2. Materials and methods2.1. Plant

2. Materials and methods
2.1. Plant materials
Plants were grown from seed in Metro-Mix
360®, watered daily and fertilized with a controlled
release fertilizer, Osmocote® (14-14-14). The plants
were maintained in a greenhouse on the NMSU
main campus. The RNA for the cDNA library
construction was isolated from placental fruit tissue
of plants grown in the field at the Fabian
Garcia Research Center, NMSU, Las Cruces.
Typical capsaicinoid content of the chile
germplasm used in this report is listed in Table 1.
Capsaicinoid content of chile fruit was determined
using an HPLC method [25]. Essentially
fruit is dried, ground to a powder and extracted
with acetonitrile. An aliquot is then injected into a
Waters HPLC equipped with a fluorescence detector
and the samples are resolved on C-18 reverse
phase columns.
2.2. Nucleic acid isolation and blot analyses
Total RNA and genomic DNA were prepared
as described earlier [26]. Plant tissues to be extracted
for RNA were collected directly into liquid
N2. RNA blots were prepared after electrophoresis
of ethidium bromide stained RNA samples [27].
Genomic DNA was digested with restriction endonucleases
following the supplier’s buffer recommendations,
for at least 4 h at 37°C.
Pre-hybridization, hybridization and washing conditions
were as described earlier [26]. In one experiment,
transcript levels were quantified using a
Molecular Dynamics Storm 860 phosphorimager.
In this case, the blots were re-probed with a
fragment of the chile gene for 25S ribosomal RNA
to normalize transcript abundance. All northern
displays were replicated at least once with independently
isolated RNA preparations.
2.3. cDNA library construction
Fruit were collected from C. chinense c.v. haban
˜ero grown at the Fabian Garcia Research Center,
Las Cruces, NM. The fruit were sorted into
three different developmental stages based on size
and color development: (1) green fruit; (2) fruit
with developing orange color, and (3) fully orange
fruit. The placental tissue was dissected from the
fruit and RNA isolated from each of the three
stages. PolyA RNA was prepared from the placental
tissue of stage 1 using a batch oligo-dT
process and a cDNA library of these transcripts
was generated in Lambda ZapII (Stratagene). The
primary library was titered at 2.5105 recombinant
pfu:ml, and then amplified to a titer of
11010 recombinant pfu:ml. This library was differentially
screened using radiolabeled first strand
cDNA from placental transcripts from either immature
haban˜ero fruit or from immature non-pungent
C. chinense (PI 1721) fruit. Plaques which
hybridized strongly to the haban˜ero probe and not
to the non-pungent C. chinense were purified and
characterized.
2.4. DNA sequencing and alignments
DNA sequences were determined on recombinant
plasmids using dideoxy termination methods,
