111. DESCRIPTIONS OF FIGURES[0011]

111. DESCRIPTIONS OF FIGURES


[0011] Figure 1: provides typical measurements of on-rate and off-rate by Surface Plasmon Resonance for the ไลโปคาลิน มิวทีนs SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 11. The resulting dissociation constants (Ko) to ฮิวเมน PCSK9 ("hPCSK9") (SEQ ID NO: 34), the association rates (kon), and the dissociation rates (k0tt) are summarized in Table 1 of Example 6.

[0012] Figure2: demonstrates that the ไลโปคาลิน มิวทีนs SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:

4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 were capable of blocking the interaction between PCSK9 and its receptor LDL-R. Either biotinylated hPCSK9 (รูป 2A) or biotinylated hPCSK.9_D374Y mutant (รูป 2B) were pre-incubated with variable concentrations of said มิวทีนs and non-neutralized PCSK9 was quantified on an ELISA plate with immobilized soluble LDL-R. Negative control SEQ ID NO: 2 had no competitive effect. Data were fitted with a single-site binding แบบจำลอง. Resulting IC50 values are summarized in Table 2 of Example 7.

[0013] Figure 3: shows the crossreactivity profile of the ไลโปคาลิน มิวทีนs of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 as measured in an ELISA format. Full crossreactivity of the ไลโปคาลิน มิวทีนs to hPCSK9 D374Y mutant and to cynomolgus monkey PCSK9 is evident from nearly identical Ko values (see Table 3). Within the concentration range tested, there is also crossreactivity to mouse PCSK9 but with lower แอฟฟินิตี้. No binding was detected of the negative control (SEQ ID NO: 2). Data were fitted with a single-site binding แบบจำลอง.

[0014] Figure 4: illustrates that the ไลโปคาลิน มิวทีนs of SEQ NO: 3, SEQ NO: 4,
I
SEQ NO: 6, SEQ NO: 7, and SEQ NO: 8 are effective in blocking hPCSK9 binding to its receptor LDL-R in a cell-based assay. The assay is based on PCSK9-induced internalization of LDL-R on HepG2 cells leading to reduced intracellular uptake of fluorescence-labeled Dil• LDL. Cells are incubated with a fixed concentration of hPCSK9 (100 nM) and titrated with the ไลโปคาลิน มิวทีนs. Plotted is the normalized fluorescence signal of intracellular Dil-LDL measured at 485/535 nm using a BMG PheraStar reader, against the concentration ofไลโปคาลิน มิวทีนs. The resulting IC50 values for the ไลโปคาลิน มิวทีนs of SEQ NO: 3, SEQ NO: 4, SEQ NO: 6, SEQ NO: 7 and SEQ NO: 8 are given in Table 4. Binding of ไลโปคาลิน มิวทีนs to PCSK9 restored PCSK9-mediated reduction of Dil-LDL uptake into cells whereas the negative control of SEQ ID NO: 2 had no effect. The curves were fitted by GraphPad Prism 4 using nonlinear regression "sigmoidal dose - response, variable slope" แบบจำลอง (5PL fit). Data were normalized by the value of PCSK9 stimulated and non-stimulated cells.

[0015] Figure 5: provides typical measurements of on-rate and off-rate for binding and unbinding of ไลโปคาลิน มิวทีนs of SEQ ID NO: 13 (รูป 5C), SEQ ID NO: 20 (รูป 5A) and SEQ ID NO: 21 (รูป SB) to hPCSK9 as measured by Surface Plasmon Resonance. The resulting K0s are summarized in Table 5 (see Example 10).

[0016] Figure 6: provides typical measurements of on-rate and off-rate for binding and unbinding of ไลโปคาลิน มิวทีน (SEQ ID NO: 20) to various PCSK9 species as measured by Surface Plasmon Resonance. The resulting Ko for ไลโปคาลิน มิวทีน SEQ ID NO: 20 and for other มิวทีนs are summarized in Table 6 (see Example 11).

