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare UK Limited, Buckinghamshire, UK), according to the manufacturer’s instructions. This cloned plasmid DNA was measured in a Qubit fluorometer (Invitrogen) and 10-fold dilutions in water were prepared for testing with the SYBR Green real-time PCR protocol. In both protocols, DNA solutions from other intestinal parasites (two of each) were tested for a specificity assessment: E. moshkovskii, Cryptosporidium hominis, Giardia lamblia, and Schistosoma mansoni.

2.2. Clinical Samples

Stool samples from 2263 patients who were treated at Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP), Niterói, Rio de Janeiro, Brazil, between August 2008 and June 2009 were submitted to a microscopic examination in order to detect the presence of parasites. The procedure was conducted at the HUAP’s parasitology laboratory. Moreover, a group of 292 stool samples from individual residents of Sumidouro, Rio de Janeiro, Brazil, a rural area, was also subjected to the same examination. Those samples identified as positive for the E. histolytica/E. dispar complex were selected to evaluate this SYBR Green real-time PCR system. Additional stool samples from 50 individuals with negative direct parasitological examinations were included as negative controls. This study was reviewed and approved by the Human Investigation Committee of the Universidade Federal Fluminense with protocol number 020/07.

2.3. Microscopic Examination

The microscopic examination was conducted by HUAP’s parasitology laboratory staff. Prior to morphologic analysis, this service concentrated the stools using a spontaneous sedimentation method [21]. Then the sediments were analyzed in wet mounts stained with Lugol’s iodine solution. For the microscopic examination, the laboratory staff used a Nikon Eclipse E20 optical microscope (Nikon). After the analysis, the sediments were stored at −20°C for DNA extraction.

2.4. DNA Extraction

DNA templates were extracted using the Fast Prep DNA Kit and the FastPrep FP120 Disrupter (MP Biomedicals, Solon, OH, USA). Further Purification was performed using the QIAquick PCR purification Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA), and the purified DNA was stored at −20°C. Both methods were performed according to the manufacturer’s instructions.

2.5. Conventional PCR Amplification

A multiplex PCR reaction was performed according to a protocol previously described by Santos et al. [22], with some modifications. The specific primers for E. histolytica and E. dispar were previously defined by Núñez et al. [23], E. histolytica (EHP1—5′CGATTTTCCCAGTAGAAATTA3′ and EHP2—5′CAAAATGGTCGTCTAGGC3′) and E. dispar (EDP1—5′ATGGTGAGGTTGTAGCAGAGA3′ and EDP2—5′CGATATTGACCTAGTACT3′). These primer sets were used to amplify specific sequences of 132 bp for E. histolytica and 96 bp for E. dispar. Each reaction was performed in a volume of 50 μL using PCR Supermix (Invitrogen), 20 pmol of each primer, 0.1% bovine serum albumin (BSA Sigma Chem. Co., USA), and 2 μL of the DNA sample. The PCR reaction was carried out using a Veriti 96 Well Thermal Cycler (Applied Biosystems, CA, USA), and the amplification parameters were as follows: 3 minutes at 94°C; 30 cycles of 30 seconds at 94°C, 30 seconds at 55°C, and 30 seconds at 72°C; and finally 7 minutes at 72°C. The amplified product was visualized with ethidium bromide staining after electrophoresis on a 2.0% agarose gel.

2.6. Multiplex SYBR Green Real-Time PCR Standardization

This PCR reaction was standardized for the simultaneous detection and identification of E. histolytica and E. dispar. The specific primers used for the detection of E. histolytica and E. dispar were the same oligonucleotide sequences employed for conventional multiplex PCR. Initially, a single format was designed in order to amplify E. histolytica and E. dispar separately. This format allowed us to know the specific melting temperature () of the sequence amplified from each species and the feasibility of standardizing a multiplex reaction with these primers. The simplex PCR cycling parameters consisted of 2 minutes at 50°C, 2 minutes at 95°C and 35 cycles of 15 seconds at 95°C and 33 seconds at 55°C, using Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen) and the same PCR reagents and conditions. A dissociation stage was then performed; the parameters consisted of 15 seconds at 95°C, 1 minute at 60°C, 15 seconds at 95°C, and 15 seconds at 60°C. Finally, the multiplex format was standardized in a final volume of 25 μL. Four different amounts of primers were tested: 1.25, 2