SequiTherm EXCEL kit (Epicentre Technol) and
a LI-COR automated DNA sequencer. DNASTAR
software was used to assemble and analyze
DNA sequences; DNA and predicted amino acid
sequences were searched against DNA and protein
databases using BLAST 2.0 [28] at the NCBI web
site (www.ncbi.nlm.nih.gov:BLAST:); in some
cases against the BLOCKS database ([29];
www.blocks.fhcrc.org:) or analyzed by PSORT to
predict sub-cellular sites of accumulation ([30];
psort.nibb.ac.jp:8800:). The nucleotide sequence
data are in the GenBank Nucleotide Sequence
Database under accession numbers: Pal AF081215
(phenylalanine ammonia lyase); Ca4h AF088847
(cinnamate 4-hydroxylase); Comt AF081214 (caffeic
acid 3-O-methyl transferase); Kas AF085148
(3-keto-acyl acyl carrier protein (ACP) synthase);
pAmt AF085149 (putative amino transferase);
rrn25 AF088849 (25S ribosomal RNA).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. พืชวัสดุพืชที่ปลูกจากเมล็ดใน Metro Mix360 ®, ผู้บริการ และปฏิสนธิ ด้วยการควบคุมปล่อยปุ๋ย, ® Osmocote (14-14-14) พืชถูกเก็บรักษาไว้ในเรือนกระจกใน NMSUวิทยาเขตหลัก อาร์เอ็นเอในห้องสมุด cDNAก่อสร้างแยกต่างหากจากเนื้อเยื่อผลไม้รกลอกพืชที่ปลูกในฟิลด์ที่ Fabianศูนย์วิจัยการ์เซีย NMSU ลา CrucesCapsaicinoid ทั่วไปเนื้อหาของชิลีgermplasm ใช้ในรายงานนี้จะแสดงในตารางที่ 1กำหนดเนื้อหา Capsaicinoid ผลไม้ประเทศชิลีโดยใช้วิธี HPLC [25] เป็นหลักผลไม้อบ แห้ง พื้นดินเป็นผง และสกัดด้วย acetonitrile ส่วนลงตัวแล้วได้ฉีดเข้าไปในตัวน้ำ HPLC พร้อมจับ fluorescenceและตัวอย่างการแก้ไขบนกลับ C-18ระยะคอลัมน์2.2 กรดนิวคลีอิกที่วิเคราะห์แยกและคืนในตาเตรียม genomic DNA และอาร์เอ็นเอทั้งหมดเป็นอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [26] เนื้อเยื่อพืชไปในอาร์เอ็นเอได้รวบรวมลงในของเหลวโดยตรงN2 อาร์เอ็นเอกันบล็อทได้เตรียมไว้หลังจาก electrophoresisของ ethidium โบรไมด์สีอาร์เอ็นเอตัวอย่าง [27]Genomic DNA ถูกต้องกับ endonucleases จำกัดตามคำแนะนำในการบัฟเฟอร์ของซัพพลายเออร์สำหรับน้อย 4 h ที่ 37 องศาเซลเซียสHybridization ก่อน hybridization และล้างเงื่อนไขมีก่อนหน้านี้อธิบายไว้ [26] ในการทดลองหนึ่งระดับเสียงบรรยายได้ quantified โดยใช้การโมเลกุล 860 พายุ Dynamics phosphorimagerในกรณีนี้ กันบล็อทได้ probed อีกครั้งด้วยการส่วนของยีนชิลีในอาร์เอ็นเอ ribosomal 25Sเพื่อลดขนาดมากมายเสียงบรรยาย ภาคเหนือทั้งหมดแสดงถูกจำลองแบบที่มีอิสระแยกอาร์เอ็นเอเตรียมการ2.3 การก่อสร้างห้องสมุด cDNAผลไม้ที่ถูกเก็บรวบรวมจาก haban C. chinense ต่อ c.v. บูต˜ero ปลูกที่ศูนย์วิจัย Fabian การ์เซียลา Cruces นิวตันเมตร เรียงผลไม้ลงในสามพัฒนาระยะต่าง ๆ ขึ้นอยู่กับขนาดและสีพัฒนา: ผลไม้สีเขียว (1) (2) ผลไม้มีการพัฒนาสีส้ม และ (3) เต็มส้มผลไม้ เนื้อเยื่อรกลอกถูก dissected จากการผลไม้และอาร์เอ็นเอที่แยกต่างหากจากสามขั้นตอนการ อาร์เอ็นเอของ PolyA ถูกเตรียมจากรกลอกตัวเนื้อเยื่อของระยะใช้ dT-oligo ที่ชุด 1กระบวนการและห้องสมุด cDNA ของใบแสดงผลเหล่านี้ถูกสร้างใน ZapII แลมบ์ดา (Stratagene) ที่ห้องสมุดหลักถูก titered ที่วททช 2.5 105pfu:ml และจากนั้น ขยายการ titer ของ1 1010 recombinant pfu:ml ไลบรารีนี้ถูก differentiallyฉายใช้สแตรนด์แรก