[0017] Figure 7: demonstrates that the PEGylated versions of ไลโปคาลิน มิวทีนs of SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32 are capable of binding to hPCSK9 with an IC50 of 0.19, 0.53, and 0.37 nM, respectively, similar to the unmodified ไลโปคาลิน มิวทีน of SEQ ID NO: 13, which displayed an IC50 of 0.16 nM. Biotinylated hPCSK9 was pre• incubated with variable concentrations of the ไลโปคาลิน มิวทีนs and non-neutralized hPCSK9 was quantified on an ELISA plate immobilized with a benchmark antibody (its light chain is represented by SEQ ID NO: 29 while its heavy chain is represented by SEQ ID NO: 33), which was used as a positive control to compete with the ไลโปคาลิน มิวทีนs for binding to hPCSK9. Data were fitted with a single-site binding แบบจำลอง.
[0018] Figure 8: demonstrates that the ไลโปคาลิน มิวทีนs of SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 20 and their respective PEGylated รูปแปรผัน of SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32 are capable of blocking biological activity of hPCSK9 in a cell-based LDL-R depletion assay. Dilution series of the tested ไลโปคาลิน มิวทีนs and negative control of SEQ ID NO: 2 are incubated with a constant concentration of hPCSK9 on LDL starved HepG2 cells. Levels of LDL-R on the HepG2 surface were assessed by using a specific goat anti-hLDL-R antibody (R&D Cat. No. AF2148). PCSK9-induced maximal LDL-R internalization was set up at 100%. Addition of ไลโปคาลิน มิวทีนs blocked PCSK9's activity in a dose-dependent manner. In this regard, IC50 values for ไลโปคาลิน มิวทีนs of SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 20 were 76 nM, 103 nM and 91 nM, respectively. Thus, PEGylation did not affect ไลโปคาลิน มิวทีนs' blocking ability since IC50 measured for the PEGylated ไลโปคาลิน มิวทีนs (ซึ่งประกอบรวมด้วย SEQ ID NOs: 30-32, respectively, which represent amino acid sequences of รูปแปรผัน of three ไลโปคาลิน มิวทีนs of the การเปิดเผย but do not include sequence of the polyethylene glycol (PEG) molecule) did not differ from their respective unPEGylated forms (SEQ ID NOs: 13, 20 and 22, respectively). Negative control of SEQ ID NO: 2 had no effect on PCSK9's activity. In summary, the ไลโปคาลิน มิวทีนs inhibited biological activity of PCSK9 and therefore restore LDL-R on the cell surface. The data was fitted with a sigmoidal dose-response แบบจำลอง.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

