Light attenuation by tissue constit

Light attenuation by tissue constitutes the major difficulty for ratiometric analysis of PPIs by a BRET system. Light attenuation varies with the wavelength of the emitted photons and the depth of the tissue, making the A/D (and ivBRET) a complex function of the emission spectra of the donor and acceptor and spatial localization of the reporter protein. Indeed, the A/Ds and consequently, the ivBRET ratios obtained with BRET6 and BRET6.1 were significantly higher in the mouse deep-tissue model than in cell culture, which is in agreement with lesser tissue attenuation of the light emitted at 640 nm (acceptor) than at 540 nm (donor). However, we have observed excellent consistency of the ivBRET ratio among different mice, showing that our lung cell-trapping model offers sufficient spatial control to retain the ratiometric characteristic of a BRET sensor. Furthermore, when calculating the turn-on ratios for the BRET systems (DRs), the signal attenuation factors cancel out (using the approximation that the attenuation coefficients are constant throughout the entire thorax area and are the same among mice), and these DR values should remain constant, independent of tissue depth. This hypothesis is confirmed by the similar DRs measured for the BRET systems in mice and cells. We observed that DR values obtained in cell culture and mice vary to some extent (although they are close in value), mostly because the DR correction is unable to account for all attenuation and scattering factors. For example, to calculate a dimensionless DR, we assumed that the attenuation coefficient is constant for all mice and identical over the entire thorax area; this approximation introduces a certain degree of inaccuracy in the calculated DR values. Nevertheless, the A/Ds used to calculated the DRs remained in a near margin of the error for different mice, and we show that they are independent of the number of reporter cells used (total light output), indicating that ratiometric measurements can be performed in deep tissues of mice. The DR method provides a depth-independent measure of the BRET signal; however, both donor and acceptor signals used to calculate the DRs decrease with tissue depth. To alleviate some of these tissue attenuation differences, one can further improve the BRET6 system by using both donor and acceptor proteins emitting at wavelengths >600 nm. This parameter could be realized, for example, by pairing the click beetle red luciferase (CBR; λem = 615 nm, D-luciferin) with the newly developed near-IR fluorescent protein eqFP670 (λex/em = 605/670 nm) (35).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