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

1. บทนำEntamoeba ตระกูลนี้ประกอบด้วยหลายชนิด 6 ซึ่งพบในทางเดินลำไส้มนุษย์: Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, Entamoeba moshkovskii, Entamoeba coli, Entamoeba hartmanni และ Entamoeba polecki พันธุ์ เฉพาะ E. histolytica ที่สัมพันธ์กับการบาดเจ็บทางพยาธิวิทยา ผู้อื่นจะถือเป็นสปีชีส์ nonpathogenic [1] E. histolytica ได้ชอบประมาณ 50 ล้านกรณีของ amoebiasis ทั่วโลกแต่ละปี เกิดเสียชีวิตถึง 100000 [2, 3] ทั่วโลกถือว่า E. histolytica มีลักษณะเหล่านี้ มี เสียงฟู่เหมือนกาฝากสาเหตุการตายของมนุษย์ [1] อย่างไรก็ตาม ข้อมูลความประวัติศาสตร์ที่เกี่ยวข้องกับการติดเชื้อ E. histolytica สามารถทำ overestimates เนื่องจากพวกเขาได้รับมาก่อนแยกทางของปรสิตนี้เป็นสปีชีส์ morphologically เหมือนสอง: histolytica E. อาจอุบัติและ nonpathogenic E. dispar [4] ที่สำคัญ นอกจากนี้ยังคาดว่า 90% ของวินิจฉัยการติดเชื้อที่เกิดจาก E. dispar [5]วินิจฉัยของ E. histolytica มีประวัติอาศัยในกล้องจุลทรรศน์ตรวจสอบสัณฐานวิทยา protozoan Microscopy แสงเป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์มากสำหรับการวินิจฉัยของ amoebiasis เพราะง่าย และราคาถูกเพื่อดำเนินการ อย่างไรก็ตาม เทคนิคความเข้มข้นและทิ้งคราบ smears จะต้องเพิ่มความไวต่ำ [1, 6] นอกจากนี้ยังจะได้รับอิทธิพลจากรุ่นไม่ต่อเนื่องของซีสต์ ต้องสอบหลายอย่างจากวันต่าง ๆ [7] นอกจากนี้ วิธีการนี้ไม่สามารถแบ่งแยกระหว่างพันธุ์ morphologically เหมือนเช่น dispar และ E. E. moshkovskii และความชำนาญของผู้ตรวจสอบที่สามารถยังเป็นสิ่งสำคัญสำหรับการระบุที่ชัดเจน Entamoeba ชนิดอื่น ๆ สามารถนำเสนอโครงสร้างที่คล้ายคลึงกับลักษณะการทำงานของ E. histolytica [2, 8, 9]Entamoeba hartmanni เป็นหนึ่งในพันธุ์กับฟอร์มคล้ายสัณฐาน เพราะซีสต์ของลักษณะร่วมกันกับ E. histolytica/E. dispar/E. moshkovskii ซับซ้อน ความแตกต่างหลักระหว่างชนิดเหล่านี้คือ ขนาดของซีสต์ ซึ่งใน E. hartmanni โดยทั่วไปมีขนาดเล็กกว่าในจากคอมเพล็กซ์ [4, 10] สำหรับนี้สร้างความแตกต่างไปจาก microscopy กล้องจุลทรรศน์ที่เหมาะสมสามารถทำการวิเคราะห์ morphometric ยังจำเป็น ระบุว่า สิ่งมีชีวิตนี้ยังคงได้ยากขึ้นอยู่กับสถานการณ์และสภาพของตัวอย่าง Contractile trophozoites หรือซีสต์ของ E. histolytica สามารถตั้งใจระบุเป็น E. hartmanni และโครงสร้างขนาดใหญ่ของ E. hartmanni misdiagnosed เป็นพันธุ์อุบัติ วิธีทางโมเลกุลอาจจะเป็นประโยชน์ให้ถูกต้อง และเชื่อถือได้ระบุพันธุ์ Entamoeba พอลิเมอเรสปฏิกิริยาลูกโซ่ (PCR), รวมทั้ง PCR แบบเรียลไทม์ ได้ให้หมายถึงการระบุ E. histolytica, E. dispar และ E. moshkovskii หลายอย่าง [11-17] อย่างไรก็ตาม ความสนใจน้อยมีการทุ่มเทเพื่อสามารถระบุ E. hartmanni โครงสร้างสับสนนายระดับความชำนาญที่แตกต่างกัน [8] ก่อนหน้านี้ ข้อมูลที่กำหนด โดยตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์ได้แสดงชุกของ hartmanni E. 13.3% ในผู้ป่วยเอชไอวีและ 2.5% ในเด็กในกลุ่มบราซิล [18, 19] รหัส Entamoeba พันธุ์อื่น ๆ ซับซ้อนโดยใช้เทคนิคโมเลกุลมีการดำเนินการในเพียงการศึกษาเดียวในบราซิล การประเมินผลทางคลินิกอย่างบราซิลที่ก่อนหน้านี้ ระบุเป็นค่าบวกสำหรับจำนวนเชิงซ้อน โดยการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์สาธิตของดีเอ็นเอในตัวอย่างหนึ่ง ในขณะที่ไม่พบดีเอ็นเอจากตัวอย่าง moshkovskii E. E. hartmanni วิเคราะห์ [20] ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นสถานะของ E. hartmanni ในบราซิล แต่ไม่มีข้อมูลเกี่ยวกับ E. moshkovskii ผลแบบเรียลไทม์ PCR เป็นวิธีมีความสำคัญมากที่อาจกลายเป็นเครื่องมือสำคัญเพื่อให้บรรลุเป้าหมาย และนี้ SYBR Green (N′,N′-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine) เทคโนโลยีกับของโพรบฟรี assays เป็นตัวแพงเลือกสำหรับการกำหนดโพรโทคอลมากในประเทศกำลังพัฒนา [12] เพราะกล่าว วัตถุประสงค์ของการศึกษานี้ได้กำหนดมาตรฐาน SYBR Green แบบเรียลไทม์ PCR โปรโตคอลสำหรับการระบุของ E. histolytica, E. dispar และ E. hartmanni และประเมินประสิทธิภาพของพวกเขาในตัวอย่างอุจจาระทางคลินิก2. วัสดุและวิธีการ2.1. ดีเอ็นเอตัวอย่างควบคุมบวกใช้ SYBR Green multiplex แบบ real-time PCR ได้ DNA genomic จากพันธุ์มาตรฐานของ E. histolytica dispar HM1 IMSS และ E. p 2 (ต้องใช้แยกต่างหากจากตัวอย่างผู้ป่วย Piauí บราซิล) ดีเอ็นเอถูกวัดใน fluorometer Qubit (Invitrogen คาร์ลส CA, USA), และ dilutions 2-fold ในน้ำเตรียมไว้สำหรับทดสอบโดยใช้ PCR รโทคอแบบเรียลไทม์ SYBR Green สำหรับ E. hartmanni ไร ขั้นตอนการ cloning ได้จำเป็นต้องขอรับตัวควบคุมบวกเนื่องจากวัฒนธรรมของ E. hartmanni protozoan ไม่มี กระบวนการนี้ ตัวอย่างดีเอ็นเอบวกที่ลักษณะในการศึกษาก่อนหน้านี้ได้ใช้ [20] ลำดับเฉพาะ E. hartmanni ถูกขยาย ด้วยไพรเมอร์ EhartF และ EhartR2 ส่วนนี้ถูกแล้วโคลนโดยใช้เวกเตอร์ 2.1 เดิน pCR ในโพรโทคอลกับ pCR 2.1-เดินชุดโคลน TA (Invitrogen) การสกัดและทำให้บริสุทธิ์ของ plasmid DNA ประกอบด้วยส่วนโคลนถูกทำโดยใช้การ Illustra PlasmidPrep มินิหมุนชุด (GE สุขภาพ UK จำกัด บักกิงแฮมเชอร์ อังกฤษ), ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โคลน plasmid DNA นี้มีวัดใน fluorometer Qubit (Invitrogen) และ dilutions 10-fold ในน้ำเตรียมไว้สำหรับทดสอบกับ PCR SYBR Green แบบเรียลไทม์โพรโท ในทั้งสองโปรโตคอล โซลูชั่นของดีเอ็นเอจากปรสิตลำไส้อื่น ๆ (สองละ) ถูกทดสอบสำหรับการประเมิน specificity: E. moshkovskii เพิ่ม hominis, lamblia ไกรด์เดีย Schistosoma mansoni และ2.2 ตัวอย่างทางคลินิกตัวอย่างอุจจาระจาก 2263 ผู้ ป่วยได้รับการรักษาที่โรงพยาบาล Universitário Antônio Pedro (HUAP), Niterói ริโอเดอจาเนโร บราซิล ระหว่างเดือน 2551 สิงหาคมและ 2552 มิถุนายนได้ส่งไปตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์เพื่อตรวจหาปรสิต ขั้นตอนที่ดำเนินการที่ห้องปฏิบัติการปรสิตวิทยาของ HUAP นอกจากนี้ กลุ่มตัวอย่างอุจจาระ 292 จากชาว Sumidouro ริโอเดอจาเนโร บราซิล ชนบท แต่ละถูกยังอยู่ภายใต้การสอบเดียวกัน ตัวอย่างที่เป็นค่าบวกสำหรับ histolytica/E. dispar E. ซับซ้อนได้เลือกประเมิน SYBR Green แบบ real-time PCR ระบบนี้ ตัวอย่างเก้าอี้เพิ่มเติมจากบุคคลที่ 50 มีค่าลบโดยตรง parasitological สอบเป็นตัวควบคุมค่าลบได้ ศึกษาทบทวน และอนุมัติ โดยคณะกรรมการตรวจสอบคนของ Fluminense กลาง Universidade กับโพรโทคอลหมายเลข 