111. คำอธิบายของตัวเลข[0011] รูป 1: ให้วัดทั่วไปในอัตราและปิดอัตรา โดยการสั่นพ้อง Plasmon ผิว มิวทีนs ไลโปคาลินลำดับ ID ไม่: 3 เลขรหัสลำดับ: 4 เลขรหัสลำดับ: 6 และเลขรหัสลำดับ: 11 ผลลัพธ์ dissociation ค่าคงที่ (เกาะ) กับฮิวเมน PCSK9 ("hPCSK9") (เลขลำดับ ID: 34), สมาคมราคา (คอน), และราคา dissociation (k0tt) ได้สรุปไว้ในตารางที่ 1 ตัวอย่าง 6[0012] Figure2: แสดงให้เห็นว่า มิวทีนs ไลโปคาลินลำดับรหัสเลข: 3 ลำดับ ID ไม่:4 ลำดับ ID ไม่: 6 ลำดับ ID ไม่: 7 และเลขลำดับ ID: 8 มีความสามารถในการบล็อกการโต้ตอบระหว่าง PCSK9 และของตัวรับ LDL-อาร์ HPCSK9 แบบ biotinylated (รูป 2A) หรือ mutant hPCSK.9_D374Y biotinylated (รูปที่ 2B) ได้ล่วงหน้า incubated กับตัวแปรความเข้มข้นของ มิวทีนs กล่าวว่า และไม่ใช่ neutralized PCSK9 ถูก quantified บนแผ่นการ ELISA กับละลายเอนไซม์อาร์ LDL ลบตัวควบคุมลำดับ ID NO: 2 มีผลการแข่งขันไม่ ข้อมูลถูกติดตั้ง ด้วยแบบจำลองแบบผูก ค่า IC50 ผลลัพธ์จะถูกสรุปในตารางที่ 2 ตัวอย่างที่ 7[0013] รูป 3: แสดงโพรไฟล์ crossreactivity มิวทีนs ไลโปคาลินของเลขรหัสลำดับ: 3 เลขรหัสลำดับ: 4 ลำดับ ID ไม่: 5 เลขรหัสลำดับ: 6 เลขรหัสลำดับ: 7 เลขรหัสลำดับ: 8 และเลขรหัสลำดับ: 9 วัดในรูปแบบ ELISA Crossreactivity เต็มรูปแบบของ มิวทีนs ไลโปคาลิน hPCSK9 D374Y mutant และลิง cynomolgus PCSK9 จะเห็นได้จากค่าเกาะเกือบเหมือนกัน (ดูตาราง 3) ภายในช่วงความเข้มข้นที่ทดสอบ ได้ยัง crossreactivity เมาส์ PCSK9 แต่แอฟฟินิตี้ล่าง ผูกไม่พบตัวควบคุมลบ (ลำดับ ID ไม่: 2) ข้อมูลถูกติดตั้ง ด้วยแบบจำลองแบบผูก[0014] เลข 4: แสดงที่ มิวทีนs ไลโปคาลินของเลขลำดับ: 3 เลขลำดับ: 4ฉันลำดับเลข: 6 เลขลำดับ: 7 และเลขลำดับ: 8 มีประสิทธิภาพในบล็อก hPCSK9 ผูกกับของตัวรับ LDL-R ในการวิเคราะห์ที่ใช้เซลล์ การวิเคราะห์ยึดตาม PCSK9 เกิด internalization ของ LDL-R บนเซลล์ HepG2 นำไปดูดซับ intracellular ลดของ LDL Dil• fluorescence ป้าย เซลล์เป็น incubated กับความเข้มข้นคงที่ของ hPCSK9 (100 นาโนเมตร) และ titrated กับไลโปคาลิน มิวทีนs ลงจุดเป็นสัญญาณมาตรฐาน fluorescence ของ intracellular Dil-LDL วัดที่ 485/535 นาโนเมตรที่ใช้อ่าน BMG PheraStar กับ มิวทีนs ofไลโปคาลิน ความเข้มข้น ค่า IC50 ผลลัพธ์สำหรับ มิวทีนs ไลโปคาลินของเลขลำดับ: 3 เลขลำดับ: 4 ลำดับเลข: 6 เลขลำดับ: 7 และเลขลำดับ: 8 แสดงไว้ในตาราง 4 รวม มิวทีนs ไลโปคาลินไป PCSK9 คืนค่า PCSK9 mediated ลด Dil LDL ดูดซับเข้าไปในเซลล์ในขณะที่การควบคุมลำดับการลบรหัสไม่: 2 ได้ผลไม่ เส้นโค้งถูกติดตั้ง โดย GraphPad ปริซึม 4 ใช้ถดถอยไม่เชิงเส้น "sigmoidal ยา - ตอบสนอง ความชันตัวแปร" แบบจำลอง (5PL พอดี) ข้อมูลได้ตามปกติตามค่าของ PCSK9 เซลล์ขาวกระตุ้น และไม่ถูกกระตุ้น[0015] รูป 5: ให้วัดทั่วไปในอัตราและปิดอัตราสำหรับผูก และ unbinding ของ มิวทีนs ไลโปคาลินของเลขรหัสลำดับ: 13 (รูป 5C), เลขลำดับ ID: 20 (รูปของ 5A) ลำดับ ID ไม่: 21 (รูป SB) กับ hPCSK9 วัดจากการสั่นพ้อง Plasmon พื้นผิว K0s