Thermostable DNA polymerases with p

Thermostable DNA polymerases with proofreading activity, such as Pfu DNA Polymerase (Cat.# M7741),
Pwo DNA polymerase and Tli DNA Polymerase, generate blunt-ended fragments. Nevertheless, PCR products generated using these polymerases can be modified using the A-tailing procedure outlined in Figure 3 and ligated into the pGEM®-T and pGEM®-T Easy Vectors (5). Using this method, only one insert will be ligated into the vector (as opposed to multiple insertions that can occur with blunt-ended cloning). In addition, with T-vector cloning there is no need to dephosphorylate the vector, and there is a low background of religated vector.
Using this procedure with optimized insert:vector ratios, 55–95% recombinants were obtained when Pfu and Tli DNA Polymerases were used to generate the insert DNA (Table 2). It is critical that the PCR fragments are purified using the Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Cat.# A9281) or by direct isolation from a gel by other means. In the absence of purification, the proofreading activity of the Pfu, Pwo and Tli DNA Polymerases will degrade the PCR fragments, or remove the 3´-terminal deoxyadenosine added during tailing or the 3´-terminal deoxythymidine from the vector during the A-tailing reaction or ligation. To optimize cloning efficiency, the amount of DNA in the A-tailing reaction and the ligation volumes must be adjusted depending on the molar yield of the purified PCR product. When molar concentrations are high due to small fragment size and/or good amplification, small volumes of the PCR fragment are needed for the A-tailing and ligation reactions. However, when molar concentration is low due to large fragment size and/or poor amplification, large volumes of the
PCR fragment are needed for the A-tailing and ligation reactions. We have successfully used 1–7μl of purified PCR fragment in A-tailing reactions to optimize the insert:vector ratio. (See Section 3.B for further discussion of optimizing the insert:vector ratio.) Recombinants were identified by blue/white screening, and 70–100% were shown to have the correct size insert by PCR. Few recombinants were observed in control reactions in which the PCR fragment was not tailed. These control results confirm that the majority of the pGEM®-T Easy Vector used contained 3´-terminal deoxythymidine and that, during the A-tailing, Taq DNA Polymerase added a 3´-terminal deoxyadenosine to a significant proportion of the PCR fragments.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Polymerases DNA thermostable กับกิจกรรม เช่น Pfu ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (Cat. # M7741), การตรวจทานPwo ดีเอ็นเอพอลิเมอเรสและ Tli ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส สร้างบางส่วนของทู่สิ้นสุด อย่างไรก็ตาม ผลิตภัณฑ์ PCR ที่สร้างขึ้นโดยใช้ polymerases เหล่านี้สามารถปรับเปลี่ยนได้โดยใช้ขั้นตอน A-tailing ระบุไว้ในรูปที่ 3 กควบ pGEM ® T และ pGEM ®-T ง่ายเวกเตอร์ (5) ใช้วิธีนี้ เดียวแทรกจะเป็น ligated เป็นเวกเตอร์ (ตรงข้ามกับแทรกหลายที่อาจเกิดขึ้นกับโคลนทู่สิ้นสุด) นอกจากนี้ กับเวกเตอร์ T โคลน ไม่จำเป็นต้อง