The final solutions of purified pDN

The final solutions of purified pDNA were analyzed for thepresence of host cell impurities. The presence of residual RNAwas assessed by agarose gel electrophoresis (see details above).Total protein was quantified using the BCA Protein Assay kit fromPierce (Rockford, EUA) according to the manufacturer instruc-tions. A calibration curve (5–400 g/mL) was constructed withbovine serum albumin standards. Absorbance was measured at562 nm in a microplate reader from Molecular Devices (Sun-nyvale, CA, USA). Quantitative real-time PCR was performed toquantify genomic (g) DNA contamination in pDNA-containingsamples, as originally described by Martins and colleagues in2003 (Martins et al., 2003). For this purpose, 0.4 L of sense(5-ACACGGTCCAGAACTCCTACG-3) and 0.4 L of anti-sense (5-GCCGGTGCTTCTTCTGCGGGTAACGTCA-3) primers, used to amplifythe 181-bp fragment of the 16 S rDNA E. coli gene, were mixedwith 1.6 L of MgCl2solution (2.0 mM final concentration), 11.6 LPCR grade water, 2.0 L of 10 × SYBR Green I mixture and 4.0 Lof sample. All PCR reactions were performed in a 20 L final vol-ume and carried out in a Roche LightCyclerTMdetection systemusing the following amplification program: 10 min at 95◦C plus40 cycles of 10 s at 95◦C, 5 s at 65◦C and 10 s at 72◦C. Thresh-old cycle (CT) values were calculated by the LightCycler softwareversion 3.4 (Roche Diagnostics) using the Fit Points method. MeanCTvalues and standard deviations were calculated from two inde-pendent assays. In addition, gDNA quantification was determinedfrom a calibration curve prepared in the range 8–80,000 pg by serialdilution of E. coli DH5 gDNA standards. Blank samples (withoutbiomolecules) were run in parallel with each sample analysis.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

แก้ไขครั้งสุดท้ายของ pDNA บริสุทธิ์ถูกวิเคราะห์สำหรับ thepresence ของสิ่งสกปรกเซลล์โฮสต์ ของ RNAwas ส่วนที่เหลือที่ประเมิน โดย agarose เจ electrophoresis (ดูรายละเอียดข้างต้น)โปรตีนรวมถูก quantified โดยใช้การวิเคราะห์โปรตีน BCA ชุด fromPierce (ร็อคฟอร์ด เอื้อ) ตามผู้ผลิต instruc-tions เส้นโค้งการปรับเทียบ (5 – 400 g/mL) เป็นมาตรฐาน serum albumin สร้าง withbovine Absorbance ที่วัด at562 nm ในอ่าน microplate จากอุปกรณ์โมเลกุล (ซัน-nyvale, CA, USA) PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ที่ทำ toquantify genomic (g) ดีเอ็นเอปนเปื้อนใน pDNA-containingsamples อธิบาย โดย in2003 Martins และเพื่อนร่วมงานเป็นครั้งแรก (Martins et al., 2003) สำหรับวัตถุประสงค์นี้ L 0.4 ของความรู้สึก (5 - ACACGGTCCAGAACTCCTACG-3) และไพรเมอร์ป้องกันความรู้สึก (5 - GCCGGTGCTTCTTCTGCGGGTAACGTCA-3) ใช้ส่วน 181bp amplifythe ของ 16 S rDNA E. coli ยีน 0.4 L ถูก mixedwith 1.6 L ของ MgCl2solution (2.0 มม.สุดท้ายเข้มข้น), 11.6 น้ำเกรด LPCR, 10 × SYBR 2.0 L เขียวผมผสมและตัวอย่าง Lof 4.0 ปฏิกิริยา PCR ทั้งหมดดำเนินใน 20 L สุดท้าย vol-ออฟฟิศ และดำเนินการใน systemusing LightCyclerTMdetection โรชโปรแกรมขยายต่อไปนี้: 10 นาทีในรอบ plus40 95◦C 10 s ที่ 95◦C, 5 s 65◦C และ 10 s ที่ 72◦C มีคำนวณค่าวงจรเก่า thresh (CT) โดย softwareversion LightCycler 3.4 (Roche วินิจฉัย) โดยใช้วิธีจุดพอดี MeanCTvalues และส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานคำนวณได้จาก assays inde แขวนสอง นอกจากนี้ gDNA นับเป็น determinedfrom เส้นโค้งเทียบเตรียมในช่วง 8 – 80000 pg โดย serialdilution DH5 E. coli gDNA มาตรฐาน ตัวอย่างที่ว่างเปล่า (withoutbiomolecules) ถูกเรียกใช้ควบคู่กับการวิเคราะห์ตัวอย่างแต่ละ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การแก้ปัญหาสุดท้ายของ pDNA บริสุทธิ์มาวิเคราะห์ thepresence ของสิ่งสกปรกเซลล์โฮสต์ การปรากฏตัวของ RNAwas เหลือประเมินโดยข่าวคราว agarose (ดูรายละเอียดด้านบน) โปรตีน .Total ถูกวัดโดยใช้ชุดทดสอบโปรตีน BCA fromPierce (ฟอร์ด, EUA) ตามที่ผู้ผลิตตามคำสั่งข้อ- กราฟมาตรฐาน (5-400? g / ml) ถูกสร้าง withbovine มาตรฐานอัลบูมิซีรั่ม วัดการดูดกลืนแสงนาโนเมตรใน at562 อ่าน microplate จากอุปกรณ์โมเลกุล (Sun-nyvale, CA, USA) เชิงปริมาณแบบ real-time PCR ได้ดำเนินการ toquantify จีโนม (ช) การปนเปื้อนดีเอ็นเอใน pDNA-containingsamples ตามที่อธิบายไว้เดิมโดยมาร์ตินและเพื่อนร่วมงาน in2003 (มาร์ติน et al., 2003) เพื่อจุดประสงค์นี้ 0.4? L ของความรู้สึก (5? -ACACGGTCCAGAACTCCTACG-3?) และ 0.4? L ของการต่อต้านความรู้สึก (5? -GCCGGTGCTTCTTCTGCGGGTAACGTCA-3?) ไพรเมอร์ที่ใช้ในการ amplifythe ส่วน 181-bp ของ 16 S rDNA E . ยีน coli เป็น mixedwith 1.6? L ของ MgCl2solution (2.0 มิลลิเข้มข้นสุดท้าย), 11.6? LPCR น้ำเกรด 2.0? L 10 × SYBR สีเขียวผมส่วนผสมและ 4.0? ตัวอย่าง Lof ทั้งหมดปฏิกิริยา PCR ได้ดำเนินการใน 20 ลิตรสุดท้ายฉบับ-เมะและดำเนินการในโรช LightCyclerTMdetection systemusing โปรแกรมการขยายต่อไปนี้: 10 นาทีที่95◦Cรอบ plus40 ของ 10 วินาทีที่95◦C 5 s ที่65◦Cและ 10 วินาทีที่72◦C วงจรนวดเก่า (CT) ค่านี้จะถูกคำนวณโดย LightCycler softwareversion 3.4 (Roche Diagnostics) โดยใช้วิธีการจุดพอดี MeanCTvalues​​ และค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานจะถูกคำนวณจากสองการตรวจ Inde-จี้ นอกจากนี้ปริมาณ gDNA เป็น determinedfrom กราฟมาตรฐานเพื่อใช้ในช่วง 8-80,000 pg โดย serialdilution ของ E. coli DH5? มาตรฐาน gDNA ตัวอย่างที่ว่างเปล่า (withoutbiomolecules) ได้รับการทำงานในแบบคู่ขนานกับแต่ละวิเคราะห์ตัวอย่าง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สุดท้ายโซลูชั่นให้ pdna วิเคราะห์มีเซลล์โฮสต์ปลอม การปรากฏตัวของตกค้าง rnawas ประเมิน โดยเจลอิเลคโตรโฟรีซีส ( ดูรายละเอียดข้างบน ) โปรตีนทั้งหมด คือปริมาณโปรตีนโดยใช้แนวคิดชุด frompierce ( Rockford , สหรัฐฯ ) ตามที่ผู้ผลิต instruc tions .เป็นรูปโค้ง ( 5 – 400  g / ml ) ซีรั่มอัลบูมิน ได้สร้างมาตรฐาน withbovine . วัดค่าการดูดกลืนแสง at562 nm ในการอ่านพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทยจากอุปกรณ์ระดับโมเลกุล ( Sun nyvale , CA , USA ) เชิงปริมาณแบบ PCR ทำการ toquantify ปนเปื้อนดีเอ็นเอในจีโนม ( G ) pdna containingsamples เช่นเดิมไว้โดยมาร์ตินและเพื่อนร่วมงาน in2003 ( มาร์ตินส์ et al . , 2003 ) สำหรับวัตถุประสงค์นี้0.4  ผมเลย ( 5  - acacggtccagaactcctacg-3  ) และ 0.4  ผมต่อต้านความรู้สึก ( 5  - gccggtgcttcttctgcgggtaacgtca-3  ) ไพรเมอร์ใช้ amplifythe 181 BP ส่วนของ 16 S rDNA ยีนของเชื้อ E . coli , mixedwith 1.6 ลิตร ( 2.0 มม.  mgcl2solution ความเข้มข้นสุดท้าย ) , 11.6  lpcr 2.0 เกรดน้ำ  L 10 × SYBR กรีนผมผสมและ 4.0  ลอฟตัวอย่างปฏิกิริยา PCR มีการปฏิบัติใน 20  L สุดท้ายอุเมะ vol และดำเนินการในโรช lightcyclertmdetection โดยใช้โปรแกรมดังต่อไปนี้ ( 10 นาทีที่ 95 ◦ C plus40 รอบ 10 ที่ 95 ◦ C 5 อยู่ที่ 65 องศาเซลเซียสและ 10 ◦ s 72 ◦ C นวดรอบเก่า ( CT ) คำนวณค่า โดย lightcycler softwareversion 3.4 ( โรชวินิจฉัย ) ใช้จุดพอดีกับวิธีmeanctvalues และส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน ) คำนวณจากสองยังจี้ ) . นอกจากนี้ gdna ปริมาณคือ determinedfrom เป็นรูปโค้งที่เตรียมไว้ในช่วง 8 – 80 , 000 PG โดย serialdilution ของ E . coli DH5  gdna มาตรฐาน ตัวอย่างว่าง ( withoutbiomolecules ) วิ่งขนานกับแต่ละตัวอย่างการวิเคราะห์