ผลได้สรุปไว้ในตาราง (ดูตัวอย่าง 10) 5[0016] รูปที่ 6: ให้วัดทั่วไปในอัตราและปิดอัตราสำหรับผูก และ unbinding ของไลโปคาลินมิวทีน (ลำดับ ID ไม่: 20) หลากหลาย PCSK9 สายพันธุ์วัดจากการสั่นพ้อง Plasmon พื้นผิว เกิดเกาะสำหรับไลโปคาลินมิวทีนลำดับ ID ไม่: 20 และ มิวทีนs อื่น ๆ ได้สรุปไว้ในตาราง (ดูตัวอย่าง 11) 6[0017] เลข 7: แสดงให้เห็นว่า รุ่น PEGylated มิวทีนs ไลโปคาลินของลำดับรหัสไม่: 30 ลำดับ ID ไม่: 31 และเลขรหัสลำดับ: 32 มีความสามารถในการผูกกับ hPCSK9 กับ IC50 0.19, 0.53 และ 0.37 nM ตามลำดับ เช่นเดียวกับที่ unmodified มิวทีนไลโปคาลินของลำดับรหัสไม่: 13 ซึ่งแสดง IC50 0.16 nM Biotinylated hPCSK9 เป็น pre• incubated กับตัวแปรความเข้มข้นของไลโปคาลิน มิวทีนs และ hPCSK9 ไม่ใช่ neutralized ถูก quantified บนแผ่น ELISA การตรึง ด้วยแอนติบอดีเกณฑ์มาตรฐาน (ของสายไฟจะถูกแสดง ด้วยเลขลำดับ ID: 29 ขณะที่ห่วงโซ่ของหนักจะแทน ด้วยเลขรหัสลำดับ: 33), ซึ่งถูกใช้เป็นตัวควบคุมบวกให้สามารถแข่งขันกับ มิวทีนs ไลโปคาลินสำหรับผูกกับ hPCSK9 ข้อมูลถูกติดตั้ง ด้วยแบบจำลองแบบผูก [0018] Figure 8: demonstrates that the ไลโปคาลิน มิวทีนs of SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 20 and their respective PEGylated รูปแปรผัน of SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32 are capable of blocking biological activity of hPCSK9 in a cell-based LDL-R depletion assay. Dilution series of the tested ไลโปคาลิน มิวทีนs and negative control of SEQ ID NO: 2 are incubated with a constant concentration of hPCSK9 on LDL starved HepG2 cells. Levels of LDL-R on the HepG2 surface were assessed by using a specific goat anti-hLDL-R antibody (R&D Cat. No. AF2148). PCSK9-induced maximal LDL-R internalization was set up at 100%. Addition of ไลโปคาลิน มิวทีนs blocked PCSK9's activity in a dose-dependent manner. In this regard, IC50 values for ไลโปคาลิน มิวทีนs of SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 20 were 76 nM, 103 nM and 91 nM, respectively. Thus, PEGylation did not affect ไลโปคาลิน มิวทีนs' blocking ability since IC50 measured for the PEGylated ไลโปคาลิน มิวทีนs (ซึ่งประกอบรวมด้วย SEQ ID NOs: 30-32, respectively, which represent amino acid sequences of รูปแปรผัน of three ไลโปคาลิน มิวทีนs of the การเปิดเผย but do not include sequence of the polyethylene glycol (PEG) molecule) did not differ from their respective unPEGylated forms (SEQ ID NOs: 13, 20 and 22, respectively). Negative control of SEQ ID NO: 2 had no effect on PCSK9's activity. In summary, the ไลโปคาลิน มิวทีนs inhibited biological activity of PCSK9 and therefore restore LDL-R on the cell surface. The data was fitted with a sigmoidal dose-response แบบจำลอง.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