dephosphorylate เวกเตอร์ และมีพื้นที่ต่ำสุดของเวกเตอร์ religatedใช้ขั้นตอนนี้ มีอัตราส่วนเพิ่มประสิทธิภาพแทรก: เวกเตอร์ recombinants 55-95% ได้รับเมื่อใช้ Pfu และ Tli Polymerases ดีเอ็นเอสร้างดีเอ็นเอแทรก (ตารางที่ 2) มันมีความสำคัญว่า ชิ้นส่วน PCR บริสุทธิ์โดยใช้ตัวช่วยสร้าง®เอสเจและ PCR ล้างระบบ (Cat. # A9281) หรือโดยตรงแยกจากเจ โดยวิธีอื่น ในกรณีทำให้บริสุทธิ์ กิจกรรม proofreading Pfu, Pwo และ Tli Polymerases ดีเอ็นเอจะลดทอนแยกส่วน PCR หรือเอา deoxyadenosine 3´ นัลเพิ่มระหว่าง tailing หรือ deoxythymidine 3´ เทอร์มินัลจากเวกเตอร์ในระหว่างปฏิกิริยา A tailing หรือไข่ออก เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพในการโคลน ต้องปรับจำนวนของดีเอ็นเอในปฏิกิริยา A tailing และปริมาณไข่ขึ้นอยู่กับผลตอบแทนสบผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์ เมื่อสบความเข้มข้นสูงเนื่องจากมีขนาดเล็กส่วนหรือขยายดี ส่วน PCR ขนาดเล็กจำนวนมากมีความจำเป็นสำหรับปฏิกิริยา A tailing และไข่ อย่างไรก็ตาม เมื่อสบความเข้มข้นจะต่ำเนื่องจากส่วนใหญ่ขนาด หรือขยายดี จำนวนมากส่วน PCR มีความจำเป็นสำหรับปฏิกิริยา A tailing และไข่ เราได้ใช้ 1 – 7μl ของบริสุทธิ์ส่วน PCR ในปฏิกิริยา A tailing สำเร็จปรับอัตราส่วนแทรก: เวกเตอร์ (ดูส่วน 3.B สำหรับคำอธิบายเพิ่มเติมของเพิ่มประสิทธิภาพอัตราการแทรก: เวกเตอร์) ระบุ recombinants โดยคัดกรองสีน้ำเงิน/ขาว และ 70 – 100% ได้แสดงให้มีขนาดถูกต้องที่แทรก ด้วย PCR Recombinants ไม่กี่ตั้งสุภัคควบคุมปฏิกิริยาซึ่งส่วน PCR ถูกไม่หาง ควบคุมผลลัพธ์เหล่านี้ยืนยันว่า ส่วนใหญ่ของ pGEM ®-T เวกเตอร์ง่ายใช้อยู่ deoxythymidine 3´ เทอร์มินัล และที่ ระหว่าง A-tailing, Taq DNA พอลิเมอเรสเพิ่ม deoxyadenosine เทอร์มินัล 3´ สัดส่วนสำคัญของการกระจายตัวของ PCR

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ดีเอ็นเอ polymerases ทนความร้อนกับกิจกรรมพิสูจน์อักษรเช่นดีเอ็นเอ Pfu โพลิเมอร์ (Cat. # M7741)
ดีเอ็นเอโพลิเมอร์โปและ DNA Polymerase Tli สร้างชิ้นส่วนทื่อสิ้นสุดวันที่ อย่างไรก็ตามผลิตภัณฑ์ที่สร้างขึ้นโดยใช้วิธี PCR polymerases เหล่านี้สามารถแก้ไขได้โดยใช้ A-tailing ขั้นตอนที่ระบุไว้ในรูปที่ 3 และ ligated เข้าไปในpGEM®-T และ T-pGEM®เวกเตอร์ง่าย (5) ใช้วิธีนี้เพียงคนเดียวที่จะได้รับการใส่ลงไปใน ligated เวกเตอร์ (เมื่อเทียบกับการแทรกหลายตัวที่อาจเกิดขึ้นกับการโคลนทื่อปลาย) นอกจากนี้ยังมีการโคลน T-เวกเตอร์ไม่มีความจำเป็นที่จะ dephosphorylate เวกเตอร์และมีพื้นหลังที่ต่ำของเวกเตอร์ religated.
ใช้ขั้นตอนนี้ที่มีการแทรกที่ดีที่สุด: อัตราส่วนเวกเตอร์ 55-95% โคที่ได้รับเมื่อ Pfu และ Tli polymerases ดีเอ็นเอ ถูกนำมาใช้ในการสร้างดีเอ็นเอแทรก (ตารางที่ 2) มันเป็นสิ่งสำคัญที่เศษ PCR บริสุทธิ์โดยใช้Wizard®เอเจลทำความสะอาดและ PCR-Up ระบบ (Cat. # A9281) หรือแยกตรงจากเจลโดยวิธีอื่น ๆ ในกรณีที่ไม่มีการทำให้บริสุทธิ์และการจัดกิจกรรมการพิสูจน์อักษรของ Pfu ที่โปและดีเอ็นเอ polymerases Tli จะลดเศษ PCR หรือลบ deoxyadenosine 3'ขั้วเพิ่มขึ้นในช่วง tailing หรือ deoxythymidine 3'ขั้วจากเวกเตอร์ในช่วง A-tailing ปฏิกิริยาหรือ ligation เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการโคลนปริมาณของดีเอ็นเอในปฏิกิริยา A-tailing และปริมาณ ligation จะต้องมีการปรับขึ้นอยู่กับอัตราผลตอบแทนกรามของผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์ เมื่อความเข้มข้นของฟันกรามที่สูงเนื่องจากขนาดชิ้นส่วนขนาดเล็กและ / หรือขยายที่ดีเล่มเล็ก ๆ ของส่วน PCR มีความจำเป็นสำหรับ A-tailing และปฏิกิริยา ligation แต่เมื่อความเข้มข้นของฟันกรามอยู่ในระดับต่ำเนื่องจากขนาดชิ้นส่วนที่มีขนาดใหญ่และ /
