labeled with 5m l annexin V-fluores

labeled with 5m l annexin V-fluorescein and 5m l PI in 100m l
of binding buffer (10mM HEPES/NaOH, pH 7.4, 140mM
NaCl, 2.5mM CaCl2). After 15 min incubation at room temperature,
400m l of binding buffer was added in each sample
and cells were then analyzed by a FACSCalibur flow cytometer
(BD Bioscience, San Jose, CA, U.S.A.) of 20000 cells
in each group. Annexin-V binds to those cells that express
phosphatidylserine on the outer layer of cell membrane.
This allows for the discrimination of living cells (unstained
with either fluorochrome) from apoptotic cells (stained
only with annexin-V) and necrotic cells (stained with both of
annexin-V and PI).16,17) Data analysis was performed with
the standard Cell Quest Software. All experiments were
performed in duplicate and reproducibility was checked in
three independent experiments.
DNA Fragmentation Analysis DNA fragmentation
served as a late apoptosis marker18) was detected by agarose
gel electrophoresis. Briefly, HeLa cells (1106 cells/ml)
were treated with 0.1% DMSO or with rhinacanthone, b -
lapachone and adriamycin (6m M) for 4 and 8 h. At the end
of incubation, cells were harvested and lysed in 20m l lysis
buffer (50mM Tris–HCl, pH 7.4; 10mM EDTA and 0.5%
sodium N-lauroylsacosinate). The lysate was incubated sequentially
with 500m g/ml ribonuclease A at 50 °C for 30 min
and 500m g/ml proteinase K at 50 °C for 60 min in a shaking
water bath. Equivalent amounts of DNA (2—3m g) were
electrophoresed on a 2% agarose gel in TBE buffer (2mM
EDTA, pH 8; 89mM Tris–HCl and 89mM boric acid) at 50V.
DNA fragments were visualized and photographed under
transmission UV light after being staining with 0.5m g/ml
ethidium bromide.12,18)
Primer Design Primers for Bcl-2, Bax, survivin and
GAPDH mRNA were designed using the GeneFisher program
reversion 1.3 (Chris Schleiemacher and Folker Meyer,
1995—2001). The accession numbers are the followings:
Bcl-2, M14745.1; Bax, L22473.1; survivin, AF77350.1 and
GAPDH, BC083511. Sequences for the specific primers used
in the PCR are summarized in Table 1.
RNA Extraction and Reverse Transcriptase-PCR
Total RNA was isolated using a TRIzol reagent (Invitrogen
Co., Carlsbad, CA, U.S.A.) according to the manufacturer’s
instructions. Total RNA concentration was determined by
spectrophotometric analysis at 260 nm. In reverse transcription
reaction system, 2.5m g total RNA and 0.5m g random
primers were mixed and incubated at 70 °C for 5 min. Then,
5RT buffer, 20 UrRNasin ribonuclease inhibitor, 10mM
dNTP mix, 200U MMLV reverse transcriptase and RNase
free water were added. The mixture was incubated at 25 °C
for 10 min, 37 °C for 1 h and 95 °C for 5 min.19)
Real-time PCR: Real-time PCR of Bcl-2, Bax, Survivin
and GAPDH were performed using SYBR Green PCR
assay.19) Each 20m l PCR reaction mixture contained 5m l
cDNA, PCR buffer, 3mM MgCl2, 0.25mM of each dNTP,