อ่อนแสง โดยเนื้อเยื่อถือปัญหาใหญ่สำหรับ ratiometric วิเคราะห์ PPIs ระบบเบรต แสงอ่อนไปจนความลึกของเนื้อเยื่อ การทำ A/D (ivBRET) และความยาวคลื่นของ emitted photons ฟังก์ชันซับซ้อนของ emission spectra ของผู้บริจาค และ acceptor และแปลปริภูมิของโปรตีนโปรแกรมรายงานการ แน่นอน A / Ds และดัง อัตราส่วน ivBRET ที่ได้รับ BRET6 และ BRET6.1 สูงมากในรูปเนื้อเยื่อลึกเมาส์มากกว่าในเซลล์วัฒนธรรม ซึ่งยังคงน้อยกว่าเนื้อเยื่ออ่อนของแสงที่เปล่งออกมาที่ 640 nm (acceptor) กว่าที่ 540 nm (ผู้บริจาค) อย่างไรก็ตาม เราได้สังเกตสอดคล้องแห่งอัตราส่วน ivBRET นี่หนูต่าง ๆ แสดงว่า รุ่นดักเซลล์ปอดของเรามีเพียงพอพื้นที่ควบคุมรักษา ratiometric ลักษณะของเซนเซอร์เบรต นอกจากนี้ เมื่อคำนวณอัตราการ turn-on ระบบเบรต (DRs), ปัจจัยการลดทอนสัญญาณยกเลิกออก (ใช้ประมาณค่าสัมประสิทธิ์การลดทอนจะคงที่ตลอดพื้นที่ทั้งหมด thorax และเหมือนกันระหว่างหนู), และค่าเหล่านี้ DR ควรคง ขึ้นอยู่กับความลึกของเนื้อเยื่อ สมมติฐานนี้ถูกยืนยัน โดย DRs คล้ายวัดระบบเบรตในหนูและเซลล์ เราสังเกตว่า ค่า DR ได้รับในงานเพาะเลี้ยงเซลล์ และหนูแตกต่างกันไปบ้าง (แม้ว่าพวกเขามีค่า), ส่วนใหญ่เนื่อง จากการแก้ไข DR ไม่อ่อนและ scattering ปัจจัยทั้งหมด ตัวอย่าง การคำนวณ dimensionless DR เราสมมติค่าสัมประสิทธิ์การลดทอนเหมือนกัน และคงที่สำหรับทั้งหมดหนูผ่านพื้นที่ทั้งหมด thorax ประมาณนี้แนะนำระดับ inaccuracy DR ค่าคำนวณ อย่างไรก็ตาม A / Ds ใช้คำนวณ DRs ที่ยังคงขอบใกล้ของข้อผิดพลาดสำหรับหนูแตกต่างกัน และเราแสดงว่า จะขึ้นอยู่กับจำนวนโปรแกรมรายงานเซลล์ (รวมแสงผล), ระบุว่า สามารถดำเนินการวัด ratiometric ในเนื้อเยื่อลึกของหนู วิธี DR ให้วัดไม่ขึ้นกับความลึกของสัญญาณเบรต อย่างไรก็ตาม ผู้บริจาคและ acceptor สัญญาณใช้ในการคำนวณลด DRs กับความลึกของเนื้อเยื่อ บรรเทา บางส่วนของเนื้อเยื่ออ่อนต่างหนึ่งสามารถเพิ่มเติมปรับปรุงระบบ BRET6 โดยใช้โปรตีนทั้งผู้บริจาคและ acceptor เปล่งที่ความยาวคลื่น > 600 nm พารามิเตอร์นี้อาจถูกรับรู้ เช่น โดยจับคู่ luciferase คลิด้วงแดง (CBR; λem = 615 nm, D-luciferin) กับ eqFP670 โปรตีนเรืองแสงใกล้อินฟราเรดใหม่ (λex/เอ็ม = 605/670 nm) (35)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การลดทอนแสงโดยเนื้อเยื่อที่ถือว่าเป็นความยากลำบากที่สำคัญสำหรับการวิเคราะห์ ratiometric ของ PPIs โดยระบบ BRET การลดทอนแสงที่มีความยาวคลื่นแตกต่างกันไปของโฟตอนที่ปล่อยออกมาและความลึกของเนื้อเยื่อที่ทำให้ A / D (และ ivBRET) ฟังก์ชั่นที่ซับซ้อนของการปล่อยสเปกตรัมของผู้บริจาคและใบเสร็จและท้องถิ่นเชิงพื้นที่ของโปรตีนนักข่าว อันที่จริง / Ds และดังนั้นอัตราส่วน ivBRET รับกับ BRET6 และ BRET6.1 อย่างมีนัยสำคัญที่สูงขึ้นในรูปแบบเนื้อเยื่อลึกเมาส์กว่าในการเพาะเลี้ยงเซลล์ที่อยู่ในข้อตกลงกับการลดทอนเนื้อเยื่อน้อยของแสงที่ปล่อยออกมาที่ 640 นาโนเมตร ( ใบเสร็จ) กว่า 540 นาโนเมตร (บริจาค) อย่างไรก็ตามเราได้สังเกตเห็นความสอดคล้องที่ดีของอัตราส่วน ivBRET หนูหมู่ที่แตกต่างกันแสดงให้เห็นว่ารูปแบบการวางกับดักเซลล์ปอดของเรามีการควบคุมเชิงพื้นที่เพียงพอที่จะรักษาลักษณะของเซ็นเซอร์ ratiometric BRET นอกจากนี้เมื่อคำนวณอัตราส่วนเปิดเครื่องขึ้นสำหรับระบบ BRET (อาร์) การลดทอนสัญญาณปัจจัยยกเลิกการออก (โดยใช้การประมาณว่าค่าสัมประสิทธิ์การลดทอนเป็นคงที่ตลอดบริเวณทรวงอกทั้งหมดและจะเหมือนกันในหมู่หนู) และเหล่านี้ค่า DR ควรคงเป็นอิสระจากความลึกของเนื้อเยื่อ สมมติฐานนี้ได้รับการยืนยันโดยดรคล้ายวัดสำหรับระบบ BRET ในหนูและเซลล์ เราตั้งข้อสังเกตว่าค่า DR ที่ได้รับในการเพาะเลี้ยงเซลล์และหนูแตกต่างกันไปบ้าง (แม้ว่าพวกเขามีความใกล้ชิดในค่า) ส่วนใหญ่เป็นเพราะการแก้ไข DR ไม่สามารถบัญชีสำหรับทุกการลดทอนและกระจายปัจจัย ยกตัวอย่างเช่นในการคำนวณขนาด DR