020/072.3. กล้องจุลทรรศน์ตรวจเจ้าหน้าที่ห้องปฏิบัติการปรสิตวิทยาของ HUAP ได้ดำเนินการตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์ ก่อนการวิเคราะห์ morphologic บริการนี้เข้มข้นอุจจาระโดยใช้วิธีตกตะกอนอยู่ [21] ตะกอนแล้ว ถูกวิเคราะห์ใน mounts เปียกสี ด้วยโซลูชันของ Lugol ไอโอดีน ตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์ เจ้าหน้าที่ห้องปฏิบัติการใช้ E20 คราสนิกล้องจุลทรรศน์แสง (Nikon) หลังจากวิเคราะห์ ตะกอนถูกเก็บไว้ที่ −20 ° C สำหรับสกัดดีเอ็นเอ2.4. DNA สกัดแม่แบบดีเอ็นเอที่สกัดโดยใช้รวดเร็วเป็นการเตรียมดีเอ็นเอชุดและ Disrupter FP120 FastPrep (MP Biomedicals, Solon, OH สหรัฐอเมริกา) ทำการฟอกใช้ฟอก QIAquick PCR Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA), และดีเอ็นเอบริสุทธิ์ถูกเก็บไว้ที่ −20 องศาเซลเซียส ทั้งสองวิธีได้ปฏิบัติตามคำแนะนำของผู้ผลิต2.5. PCR ทั่วไปขยายปฏิกิริยา PCR multiplex ที่ดำเนินตามโพรโทคอที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดย Santos et al. [22], มีการปรับเปลี่ยนบางอย่าง ไพรเมอร์เฉพาะสำหรับ E. histolytica E. dispar ถูกกำหนดไว้ก่อนหน้านี้โดย Núñez et al. [23], E. histolytica (EHP1 — 5′CGATTTTCCCAGTAGAAATTA3′ และ EHP2 – 5′CAAAATGGTCGTCTAGGC3′) และ E. dispar (EDP1 — 5′ATGGTGAGGTTGTAGCAGAGA3′ และ EDP2 – 5′CGATATTGACCTAGTACT3′) ชุดรองพื้นเหล่านี้ใช้ขยายลำดับเฉพาะของ 132 bp E. histolytica และ 96 bp สำหรับ E. dispar ทำปฏิกิริยาแต่ละปริมาณ 50 μL ใช้ Supermix PCR (Invitrogen), pmol 20 แต่ละพื้น 0.1% วัว serum albumin (บีเอสเอซิก Chem. Co. สหรัฐอเมริกา), และ μL 2 ของตัวอย่างดีเอ็นเอ ปฏิกิริยา PCR ถูกดำเนินการโดยใช้การ Veriti 96 ด้วย Thermal Cycler (ใช้ Biosystems, CA, USA), และพารามิเตอร์การขยายเป็นดังนี้: 3 นาทีที่ 94° C รอบ 30 วินาที 30 ที่ 94° C, 30 วินาทีที่ 55° C และวินาทีที่ 72° C และในที่สุด 7 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียส ผลิตภัณฑ์เอาต์มี visualized กับโบรไมด์ ethidium ย้อมสีหลังจากเจ electrophoresis ใน agarose 2.0%2.6 การ multiplex SYBR PCR แบบเรียลไทม์สีเขียวมาตรฐานปฏิกิริยา PCR นี้เป็นมาตรฐานสำหรับการตรวจหาพร้อมกับรหัสของ E. histolytica E. dispar ไพรเมอร์เฉพาะที่ใช้สำหรับการตรวจหาของ E. histolytica E. dispar ลำดับ oligonucleotide เดียวที่ลูกจ้างการ multiplex PCR แบบเดิมได้ เริ่มต้น รูปเดียวถูกออกแบบมาเพื่อขยาย E. histolytica และ E. dispar แยกต่างหาก รูปแบบนี้ทำให้เราทราบการละลายอุณหภูมิ()ลำดับที่ขยายจากแต่ละพันธุ์และความเป็นไปได้ของการ standardizing ปฏิกิริยาต่าง ๆ ๅกับไพรเมอร์เหล่านี้ พารามิเตอร์การขี่จักรยาน PCR simplex โดยประกอบด้วย 2 นาทีที่ 50° C, 2 นาทีที่ 95° C และรอบ 35 ของวินาที ที่ 95° C และวินาทีที่ 55° C ใช้แพลทินัม SYBR Green qPCR SuperMix UDG (Invitrogen) และ reagents PCR เดียวกัน และเงื่อนไข แล้วทำขั้น dissociation พารามิเตอร์ประกอบด้วยวินาทีที่ 95° C, 1 นาทีที่ 60° C, 15 วินาทีที่ 95° C และวินาทีที่ 60 องศาเซลเซียส สุดท้าย รูปแบบ multiplex เป็นมาตรฐานในปริมาตรสุดท้ายของ 25 μL ทดสอบจำนวนแตกต่างกันสี่ไพรเมอร์: 1.25, 2