111 คำอธิบายของตัวเลข[0011] รูปที่ 1: ให้วัดในแบบฉบับของอัตราและอัตราการออกจากพื้นผิว Plasmon Resonance สำหรับไลโปคาลินมิวทีน s SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 6 และ SEQ ID NO: 11 คงที่แยกตัวออกผล (Ko) การฮิวเมน PCSK9 ("hPCSK9") (SEQ ID NO: 34) อัตราการสมาคม (กรณ์) และอัตราการแยกตัวออก (k0tt ) ได้สรุปไว้ในตารางที่ 1 ตัวอย่างของ 6 [0012] Figure2: แสดงให้เห็นว่าไลโปคาลินมิวทีน s SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 และรหัส SEQ NO: 8 มีความสามารถในการปิดกั้นการทำงานร่วมกันระหว่าง PCSK9 และรับของ LDL-R ทั้ง biotinylated hPCSK9 (รูป 2A) หรือ biotinylated กลายพันธุ์ hPCSK.9_D374Y (รูป 2B) ได้รับก่อนการบ่มที่มีความเข้มข้นของตัวแปรกล่าวว่ามิวทีนและ PCSK9 ที่ไม่เป็นกลางถูกวัดบนจานด้วยวิธี ELISA ที่ละลายน้ำได้ตรึง LDL-R การควบคุมเชิงลบ ID SEQ NO: 2 ไม่มีผลการแข่งขัน ข้อมูลการติดตั้งเว็บไซต์เดียวที่มีผลผูกพันแบบจำลอง ส่งผลให้ค่า IC50 ได้สรุปไว้ในตารางที่ 2 ของตัวอย่าง 7. [0013] รูปที่ 3: แสดงรายละเอียด crossreactivity ของไลโปคาลินมิวทีนของ SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, ID SEQ NO : 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 และ SEQ ID NO: 9 วัดในรูปแบบวิธี ELISA crossreactivity เต็มรูปแบบของไลโปคาลินมิวทีนที่จะกลายพันธุ์ D374Y hPCSK9 และ PCSK9 ลิง cynomolgus จะเห็นได้จากค่าเกือบจะเหมือนกับเกาะ (ดูตารางที่ 3) อยู่ในช่วงความเข้มข้นที่ผ่านการทดสอบนอกจากนี้ยังมีการ crossreactivity PCSK9 เมาส์ที่ต่ำกว่า แต่มีแอฟฟินิตี้ ไม่มีผลผูกพันที่ตรวจพบของการควบคุมลบ (SEQ ID NO: 2) ข้อมูลการติดตั้งเว็บไซต์เดียวที่มีผลผูกพันแบบจำลอง. [0014] รูปที่ 4: แสดงให้เห็นว่าไลโปคาลินมิวทีนของ SEQ NO: 3, SEQ NO: 4, ผมSEQ NO: 6 SEQ NO : 7 และ SEQ NO: 8 ที่มีประสิทธิภาพในการป้องกัน hPCSK9 ผูกพันกับตัวรับของ LDL-R ในการทดสอบมือถือที่ใช้ การทดสอบจะขึ้นอยู่กับ internalization PCSK9 ที่เกิดขึ้นของระดับ LDL-R เซลล์ HepG2 ที่นำไปสู่การดูดซึมในเซลล์ที่ลดลงของดิลเรืองแสงที่มีข้อความ• LDL เซลล์มีการบ่มที่มีความเข้มข้นคงที่ของ hPCSK9 (100 นาโนเมตร) และปรับขนาดด้วยไลโปคาลินมิวทีน s พล็อตเป็นสัญญาณเรืองแสงปกติภายในเซลล์ดิล LDL-วัดที่ 485/535 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านสบาย PheraStar กับความเข้มข้นของไลโปคาลินมิวทีนฯ ส่งผลให้ค่า IC50 ค่าสำหรับไลโปคาลินมิวทีนของ SEQ NO: 3, SEQ NO: 4, SEQ NO: 6 SEQ NO: 7 และ SEQ NO: 8 จะได้รับในตารางที่ 4 เข้าเล่มของไล โปคาลินมิวทีนที่จะเรียกคืน PCSK9 ลด PCSK9 พึ่งการดูดซึมของดิล LDL-เข้าสู่เซลล์ในขณะที่การควบคุมเชิงลบของ SEQ ID NO: 2 ไม่มีผล เส้นโค้งพอดีโดยปริซึม GraphPad 4 โดยใช้การถดถอยเชิงเส้น "ยา sigmoidal - ตอบสนองความลาดชันตัวแปร" แบบจำลอง (5PL พอดี) ข้อมูลปกติโดยมูลค่าของ PCSK9 กระตุ้นและไม่กระตุ้นเซลล์. [0015] รูปที่ 5: ให้วัดโดยทั่วไปของในอัตราและปิดอัตราผูกพันและ unbinding