เราสันนิษฐานว่าค่าสัมประสิทธิ์การลดทอนเป็นค่าคงที่สำหรับหนูและที่เหมือนกันทั่วพื้นที่ทรวงอกทั้งหมด; ประมาณนี้แนะนำในระดับหนึ่งของความไม่ถูกต้องในการคำนวณค่า DR อย่างไรก็ตาม / Ds ใช้ในการคำนวณดีอาร์ยังคงอยู่ในขอบของข้อผิดพลาดอยู่ใกล้กับหนูที่แตกต่างกันและเราแสดงให้เห็นว่าพวกเขามีความเป็นอิสระของจำนวนของเซลล์นักข่าวใช้ (แสงทั้งหมด) แสดงให้เห็นว่าการวัด ratiometric สามารถดำเนินการได้ ในเนื้อเยื่อลึกของหนู วิธี DR ให้วัดความลึกที่เป็นอิสระของสัญญาณ BRET; แต่ทั้งผู้บริจาคและสัญญาณตัวรับใช้ในการคำนวณการลดลงของอาร์ที่มีความลึกของเนื้อเยื่อ เพื่อบรรเทาบางส่วนของความแตกต่างของการลดทอนเนื้อเยื่อเหล่านี้หนึ่งยังสามารถปรับปรุงระบบ BRET6 โดยใช้ทั้งผู้บริจาคและโปรตีนตัวรับเปล่งในช่วงความยาวคลื่น> 600 นาโนเมตร พารามิเตอร์นี้อาจจะรู้ตัวอย่างเช่นโดยการจับคู่คลิกด้วง luciferase สีแดง (CBR; λem = 615 นาโนเมตร D-luciferin) ที่มีการพัฒนาขึ้นใหม่ใกล้เรืองแสง IR โปรตีน eqFP670 (λex / em = 605/670 นาโนเมตร) (35 )

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

แสงการลดทอนโดยถือเป็นปัญหาใหญ่สำหรับการวิเคราะห์เนื้อเยื่อ ratiometric ของ ppis โดย Bret ระบบ การเปลี่ยนความยาวคลื่นของแสงที่ปล่อยออกมาโฟตอนและความลึกของเนื้อเยื่อ ทำให้ A / D ( และ ivbret ) ฟังก์ชันที่ซับซ้อนของการปล่อยสเปกตรัมของผู้บริจาคและพระนาสิกและการเชิงพื้นที่ของนักข่าว โปรตีน แน่นอน , / DS และจากนั้นการ ivbret อัตราส่วนได้ และ bret6 bret6.1 พบในเนื้อเยื่อลึกกว่าเมาส์แบบในเซลล์เพาะเลี้ยง ซึ่งสอดคล้องกับการลดทอนเนื้อเยื่อน้อยกว่าของแสงที่ปล่อยออกมาที่ 640 nm ( พระนาสิก ) มากกว่า 540 nm ( บริจาค ) อย่างไรก็ตาม เราได้สังเกตความยอดเยี่ยมของ ivbret อัตราส่วนระหว่างหนูที่แตกต่างกันแสดงว่าของเราเซลล์ปอดดักแบบมีการควบคุมพื้นที่เพียงพอที่จะรักษาลักษณะ ratiometric ของ Bret เซ็นเซอร์ นอกจากนี้ เมื่อคำนวณอัตราส่วนสำหรับเปิด ระบบเบรต ( DRS ) สัญญาณลดทอนปัจจัยยกเลิกออก ( ใช้ประมาณว่าสัมประสิทธิ์การลดทอนคงที่ทั่วบริเวณทรวงอกทั้งหมดและจะเหมือนกันในหนู )และเหล่านี้ค่า ดร ควรจะคงที่อิสระของเนื้อเยื่อ สมมุติฐานนี้ได้รับการยืนยันโดยคล้ายกัน DRS วัดสำหรับระบบเบรตในหนูและเซลล์ เราสังเกตว่า ดร ได้เพาะเลี้ยงเซลล์และหนูแตกต่างกันบ้าง ( แม้ว่าพวกเขาจะปิดในมูลค่า ) , ส่วนใหญ่เนื่องจากการแก้ไขดรไม่สามารถบัญชีสำหรับการลดทอนและปัจจัยการกระเจิง . ตัวอย่างเช่นเพื่อคำนวณดร ไร้มิติ เราสันนิษฐานว่า ค่าสัมประสิทธิ์การลดทอนเป็นค่าคงที่สำหรับหนู และเหมือนบริเวณทรวงอกทั้งหมด ; ประมาณนี้แนะนำระดับหนึ่งของความไม่แม่นยำในการคำนวณ ดร ค่า อย่างไรก็ตาม / DS ใช้คำนวณ DRS ยังคงอยู่ในใกล้ขอบของข้อผิดพลาดสำหรับหนูที่แตกต่างกันและเราก็แสดงให้เห็นว่าพวกเขาเป็นอิสระของจํานวนของนักข่าว เซลล์ที่ใช้ ( light output ทั้งหมด ) แสดงว่าการวัด ratiometric สามารถดำเนินการในเนื้อเยื่อลึกของหนู วิธีดรมีความลึกอิสระวัดสัญญาณเบร็ท อย่างไรก็ตาม ทั้งผู้บริจาคและสัญญาณพระนาสิกที่ใช้คำนวณประเมินลดลงตามความลึก เนื้อเยื่อบรรเทาเนื้อเยื่อการลดทอนความแตกต่าง หนึ่งสามารถปรับปรุงระบบ bret6 โดยใช้ทั้งผู้บริจาคและพระนาสิกโปรตีนออกมาที่ความยาวคลื่น 600 nm > . พารามิเตอร์นี้จะเป็นจริง เช่น การจับคู่คลิกด้วงแดงเอนไซม์ลูซิเฟอเรส ( CBR ; λ em = 615 นาโนเมตร d-luciferin ) ที่มีการพัฒนาขึ้นใหม่ใกล้อินฟราเรดหลอดโปรตีน eqfp670 ( λแฟนเก่า / em = 605 / 670 นาโนเมตร ) ( 35 )