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

1 . บทนำ

สกุลเดอร์มาแทนซัลเฟตมีหลายสายพันธุ์ที่ 6 ของที่พบในระบบทางเดินอาหารของมนุษย์ : ปรับอากาศ , dispar เดอร์มาแทนซัลเฟต , เดอร์มาแทนซัลเฟต ( moshkovskii เดอร์มาแทนซัลเฟต , เดอร์มาแทนซัลเฟต hartmanni และเดอร์มาแทนซัลเฟต polecki . ชนิดนี้เท่านั้น เช่น การบาดเจ็บทั้งหมด 12 ตัวอย่างที่เกี่ยวข้องกับพยาธิวิทยา ; คนอื่นจะถือว่าเป็น nonpathogenic ชนิด [ 1 ] E .ทั้งหมด 12 ตัวอย่าง เป็นผู้รับผิดชอบประมาณ 50 ล้านรายของสหราชอาณาจักรทั่วโลกในแต่ละปี ส่งผลให้ 100000 เสียชีวิต [ 2 , 3 ] เพราะลักษณะเหล่านี้ทั้งหมด 12 ตัวอย่าง เช่นทั่วโลกถือเป็นสาเหตุของการเสียชีวิตของมนุษย์นำปรสิต [ 1 ] อย่างไรก็ตาม ข้อมูลทางระบาดวิทยาที่เกี่ยวข้องกับประวัติศาสตร์ เช่นทั้งหมด 12 ตัวอย่างเชื้อสามารถนำไปสู่ overestimates เพราะพวกเขาได้รับก่อนจัดแยกเป็นสองชนิดของพยาธินี้เหมือนกัน : อาจก่อโรค เช่น จากทั้งหมด 12 ตัวอย่าง และ nonpathogenic E . dispar [ 4 ] ที่สำคัญ นอกจากนี้ยังประมาณการว่า 90% ของการวินิจฉัยเชื้อสาเหตุโดย dispar [ 5 ] .

การวินิจฉัยเช่นมีทั้งหมด 12 ตัวอย่างในอดีตอาศัยตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ของโปรโตซัววิทยา . กล้องจุลทรรศน์แบบแสงเป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์มากสำหรับการวินิจฉัยของสหราชอาณาจักร เพราะมันง่ายและราคาถูกเพื่อดําเนินการ อย่างไรก็ตาม เทคนิคสมาธิและเลอะเปื้อน จะต้องเพิ่มความไวต่ำ [ 1 , 3 ] นอกจากนี้ยังได้รับอิทธิพลจากรุ่นต่อเนื่องของซีสต้องตรวจสอบหลายตัวอย่างจากคนละวัน [ 7 ] นอกจากนี้ วิธีการนี้ไม่สามารถแยกความแตกต่างระหว่างชนิดจากที่เหมือนกันเช่น E . dispar และ E . moshkovskii และความชำนาญของผู้ตรวจสอบยังสามารถที่สำคัญสำหรับการระบุแม่นยำ เป็นชนิดเดอร์มาแทนซัลเฟตอื่นสามารถนำเสนอโครงสร้างคล้ายกับคุณสมบัติของ E . ทั้งหมด 12 ตัวอย่าง [ 2 , 8 , 9 ] .