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ติดป้ายชื่อ ด้วย annexin V-fluorescein และ 5m l PI ใน 100m l l ม 5บัฟเฟอร์รวม (10mM HEPES NaOH ค่า pH 7.4, 140 มม.NaCl, CaCl2 2.5 mM) หลังจาก 15 นาทีบ่มที่อุณหภูมิห้องเพิ่ม 400m l ของบัฟเฟอร์รวมในแต่ละอย่างและเซลล์แล้วถูกวิเคราะห์ โดย cytometer การไหล FACSCalibur(วิทยาศาสตร์ชีวภาพ BD, San Jose, CA สหรัฐอเมริกา) ของเซลล์ 20000ในแต่ละกลุ่ม Annexin V binds ไปยังเซลล์เหล่านั้นที่แสดงphosphatidylserine บนชั้นนอกของเยื่อหุ้มเซลล์สำหรับการเลือกปฏิบัติ (unstained เซลล์ชีวิตมีทั้ง fluorochrome) จากเซลล์ apoptotic (ย้อมสีด้วย annexin V) และเซลล์ necrotic (ย้อมได้ทั้งannexin V และ PI) .16,17) ดำเนินการวิเคราะห์ข้อมูลด้วยมาตรฐานเซลล์แสวงหาซอฟต์แวร์ มีการทดลองทั้งหมดทำซ้ำ และสามารถตรวจสอบในสามการทดลองอิสระการกระจายตัวของดีเอ็นเอการวิเคราะห์การกระจายตัวของดีเอ็นเอทำหน้าที่เป็น marker18 กันปลาย) ตรวจพบ โดย agaroseเจอิ สั้น ๆ เซลล์ HeLa (1 106 เซลล์/มิลลิลิตร)ได้รับการรักษา ด้วย 0.1% DMSO หรือ rhinacanthone, b -lapachone และ adriamycin (6m M) สำหรับ 4 และ 8 ชั่วโมง ในตอนท้ายการกกไข่ เซลล์เก็บเกี่ยว และ lysed ใน 20m l lysisบัฟเฟอร์ (50 มม.ทริ – HCl ค่า pH 7.4; 10 mM EDTA และ 0.5%ทางโซเดียมที่ N-lauroylsacosinate) การ lysate ของถูกได้รับการกกตามลำดับมี 500m g/ml ribonuclease A ที่ 50 ° C 30 นาทีและ 500m g/ml proteinase K ที่ 50 ° C สำหรับ 60 นาทีในการสั่นห้องน้ำ เทียบเท่าปริมาณของดีเอ็นเอ (2-3m g) ได้electrophoresed ในเจ 2% agarose ในบัฟเฟอร์ TBE (2 มม.EDTA ค่า pH 8 89 มม.ทริ – HCl และ 89 มม.เป็นกรด) ที่ 50Vดีเอ็นเอถูกมองเห็น และถ่ายภาพภายใต้ส่งหลังจากการย้อมสีด้วย 0.5m g/ml แสงยูวีethidium bromide.12,18)ไพรเมอร์ออกแบบไพรเมอร์สำหรับ Bcl-2, Bax, survivin และGAPDH mRNA ถูกออกแบบโดยใช้โปรแกรม GeneFisherreversion 1.3 (Chris Schleiemacher และ Folker Meyer1995-2001) หมายเลขทะเบียนต่อไปนี้:Bcl-2, M14745.1 Bax, L22473.1 survivin, AF77350.1 และGAPDH, BC083511 ลำดับสำหรับไพรเมอร์เฉพาะที่ใช้ในการ PCR ถูกสรุปในตารางที่ 1สกัด RNA และ PCR ปเทสรวม RNA ถูกแยกโดยใช้เอเจนต์ TRIzol (Invitrogenบริษัท คาร์ลบาด CA สหรัฐอเมริกา) ตามของผู้ผลิตคำแนะนำ ความเข้มข้นของ RNA ทั้งหมดถูกกำหนดโดยวิเคราะห์ spectrophotometric ที่ 260 nm ในการถอดรหัสย้อนกลับระบบปฏิกิริยา 2.5m RNA รวม g และ g 0.5 ม.สุ่มไพรเมอร์ผสม และได้รับการกกที่ 70 ° C สำหรับ 5 นาที แล้ว5 RT บัฟเฟอร์ 20 UrRNasin ribonuclease ยับยั้ง 10 มม.ผสม dNTP, 200U MMLV ปเท และ RNaseเพิ่มน้ำ ส่วนผสมได้รับการกกที่ 25 ° Cสำหรับ 10 นาที 37 ° C สำหรับ 1 h และ 95 ° C สำหรับ 5 min.19)PCR แบบเรียลไทม์: PCR แบบเรียลไทม์ของ Bcl-2, Bax, Survivinและ GAPDH ดำเนินการโดยใช้ SYBR Green PCRl assay.19) แต่ละ 20 เมตรส่วนผสมของปฏิกิริยา PCR อยู่ม 5 lcDNA, PCR บัฟเฟอร์ 3 มม.แต่ละ dNTP, 0.25mM, MgCl2

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ที่มีป้ายกำกับ 5m L annexin V-fluorescein และ 5m L PI ใน 100m L
ผูกพันบัฟเฟอร์ (10 mM HEPES / NaOH ค่า pH 7.4 140mm
โซเดียมคลอไรด์, 2.5mm CaCl2) หลังจาก 15 นาทีบ่มที่อุณหภูมิห้อง
L 400m ของการผูกบัฟเฟอร์ถูกเพิ่มเข้ามาในแต่ละตัวอย่าง
และเซลล์ที่ได้มาวิเคราะห์แล้วโดย FACSCalibur ไหล cytometer
(BD ชีววิทยาศาสตร์, San Jose, CA, USA) 20000 เซลล์
ในแต่ละกลุ่ม Annexin-V ผูกกับเซลล์เหล่านั้นที่แสดง
phosphatidylserine บนชั้นนอกของเยื่อหุ้มเซลล์.