ของไลโปคาลินมิวทีนของ ID SEQ NO: 13 (รูป 5C) SEQ ID NO: 20 (รูป 5A) และ SEQ ID NO: 21 (รูป SB) เพื่อ hPCSK9 โดยวัดจากพื้นผิว Plasmon Resonance K0s ส่งผลให้มีรายละเอียดในตารางที่ 5 (ดูตัวอย่าง 10). [0016] รูปที่ 6: ให้วัดโดยทั่วไปของในอัตราและปิดอัตราผูกพันและ unbinding ของไลโปคาลินมิวทีน (SEQ ID NO: 20) สายพันธุ์ PCSK9 ต่างๆโดยวัดจากพื้นผิว Plasmon Resonance ส่งผลให้เกาะสำหรับไลโปคาลินมิวทีน SEQ ID NO: 20 และอื่น ๆ มิวทีน s ได้สรุปไว้ในตารางที่ 6 (ดูตัวอย่าง 11). [0017] รูปที่ 7: แสดงให้เห็นว่ารุ่น PEGylated ของไล โปคาลินมิวทีนของ SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32 มีความสามารถในการเชื่อมโยงไป hPCSK9 กับ IC50 เท่ากับ 0.19, 0.53 และ 0.37 นาโนเมตรตามลำดับเช่นเดียวกับ ยังไม่แปรไลโปคาลินมิวทีนของ SEQ ID NO: 13 ซึ่งแสดงข้อ IC50 0.16 นาโนเมตร biotinylated hPCSK9 ได้ก่อน•บ่มที่มีความเข้มข้นตัวแปรของไลโปคาลินมิวทีนและ hPCSK9 ที่ไม่เป็นกลางถูกวัดบนแผ่นวิธี ELISA ตรึงกับแอนติบอดีมาตรฐาน (โซ่แสงเป็นตัวแทนจาก SEQ ID NO: 29 ในขณะที่ ห่วงโซ่หนักเป็นตัวแทนจาก SEQ ID NO: 33) ซึ่งถูกใช้เป็นตัวควบคุมในเชิงบวกที่จะแข่งขันกับไลโปคาลินมิวทีนสำหรับผูกพันกับ hPCSK9 ข้อมูลการติดตั้งเว็บไซต์เดียวที่มีผลผูกพันแบบจำลอง. [0018] รูปที่ 8: แสดงให้เห็นว่าไลโปคาลินมิวทีนของ SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 20 ตน PEGylated รูปแปรผันของ SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32 มีความสามารถในการปิดกั้นกิจกรรมทางชีวภาพของ hPCSK9 ในเซลล์ที่ใช้ทดสอบการสูญเสีย LDL-R การลดสัดส่วนของชุดทดสอบไลโปคาลินมิวทีนและการควบคุมเชิงลบของ SEQ ID NO: 2 บ่มที่มีความเข้มข้นอย่างต่อเนื่องของ hPCSK9 ใน LDL หิวโหยเซลล์ HepG2 ระดับของ LDL-R บนพื้นผิว HepG2 ได้รับการประเมินโดยใช้แพะเฉพาะแอนติบอดีต่อต้าน hLDL-R (R & D แมว. ฉบับที่ AF2148) สูงสุด PCSK9 ที่เกิด internalization LDL-R ถูกจัดตั้งขึ้นที่ 100% การเพิ่มขึ้นของไลโปคาลินมิวทีน s บล็อกกิจกรรม PCSK9 ในลักษณะที่ขึ้นอยู่กับปริมาณ ในการนี้ค่า IC50 สำหรับไลโปคาลินมิวทีนของ SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 13 ID SEQ NO: 20 เป็น 76 นาโนเมตร, 103 นาโนเมตรและ 91 นาโนเมตรตามลำดับ ดังนั้น PEGylation ไม่ได้ส่งผลกระทบต่อไลโปคาลินมิวทีน s 'ปิดกั้นความสามารถตั้งแต่ IC50 วัดสำหรับ PEGylated ไลโปคาลินมิวทีนวินาที (ซึ่งประกอบรวมด้วย SEQ ID NOS: 30-32 ตามลำดับ ซึ่งเป็นตัวแทนของลำดับกรดอะมิโนรูปแปรผันในสามของไลโปคาลินมิวทีน s ของการเปิดเผย แต่ไม่รวมถึงลำดับของคอลพลาสติก (PEG) โมเลกุล) ไม่แตกต่างจากรูปแบบ unPEGylated ของตน (SEQ ID NOS : 13, 20 และ 22 ตามลำดับ) การควบคุมเชิงลบของ SEQ ID NO: 2 ไม่มีผลกระทบต่อกิจกรรมของ PCSK9 โดยสรุปไลโปคาลินมิวทีน s ยับยั้งฤทธิ์ทางชีวภาพของ PCSK9 และดังนั้นจึงเรียกคืน LDL-R บนผิวเซลล์ ข้อมูลที่ถูกติดตั้ง sigmoidal ปริมาณการตอบสนองแบบจำลอง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