เดอร์มาแทนซัลเฟต hartmanni เป็นหนึ่งในสายพันธุ์เหล่านี้มีรูปแบบลักษณะทางสัณฐานวิทยาคล้ายกันเนื่องจากซีสต์แบ่งปันลักษณะของ E / E / E moshkovskii dispar ทั้งหมด 12 ตัวอย่างที่ซับซ้อน ความแตกต่างที่สำคัญระหว่างสายพันธุ์เหล่านี้คือขนาดของซีสต์ ซึ่งใน hartmanni มักจะมีขนาดเล็กกว่าในที่ซับซ้อน [ 4 / 10 ] สำหรับความแตกต่างนี้จะถูกดำเนินการโดยกล้องจุลทรรศน์ ,กล้องจุลทรรศน์ความสามารถในการปฏิบัติที่เหมาะสมในการวัดการวิเคราะห์ ยังต้อง ระบุว่า สิ่งมีชีวิตนี้ยังสามารถจะยากที่จะระบุได้ ขึ้นอยู่กับสถานการณ์และสภาพของตัวอย่าง ที่ trophozoites หรือซีสต์ของ E . ทั้งหมด 12 ตัวอย่างได้ผลระบุว่าเป็นเช่น hartmanni และโครงสร้างขนาดใหญ่ .hartmanni ยังสามารถ misdiagnosed เป็นสายพันธุ์ก่อโรค . วิธีการของทางเลือกอาจเป็นประโยชน์ให้ถูกต้องและเชื่อถือได้รหัสของเดอร์มาแทนซัลเฟตชนิด ปฏิกิริยาลูกโซ่ ( PCR ) รวมทั้ง PCR แบบเรียลไทม์ ได้ให้วิธีการที่จะระบุ E ทั้งหมด 12 ตัวอย่าง เช่น dispar , และ E moshkovskii ในความหลากหลายของตัวอย่าง [ 11 – 17 ] อย่างไรก็ตามความสนใจน้อยได้รับการอุทิศเพื่อความเป็นไปได้ของการระบุเช่น hartmanni ที่มีโครงสร้างในระดับความสามารถที่แตกต่างกันผู้สับสน [ 8 ] ก่อนหน้านี้ ข้อมูลตัดสินใจด้วยกล้องจุลทรรศน์พบความชุกของ E . hartmanni ของ 13.3% ในผู้ป่วย HIV และ 2.5% ในเด็กในกลุ่ม [ 18 บราซิล 19 ]รหัสของเดอร์มาแทนซัลเฟตชนิดอื่นมากกว่าที่ซับซ้อนโดยใช้เทคนิคโมเลกุลมีวัตถุประสงค์ในการศึกษาเดียวในบราซิล ซึ่งในการประเมินตัวอย่างทางคลินิกก่อนหน้านี้ระบุว่าเป็นบราซิลที่ซับซ้อน ด้วยกล้องจุลทรรศน์พบการปรากฏตัวของ E . hartmanni ดีเอ็นเอในมากกว่าหนึ่งตัวอย่างในขณะที่ Emoshkovskii ดีเอ็นเอไม่พบในตัวอย่างวิเคราะห์ [ 20 ] พบการปรากฏตัวของ E . hartmanni ในบราซิล แต่จากข้อมูลเกี่ยวกับ E moshkovskii

เวลา PCR จริงค่อนข้างอ่อนไหวง่าย วิธีการที่อาจจะกลายเป็นเครื่องมือที่สำคัญเพื่อให้บรรลุ เป้าหมายเหล่านี้และ SYBR กรีน ( N ’ n ’ - dimethyl-n - [ 4 - [ ( E ) - ( 3-methyl-1 ,3-benzothiazol-2-ylidene ) เมทิล ] - 1-phenylquinolin-1-ium-2-yl ] - n-propylpropane-1,3-diamine ) เทคโนโลยีกับ probe ) เป็นทางเลือกที่ราคาไม่แพงสำหรับการสร้างโปรแกรมที่มีประสิทธิภาพมากขึ้นในประเทศกำลังพัฒนา [ 12 ] เพราะความเป็นไปได้เหล่านี้ การศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อสร้างมาตรฐานโปรโตคอลแบบเรียลไทม์พีซีอาร์ SYBR กรีนเพื่อระบุตัวตนของ E . dispar ทั้งหมด 12 ตัวอย่าง เช่น ,และ E . hartmanni และประเมินประสิทธิภาพของพวกเขาในตัวอย่างอุจจาระคลินิก