นี้จะช่วยให้การเลือกปฏิบัติของเซลล์ (ไม่มีรอยเปื้อนที่อยู่อาศัย
ที่มีทั้งสารเรืองแสง) จากเซลล์ apoptotic (ย้อมสี
เฉพาะกับ annexin-V) และเซลล์เนื้อตาย (ย้อมด้วยสีทั้ง ของ
annexin V และ PI) .16,17) การวิเคราะห์ข้อมูลได้ดำเนินการกับ
เซลล์มาตรฐานเควสซอฟท์แว การทดลองทั้งหมดถูก
ดำเนินการในการทำสำเนาซ้ำกันและได้รับการตรวจสอบใน
การทดลองสามอิสระ.
ดีเอ็นเอการกระจายตัวของการวิเคราะห์ดีเอ็นเอ
ทำหน้าที่เป็น marker18 apoptosis ดึก) ถูกตรวจพบโดย agarose
ข่าวคราว สั้น ๆ , HeLa เซลล์ (? 1 106 เซลล์ / มล.)
ได้รับการรักษาด้วย 0.1% DMSO หรือ rhinacanthone, B -
lapachone และ Adriamycin (6m M) สำหรับ 4 และ 8 ชั่วโมง ในตอนท้าย
ของการบ่มเซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวและ lysed ใน 20m L สลาย
บัฟเฟอร์ (50mm Tris-HCl ค่า pH 7.4; 10 mM EDTA และ 0.5%
โซเดียม N-lauroylsacosinate) lysate ถูกบ่มตามลำดับ
กับ 500 g / ml ribonuclease ที่ 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที
และ 500 g / ml โปร K ที่ 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 60 นาทีในการเขย่า
อ่างน้ำ จำนวนเทียบเท่าของดีเอ็นเอ (2-3m กรัม) ถูก
electrophoresed บน agarose gel ที่ 2% ใน TBE บัฟเฟอร์ (2mm
EDTA, ค่า pH 8; 89mm Tris-HCl และ 89mm กรดบอริก). ที่ 50V
ดีเอ็นเอถูกมองเห็นและถ่ายภาพภายใต้
แสงยูวีส่ง หลังจากที่ถูกย้อมสีด้วย 0.5mg / ml
ethidium bromide.12,18)
Primer ไพรเมอร์ที่ออกแบบมาสำหรับ Bcl-2, แบ็กซ์, survivin และ
GAPDH mRNA ได้รับการออกแบบโดยใช้โปรแกรม GeneFisher
พลิกกลับ 1.3 (คริส Schleiemacher และ Folker เมเยอร์,
​​1995-2001) หมายเลขภาคยานุวัติเป็นดังต่อไปนี้:
Bcl-2, M14745.1; แบ็กซ์, L22473.1; survivin, AF77350.1 และ
GAPDH, BC083511 ลำดับสำหรับไพรเมอร์เฉพาะที่ใช้
ใน PCR ได้สรุปไว้ในตารางที่ 1
RNA การสกัดและ Reverse Transcriptase-PCR
รวม RNA ถูกแยกออกโดยใช้ Trizol น้ำยา (Invitrogen
Co. , Carlsbad, CA, USA) ตามที่ผู้ผลิต
คำแนะนำ ความเข้มข้นของ RNA ทั้งหมดถูกกำหนดโดย
การวิเคราะห์สเปกที่ 260 นาโนเมตร ในการถอดรหัสย้อนกลับ
ระบบปฏิกิริยา 2.5mg รวม RNA และ 0.5mg สุ่ม
ไพรเมอร์ผสมและบ่มที่อุณหภูมิ 70 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที จากนั้น
5? RT บัฟเฟอร์ 20 UrRNasin ribonuclease ยับยั้ง 10 mM
ผสม dNTP, 200U MMLV reverse transcriptase และ RNase
น้ำฟรีถูกเพิ่ม ส่วนผสมที่ถูกบ่มที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส
เป็นเวลา 10 นาที, 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมงและ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 min.19)
Real-time PCR: Real-time PCR ของ Bcl-2, แบ็กซ์, survivin
และ GAPDH ถูกดำเนินการโดยใช้ สีเขียว SYBR PCR
assay.19) แต่ละ 20m L PCR ปฏิกิริยาส่วนผสมที่มีอยู่ 5m L
cDNA, PCR บัฟเฟอร์ 3mm MgCl2, 0.25mm ของแต่ละ dNTP,