111 . รายละเอียดของตัวเลข


[ 0011 ] รูปที่ 1 : แสดงโดยทั่วไปการวัดอัตรา และปิดเท่ากันโดยเสียงสะท้อน PLASMON พื้นผิวสำหรับไลโปคาลินมิวทีน s seq id ไม่ : 3 , seq id : 4 , seq id ไม่มี seq id : 6 : 11 ผลการฮิวเมนค่าคงที่ ( Ko ) pcsk9 ( " hpcsk9 " ) ( seq id : 34 ) สมาคมอัตรา ( คน )และอัตราการ k0tt ) สรุปได้ในตารางที่ 1 ตัวอย่าง 6 .

[ 0012 ] ภาพที่ 2 : แสดงให้เห็นว่า ไลโปคาลินมิวทีน s seq id ไม่ : 3 , seq id :

4 , seq id : 6 , seq id : 7 และ seq id ไม่มี : 8 มีความสามารถในการปิดกั้นปฏิสัมพันธ์ระหว่าง pcsk9 และตัวรับ ldl-r. ให้ไล hpcsk9 ( รูป 2A ) หรือไล hpcsk .9_d374y กลายพันธุ์ ( รูป 2B ) ก่อนแยกแปรความเข้มข้นของบอกว่ามิวทีน S และไม่ทำให้ pcsk9 เป็นวัดบน Elisa จานตรึงละลาย ldl-r. ลบ seq ควบคุมไม่มี ID : 3 ไม่มีผลการแข่งขัน ข้อมูล แบบจำลองผูกให้พอดีกับเว็บไซต์เดียว . ผล ic50 ค่าสรุปได้ในตารางที่ 2 ของตัวอย่าง 7 .

[ 0013 ] รูปที่ 3 :แสดง crossreactivity โปรไฟล์ของไลโปคาลินมิวทีน s seq ไม่มี ID : 3 , seq id : 4 , seq id : 5 , seq id : 6 , seq id : 7 , seq หมายเลข 8 และหมายเลข seq 9 วัดในรูปแบบวิธีอีไลซ่า crossreactivity เต็มของไลโปคาลินมิวทีน S hpcsk9 d374y กลายพันธุ์และ pcsk9 ลิง cynomolgus เห็นได้ชัดจากเกือบเหมือนกัน โคค่า ( ดูตารางที่ 3 )ในช่วงของการทดสอบ ยังมี crossreactivity เพื่อ pcsk9 เมาส์แต่แอฟฟินิตี้ต่ำกว่า ไม่มีผลที่ตรวจพบในดิน ( seq id : 2 ) ข้อมูล แบบจำลองผูกให้พอดีกับเว็บไซต์เดียว

[ 0014 ] รูปที่ 4 : แสดงให้เห็นว่าไลโปคาลินมิวทีน s seq ไม่ : 3 , seq : 4

ผม seq ไม่มี : 6 : 7 และ seq ไม่มี seq no :8 ประสิทธิภาพในบล็อก hpcsk9 ผูกกับตัวรับของ ldl-r ใน ( ปัจจุบัน ( ขึ้นอยู่กับ pcsk9 ชักนำ internalization ของ ldl-r ในเซลล์มะเร็งตับที่นำไปสู่การลดการเรืองแสงป้ายภาษาบวกในอนาคต เซลล์ที่บ่มด้วยคงความเข้มข้นของ hpcsk9 ( 100 nm ) และตลอดเวลาด้วยไลโปคาลินมิวทีน sวางแผนเป็นปกติ การส่งสัญญาณภายในเซลล์ดิล ( วัดที่ 485 / 535 nm ใช้ BMG pherastar อ่านต่อความเข้มข้นของไลโปคาลินมิวทีน s เป็นผล ic50 ค่าไลโปคาลินมิวทีน s seq ไม่ : 3 : 4 seq ไม่มี seq ไม่มี : 6 : 7 และไม่มี seq ไม่มี seq 8 คือ ให้ตารางที่ 4ผูกพันของไลโปคาลินมิวทีน S pcsk9 เรียกคืน pcsk9 เพื่อลดการดูดซึมเข้าสู่เซลล์ ส่วนภาษา LDL ความไม่ชอบมาพากลของ seq ไม่มี ID : 2 ไม่มีผลเลย เส้นโค้งถูกติดตั้งโดย graphpad ปริซึม 4 โดยใช้การถดถอย " เชิงปริมาณการตอบสนอง sigmoidal ตัวแปรแบบจำลองชัน " ( 5pl พอดี ) ข้อมูล รูป โดยมูลค่าของ pcsk9 กระตุ้นและไม่กระตุ้นเซลล์ .