2 วัสดุและวิธีการ

2.1 . ดีเอ็นเอ

บวกการควบคุมที่ใช้ในการมัลติเพล็กซ์แบบเรียลไทม์พีซีอาร์เป็น SYBR กรีนดีเอ็นเอจากสายพันธุ์มาตรฐานเช่นทั้งหมด 12 ตัวอย่าง hm1-imss และ E . dispar P2 ( สายพันธุ์ที่แยกได้จากผู้ป่วยตัวอย่างรัฐปีเอาอีประเทศบราซิล ) ดีเอ็นเอเป็นวัดในฟลู โรมิเตอร์ ( Invitrogen qubit ,Carlsbad , CA , USA ) และเจือจางในน้ำถึงเตรียมสำหรับการทดสอบการใช้สีเขียว SYBR เรียลไทม์พีซีอาร์โปรโตคอล สำหรับ อี hartmanni อย่างไรก็ตาม ขั้นตอนการจำเป็นที่ต้องได้รับการควบคุมที่ดี เพราะโปรโตซัววัฒนธรรมของ E . hartmanni ไม่ว่าง สำหรับกระบวนการนี้ ตัวอย่างดีเอ็นเอบวกโดดเด่นในการศึกษาก่อนหน้านี้เคยใช้ [ 20 ] ที่เฉพาะเจาะจงเช่นhartmanni ลำดับถูกขยายด้วยไพรเมอร์และ ehartf ehartr2 ; ส่วนนี้ถูกโคลนโดยใช้ PCR 2.1-topo เวกเตอร์ตามที่อธิบายไว้ในขั้นตอนกับ pcr 2.1-topo ทาโคลน Kit ( Invitrogen ) การสกัดและการโคลนชิ้นส่วนพลาสมิดดีเอ็นเอที่มีการใช้ illustra plasmidprep มินิปั่นชุด ( GE ดูแลสุขภาพ UK จำกัด เหมือนเดิม , UK )ตามคำแนะนำของผู้ผลิต นี้สามารถวัดในพลาสมิดดีเอ็นเอ qubit ฟลู โรมิเตอร์ ( Invitrogen ) และ 10 เท่าเจือจางในน้ำที่ถูกเตรียมไว้สำหรับการทดสอบด้วยวิธี PCR แบบเรียลไทม์ SYBR กรีนโปรโตคอล ในทั้งสองโปรโตคอล โซลูชั่นจากดีเอ็นเอ intestinal อื่น ๆ ( สองของแต่ละคน ) โดยมีความเฉพาะเจาะจงในการประเมิน : E . moshkovskii hominis , Cryptosporidium ,การ์เดียแลมเบลีย และ schistosoma mansoni .

. . คลินิกตัวอย่าง

อุจจาระตัวอย่างจาก 2263 ผู้ป่วยในโรงพยาบาลมหาวิทยาลัย . kgm ริโอมดเป็นการนีโอเปโดร ( huap ) ดินประสิวóผม ริโอ เดอ จาเนโร ประเทศบราซิล ระหว่างเดือนสิงหาคม 2008 และมิถุนายน 2009 ถูกส่งไปยังกล้องจุลทรรศน์เพื่อตรวจสอบสถานะของปรสิต ขั้นตอนดำเนินการที่ห้องปฏิบัติการปรสิตวิทยาของ huap . นอกจากนี้กลุ่ม 292 ตัวอย่างจากบุคคลผู้ sumidouro สตูล , ริโอ เดอ จาเนโร ประเทศบราซิล ชนบท ก็ต้องสอบเหมือนกัน ตัวอย่างการระบุเป็นบวกสำหรับ E / E dispar ทั้งหมด 12 ตัวอย่างที่ถูกเลือกเพื่อประเมินนี้ SYBR กรีนแบบเรียลไทม์ โดยระบบเพิ่มเติมตัวอย่างจาก 50 บุคคลที่มีแป้นลบตรงปรสิตวิทยาสอบถูกรวมเป็นควบคุมลบ การศึกษานี้ได้ตรวจสอบและอนุมัติโดยมนุษย์คณะกรรมการสอบสวนของมหาวิทยาลัยกับโพรโทคอลเบอร์ 020 Amrica / 07 .

2.3 กล้องจุลทรรศน์

ตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์นี้ดำเนินการโดย huap ปรสิตวิทยาปฏิบัติการของเจ้าหน้าที่ก่อนการวิเคราะห์รูปร่าง บริการนี้เข้มข้นตั่งใช้วิธีตกตะกอนตามธรรมชาติ [ 21 ] จากนั้นตะกอนวิเคราะห์ mounts เปียกเปื้อน lugol ของสารละลายไอโอดีน เป็นต้น สำหรับการตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์ เจ้าหน้าที่ห้องปฏิบัติการที่ใช้ Nikon คราสเตอร์แสงกล้องจุลทรรศน์ ( Nikon ) หลังจากการวิเคราะห์ ตะกอนที่อุณหภูมิ 20 ° C สำหรับ บริษัท เวสเทิร์น การสกัดดีเอ็นเอ