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ป้ายกับ 5m ผม v-fluorescein ของเซลล์และพายใน 100m ผม 5M lของผูกบัฟเฟอร์ ( 10mm ฮีเปส / NaOH pH 7.4 140 มม.เกลือ , 2.5mm CaCl2 ) หลัง 15 นาที บ่มที่อุณหภูมิห้อง400 เมตรลิตรผูกบัฟเฟอร์เพิ่มในแต่ละตัวอย่างและเซลล์ที่ได้นำมาวิเคราะห์โดยการใช้โมโน facscalibur( BD วิทยาศาสตร์ชีวภาพ San Jose , CA , USA ) , เซลล์ในแต่ละกลุ่ม annexin-v ผูกกับพวกเซลล์ที่แสดงฟอสฟาไทดิลเซอรีนบนชั้นนอกของเยื่อหุ้มเซลล์ .นี้จะช่วยให้สำหรับการอาศัยเซลล์ ( ไม่มีรอยเปื้อนกับฟลู โรโครม ) จากเนื้อเยื่อ ( เปรอะเปื้อนแต่ annexin-v ) และเซลล์ ( ที่เปื้อนทั้งของและ annexin-v พี ) อันเป็น ) วิเคราะห์ข้อมูลด้วยมาตรฐานเซลล์ค้นหาซอฟต์แวร์ การทดลองทั้งหมดดำเนินการในที่ซ้ำกันตรวจสอบและตรวจสอบในสามการทดลองที่เป็นอิสระการวิเคราะห์ DNA fragmentation ของดีเอ็นเอทำหน้าที่เป็น marker18 ( ดึก ) ถูกตรวจพบโดย โรสเจล สั้นล่าเซลล์ก็คือเซลล์ / มิลลิลิตร )รักษาด้วย 0.1% DMSO หรือ rhinacanthone , B -และ lapachone ขาวโพลน ( 6M ) 4 และ 8 ชั่วโมง ในที่สุดบ่มเซลล์เก็บ lysed ใน 20m ผมเสื่อมบัฟเฟอร์ ( 50mm ทริส–กรดไฮโดรคลอริก pH 7.4 ; 10mm EDTA และ 0.5%โซเดียม n-lauroylsacosinate ) การ lysate ถูกบ่มโดดเด่นกับ 500m กรัม / มิลลิลิตรที่อุณหภูมิ 50 องศาซี ประมาณ 30 นาทีแล้ว 500m g / ml โปร K ที่ 50 องศา C นาน 60 นาทีในสั่นน้ำอาบ เท่ากับปริมาณของดีเอ็นเอ ( 2-3m กรัม ) คือelectrophoresed ใน 2% เจลในทีบีบัฟเฟอร์ ( 2 มม.EDTA pH 8 มิลลิเมตรโดย– HCl และมิลลิเมตร boric acid ) ที่ 50v .ชิ้นส่วนดีเอ็นเอถูกมองเห็นและถ่ายภาพภายใต้การส่งผ่านแสงยูวีหลังจากที่ถูกย้อมด้วย 0.5 กรัม / มิลลิลิตรทิเดียมโบรไมด์ . 12,18 )ไพรเมอร์ที่ออกแบบไพรเมอร์สำหรับ bcl-2 bax และ , ดิกgapdh mRNA ถูกออกแบบโดยใช้โปรแกรม genefisherการ schleiemacher 1.3 ( คริส และ folker Meyer ,1995-2001 ) เปลี่ยนหมายเลขต่อไปนี้ :bcl-2 m14745.1 ; , bax l22473.1 ; ดิก af77350.1 , และgapdh bc083511 , . ลำดับสำหรับไพรเมอร์ที่ใช้เฉพาะในการตรวจสรุปได้ในตารางที่ 1การสกัดอาร์เอ็นเอและ reverse transcriptase PCRอาร์เอ็นเอทั้งหมดได้ใช้ trizol Reagent ( Invitrogenจำกัด , Carlsbad , CA , USA ) ตามที่ผู้ผลิตคําแนะนํา ความเข้มข้นของอาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกกำหนดโดย) การวิเคราะห์ที่ 260 นาโนเมตร ในทางตรงกันข้ามการถอดความระบบปฏิกิริยา 2.5 กรัมรวม RNA และ 0.5 กรัม แบบสุ่มไพรเมอร์ผสมบ่มที่อุณหภูมิ 70 องศา C เป็นเวลา 5 นาทีแล้ว5rt บัฟเฟอร์ , 20 urrnasin ไรโบนิวคลีเสาร !dntp ผสม 200u mmlv reverse transcriptase และ เลสน้ำฟรีมีการเพิ่ม ผสมส่วนผสมที่อุณหภูมิ 25 ° Cสำหรับ 10 นาที , 37 ° C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง และ 95 องศา C เป็นเวลา 5 min.19 )เวลาจริงเวลาจริงของ PCR PCR bcl-2 bax , ดิกgapdh และการใช้ PCR SYBR กรีน( 19 ) แต่ละ 20m ผมเพื่อตรวจหาส่วนผสมที่มีอยู่ 5 ลิตรวิธี PCR buffer , 3 ชุดของแต่ละ dntp 0.25mm , ,