[ 0 , 015 ] รูปที่ 5 : แสดงโดยทั่วไปการวัดอัตราและอัตราการ unbinding ของไลโปคาลินมิวทีน s seq ไม่มี ID : 13 ( รูป 5C ) , seq id : 20 ( รูป 5A ) และ seq id : 21 ( รูป SB ) hpcsk9 วัดโดยเรโซแนนซ์ PLASMON พื้นผิว ผล k0s สรุปได้ในตารางที่ 5 ( เห็นตัวอย่าง 10 )

[ 0016 ] รูปที่ 6 :ให้บริการโดยทั่วไปการวัดอัตราและอัตราการ unbinding ของไลโปคาลินมิวทีน ( seq ไม่มี ID : 20 ) pcsk9 ชนิดต่างๆซึ่งวัดโดยเสียงสะท้อน PLASMON พื้นผิว ส่งผลให้เกาะสำหรับไลโปคาลินมิวทีน seq ไม่มี ID : 20 และอื่น ๆ มิวทีน s สรุปได้ในตารางที่ 6 ( เห็นตัวอย่าง 11 )

[ 0017 ] รูปที่ 7 :แสดงให้เห็นว่า pegylated รุ่นไลโปคาลินมิวทีน s seq ไม่มี ID : 30 : 31 หมายเลข seq seq id : 32 มีความสามารถในการจับกับ hpcsk9 กับ ic50 ของ 0.19 , 0.53 และ 0.37 nm ตามลำดับ คล้ายกับแปรไลโปคาลินมิวทีน seq ของหมายเลข 13 ซึ่งแสดง ic50 0.16 nm .ไล hpcsk9 เป็น Pre - บ่มตามความเข้มข้นของไลโปคาลินมิวทีน S และไม่ทำให้ hpcsk9 ถูก quantified ในวิธีตรึงกับแผ่นมาตรฐาน แอนติบอดี ( แสงโซ่ แทนด้วยหมายเลข seq : 29 ขณะที่หนักโซ่แทนโดย seq ไม่มี ID : 33 )ซึ่งใช้เป็นตัวควบคุมบวกเพื่อแข่งขันกับไลโปคาลินมิวทีนสำหรับผูก hpcsk9 . ข้อมูล แบบจำลองผูกให้พอดีกับเว็บไซต์เดียว .
[ 0018 ] รูปที่ 8 : แสดงให้เห็นว่า ไลโปคาลินมิวทีน s seq ไม่มี ID : 22 , seq id : 13 : 20 หมายเลข seq และ pegylated ของตนรูปแปรผัน seq ไม่มี ID : 30 : 31 หมายเลข seq seq id ไม่ :32 มีความสามารถในการปิดกั้นและฤทธิ์ทางชีวภาพของ hpcsk9 ในปัจจุบัน ldl-r หมดสิ้น ตามลำดับ ในชุดของการทดสอบไลโปคาลินมิวทีนและความไม่ชอบมาพากลของ seq ไม่มี ID : 2 แยก คงความเข้มข้นของ hpcsk9 ใน LDL อดอาหารเซลล์มะเร็งตับ . ระดับของ ldl-r บนพื้นผิวมะเร็งตับมีการประเมินโดยใช้เฉพาะแพะ anti-hldl-r แอนติบอดี ( R &มแมว ไม่ af2148 )pcsk9 ชักนำ internalization ldl-r สูงสุดตั้งที่ 100 % นอกจากนี้ไลโปคาลินมิวทีน s บล็อก pcsk9 เป็นกิจกรรมในลักษณะปิดกั้น . ในการนี้ ic50 ค่าของไลโปคาลินมิวทีน seq ไม่มี ID : 22 , seq id : 13 : 20 หมายเลข seq เป็น 76 nm , 103 nm และ 91 nm ตามลำดับ ดังนั้นpegylation ไม่มีผลต่อไลโปคาลินมิวทีน ' ปิดกั้นความสามารถตั้งแต่ ic50 วัดสำหรับ pegylated ไลโปคาลินมิวทีน S ( ซึ่งประกอบรวมด้วย seq id NOS : 30-32 ตามลำดับซึ่งเป็นตัวแทนของลำดับกรดอะมิโนของรูปแปรผันสามไลโปคาลินมิวทีนของการเปิดเผยแต่ไม่ได้รวมถึงการเรียงลำดับของ polyethylene glycol ( PEG ) โมเลกุล ) ไม่แตกต่างจากรูปแบบ unpegylated ของตน ( seq id หมายเลข 13 , 20 และ 22 ตามลำดับ ) ความไม่ชอบมาพากลของ seq ไม่มี ID : 2 ไม่มีผลต่อกิจกรรม pcsk9 . กล่าวโดยสรุปการไลโปคาลินมิวทีน s ยับยั้งฤทธิ์ทางชีวภาพของ pcsk9 จึงเรียกคืน ldl-r บนพื้นผิวเซลล์ ข้อมูลที่ถูกติดตั้งกับแบบจำลองความคิดเห็น
sigmoidal .