2.4 .การสกัดดีเอ็นเอดีเอ็นเอแม่แบบ

ถูกสกัดโดยใช้ดีเอ็นเออย่างรวดเร็วเตรียมชุดและ fastprep fp120 ยิง ( MP biomedicals โซลอน โอ้ , USA ) ต่อไปคือการใช้บำบัดน้ำเสีย qiaquick PCR ฟอก Kit ( QIAGEN อิงค์ , วาเลนเซีย , CA , USA ) และทำให้ดีเอ็นเอถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 20 องศา บริษัท เวสเทิร์น ทั้งสองวิธีมีการปฏิบัติตามคำแนะนำของผู้ผลิต

2.5

มีปฏิกิริยา PCR PCR ธรรมดาแบบมัลติเพล็กซ์ ได้ปฏิบัติตามขั้นตอนที่อธิบายไว้ก่อนหน้าโดยซานโตส et al . [ 22 ] , มีการปรับเปลี่ยน ไพร์เมอร์จำเพาะสำหรับ . . dispar ทั้งหมด 12 ตัวอย่างก่อนหน้านี้ที่กำหนดโดย N úñ EZ et al . [ 23 ] , E . ทั้งหมด 12 ตัวอย่าง ( MBC ’ cgattttcccagtagaaatta3 ehp1-5 และได้รับ ehp2-5 caaaatggtcgtctaggc3 School ) และ Edispar ( MBC MBC MBC และ atggtgaggttgtagcagaga3 edp1-5 edp2-5 cgatattgacctagtact3 School ) ชุดรองพื้นเหล่านี้ถูกใช้เพื่อขยายเฉพาะลำดับ 132   BP สำหรับ E ทั้งหมด 12 ตัวอย่างและ 96   BP สำหรับ E dispar . แต่ละปฏิกิริยาแสดงในปริมาตร 50  μผมใช้ PCR supermix ( Invitrogen ) , 20   pmol ของแต่ละคู่ , 0.1% อัลบูมิน ( 6 ซิกม่า เคมี Co . , USA ) และ 2  μ l ตัวอย่างดีเอ็นเอการตรวจปฏิกิริยาการใช้ veriti 96 ดีความร้อนรอบ ( Applied Biosystems , CA , USA ) และโดยการเพิ่มพารามิเตอร์ดังนี้ 3 นาทีที่ 94 ° C ; 30 รอบ 30 วินาทีที่ 94 ° C 30 วินาทีที่ 55 องศา C และ 30 นาทีที่ 72 ° C ; และในที่สุด 7 นาทีที่ 72 ° C ขยายผลิตภัณฑ์กับคู่ bromide staining หลังจากตรวจเอนไซม์บนเจล ( 2.0 %

2.6มัลติเพล็กซ์สีเขียว SYBR เวลา PCR จริงมาตรฐาน

0 มาตรฐานการตรวจหาปฏิกิริยาพร้อมกันและการ dispar ทั้งหมด 12 ตัวอย่าง และ E . . . โดยเฉพาะที่ใช้สำหรับการตรวจหาของ E . ทั้งหมด 12 ตัวอย่างและ E . dispar ได้เหมือนกัน ซึ่งลำดับในแบบ multiplex PCR ในรูปแบบเดียวถูกออกแบบมาเพื่อขยาย .ทั้งหมด 12 ตัวอย่างและ E . dispar ต่างหาก รูปแบบนี้ให้เราทราบอุณหภูมิหลอมเหลวที่เฉพาะเจาะจง ( ) ของลำดับเบสจากแต่ละชนิดและความเป็นไปได้ของมาตรฐานปฏิกิริยา multiplex กับไพรเมอร์เหล่านี้ วิธีซิมเพล็กซ์จักรยานพารามิเตอร์เป็น 2 นาทีที่ 50 ° C , 2 นาทีที่ 95 องศา C และ 35 รอบ 15 วินาทีที่ 95 องศา C และ 33 วินาทีที่ 55 องศา Cการใช้แพลทินัม SYBR สีเขียว qpcr supermix udg ( Invitrogen ) และเดียวกันจากสารเคมีและเงื่อนไข ขั้นตอนการได้ดำเนินการ ; พารามิเตอร์จำนวน 15 วินาทีที่ 95 องศา C , 1 นาทีที่ 60 ° C , 15 วินาทีที่ 95 องศา C และ 15 วินาทีที่อุณหภูมิ 60 องศา สุดท้ายรูปแบบ multiplex คือมาตรฐานในเล่มสุดท้าย 25  μล. 4 ปริมาณชิ้นดีเอ็นเอการทดสอบ : 1.25 , 2