หรือขยายยากจนจำนวนมากของชิ้นส่วนPCR มีความจำเป็นสำหรับ A-tailing และปฏิกิริยา ligation เราได้ใช้ประสบความสำเร็จในส่วนของ1-7μl PCR บริสุทธิ์ปฏิกิริยา A-tailing เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการแทรกอัตราส่วนเวกเตอร์ (โปรดดูมาตรา 3.B สำหรับการอภิปรายต่อไปของการเพิ่มประสิทธิภาพแทรก:. อัตราส่วนเวกเตอร์) โคถูกระบุฟ้า / สีขาวการตรวจคัดกรองและ 70-100% ที่มีการแสดงที่จะมีการแทรกขนาดที่ถูกต้องโดยวิธี PCR โคบางคนตั้งข้อสังเกตในการควบคุมปฏิกิริยาที่ส่วน PCR ไม่ได้เทลด์ ผลการควบคุมเหล่านี้ยืนยันว่าส่วนใหญ่ของpGEM®-T ง่ายเวกเตอร์ที่ใช้มี deoxythymidine 3'-terminal และว่าในช่วง A-tailing ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ Taq เพิ่ม deoxyadenosine 3'-terminal เพื่อสัดส่วนที่สำคัญของเศษ PCR

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

polymerases ดีเอ็นเอกับพิสูจน์อักษรในกิจกรรมเช่นดีเอ็นเอพอลิเมอเรสพีเอฟยู ( แมว # m7741 )
ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส อคส. และดีเอ็นเอพอลิเมอเรส tli สร้างสิ้นสุดทู่ เศษ อย่างไรก็ตาม การสร้างผลิตภัณฑ์ PCR polymerases เหล่านี้สามารถแก้ไขได้โดยใช้ a-tailing ขั้นตอนที่ระบุไว้ในรูปที่ 3 และผูกเป็น pgem ® - T และ pgem ® - T เวกเตอร์ที่ง่าย ( 5 ) การใช้วิธีนี้เพียงหนึ่งแทรกจะผูกเป็นเวกเตอร์ ( ตรงข้ามกับแทรกหลายตัวที่สามารถเกิดขึ้นกับทื่อสิ้นสุดการโคลนนิ่ง ) นอกจากนี้ ด้วย t-vector โคลนไม่ต้อง dephosphorylate เวกเตอร์และมีพื้นหลังน้อยของ religated เวกเตอร์ โดยใช้ขั้นตอนนี้ใส่ด้วย (
: อัตราส่วนเวกเตอร์55 – 95 % recombinants ได้รับเมื่อพีเอฟยู tli สำนักงานปลัดกระทรวงศึกษาธิการและถูกใช้เพื่อสร้างแทรกดีเอ็นเอ ( ตารางที่ 2 ) มันเป็นสิ่งสำคัญว่า PCR เศษบริสุทธิ์ใช้ตัวช่วยสร้าง® SV เจลและ PCR ทำความสะอาดระบบ ( แมว # a9281 ) หรือโดยการแยกโดยตรงจากเจลโดยวิธีอื่น ในการขาดของการตรวจทานของพีเอฟยู , กิจกรรม ,อคส. และ tli สำนักงานปลัดกระทรวงศึกษาธิการจะลดลงจากเศษหรือเอา 3 ใหม่ - terminal ดีอ ซีแอดีโนซีนเพิ่มในระหว่างติดตามหรือ 3 ใหม่ - เทอร์มินอล deoxythymidine จากเวกเตอร์ในช่วง a-tailing ปฏิกิริยาหรือ Ligation . เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการ ปริมาณดีเอ็นเอในปฏิกิริยาและปริมาณ a-tailing Ligation ต้องปรับขึ้นอยู่กับผลผลิต PCR โดยบริสุทธิ์ผลิตภัณฑ์เมื่อความเข้มข้นโดยโมลจะสูงเนื่องจากขนาดชิ้นเล็ก ๆและ / หรือดีขยายปริมาณขนาดเล็กของ PCR ส่วนจำเป็นสำหรับปฏิกิริยา a-tailing Ligation และ . อย่างไรก็ตาม เมื่อกรามสมาธิต่ำเนื่องจากมีขนาดใหญ่ และ / หรือ เพิ่มจำนวน จน ปริมาณมากของ
PCR ส่วนจำเป็นสำหรับปฏิกิริยา a-tailing Ligation และ .เราได้ใช้ 1 – 7 μผมบริสุทธิ์จำเพาะใน a-tailing ปฏิกิริยา PCR เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการแทรกส่วนเวกเตอร์ ( ดูมาตรา 3 . B สำหรับการอภิปรายเพิ่มเติมในการเพิ่มแทรก : อัตราส่วน เวกเตอร์ recombinants กลุ่มสีฟ้า / ขาว คัดกรอง และ 70 - 100% มีการแสดงที่มีแทรกขนาดถูกต้องโดย PCRไม่กี่ recombinants พบในปฏิกิริยา PCR ส่วนการควบคุมที่ไม่ติดตามรึเปล่า ผลการควบคุมเหล่านี้ยืนยันว่าส่วนใหญ่ของ pgem ® -- เวกเตอร์ที่ง่ายไม่ใช้ที่มีอยู่ 3 ใหม่ - เทอร์มินอล deoxythymidine และในระหว่าง a-tailing ใช้ดีเอ็นเอได้ดีเพิ่ม 3 ขั้วดีอ ซีแอดีโนซีนกับส่วนใหญ่ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอใหม่
-