radiolabeledcDNA จากใบแสดงผลรกลอกจาก immaturehaban˜ero ผลไม้หรือ จาก immature ไม่หอมฉุนC. chinense (PI 1721) ผลไม้ Plaques ซึ่งเป็นอย่างยิ่งการโพรบ haban˜ero และไม่การ C. ไม่หอมฉุน chinense ได้บริสุทธิ์ และลักษณะการ2.4 ลำดับ DNA และจัดแนวลำดับดีเอ็นเอถูกกำหนดบนวททชใช้วิธีการจ้าง dideoxy, plasmidsSequiTherm EXCEL ชุด (ลอต Technol) และแบบ LI-ประกอบ อัตโนมัติ DNA sequencer การ DNASTARใช้ซอฟต์แวร์ในการรวบรวม และวิเคราะห์ลำดับดีเอ็นเอ ดีเอ็นเอและกรดอะมิโนที่คาดการณ์มีการค้นหาลำดับดีเอ็นเอและโปรตีนฐานข้อมูลโดยใช้ระเบิด 2.0 [28] ในเว็บ NCBIเว็บไซต์ (www.ncbi.nlm.nih.gov:BLAST:); ในบางกรณีกับฐานข้อมูลบล็อก ([29];www.blocks.fhcrc.org :) หรือวิเคราะห์ โดย PSORT การทำนายไซต์ย่อยโทรศัพท์มือถือของสะสม ([30];psort.nibb.ac.jp:8800:) ลำดับนิวคลีโอไทด์ข้อมูลที่อยู่ในลำดับนิวคลีโอไทด์ GenBankฐานข้อมูลฐานข้อมูลหมายเลขทะเบียน: AF081215 พาล(phenylalanine แอมโมเนีย lyase); Ca4h AF088847(cinnamate 4-hydroxylase); (Caffeic Comt AF081214กรด 3-O-methyl transferase); Kas AF085148(acyl 3-keto-acyl ขนส่งโปรตีน (ACP) synthase);pAmt AF085149 (putative อะมิโน transferase);rrn25 AF088849 (25S อาร์เอ็นเอ ribosomal)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 วัสดุพืชพืชที่ปลูกจากเมล็ดใน Metro-Mix 360®รดน้ำทุกวันและปฏิสนธิกับควบคุมปุ๋ยปล่อยOsmocote® (14-14-14) พืชที่ได้รับการเก็บรักษาไว้ในเรือนกระจกใน NMSU วิทยาเขตหลัก RNA สำหรับห้องสมุด cDNA ก่อสร้างที่แยกได้จากผลไม้รกเนื้อเยื่อของพืชที่ปลูกในเขตที่เฟเบียนการ์เซียศูนย์วิจัยNMSU, Las Cruces. เนื้อหาทั่วไป capsaicinoid ของชิลีพันธุ์ที่ใช้ในการรายงานนี้แสดงอยู่ในตารางที่1 เนื้อหา capsaicinoid ของผลไม้ชิลีถูกกำหนดโดยใช้วิธีHPLC [25] โดยเฉพาะอย่างยิ่งผลไม้ที่แห้งบดเป็นผงและสกัดด้วยacetonitrile aliquot ถูกฉีดเข้าไปในน่านน้ำHPLC เพื่อการติดตั้งเครื่องตรวจจับเรืองแสงและกลุ่มตัวอย่างได้รับการแก้ไขในC-18 กลับคอลัมน์เฟส. 2.2 แยกกรดนิวคลีอิกและ blot วิเคราะห์RNA และ DNA รวมจีโนมได้จัดทำตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้[26] เนื้อเยื่อพืชที่จะสกัดสำหรับอาร์เอ็นเอที่ถูกเก็บโดยตรงเป็นของเหลวN2 blots อาร์เอ็นเอได้จัดทำหลังจากที่ข่าวคราวของโบรไมด์ethidium สีตัวอย่างอาร์เอ็นเอ [27]. ดีเอ็นเอจีโนมที่ถูกย่อยด้วย endonucleases ข้อ จำกัดตามคำแนะนำบัฟเฟอร์ของซัพพลายเออร์ที่เป็นเวลาอย่างน้อย 4 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส. ก่อนการผสมพันธุ์การผสมพันธุ์และซักผ้าเงื่อนไขเป็นตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [26] หนึ่งในการทดสอบระดับสำเนาถูกวัดโดยใช้Dynamics โมเลกุลพายุ 860 phosphorimager. ในกรณีนี้ได้รับการตรวจสอบ blots อีกครั้งกับชิ้นส่วนของยีนชิลีสำหรับ25S โซมอลอาร์เอ็นเอที่จะปรับความอุดมสมบูรณ์หลักฐาน ทางตอนเหนือทั้งหมดแสดงถูกจำลองแบบอย่างน้อยหนึ่งครั้งที่มีอิสระที่แยกการเตรียมอาร์เอ็นเอ. 2.3 การก่อสร้างห้องสมุด cDNA ผลไม้ที่ถูกเก็บรวบรวมจาก C. chinense พันธุ์ haban ~ero เติบโตในเฟเบียนการ์เซียศูนย์วิจัยLas Cruces, นิวเม็กซิโก ผลไม้ที่ถูกจัดเรียงเป็นสามขั้นตอนการพัฒนาที่แตกต่างกันขึ้นอยู่กับขนาดและการพัฒนาสี(1) ผลไม้สีเขียว (2) ผลไม้ที่มีการพัฒนาสีส้มและ(3) สีส้มอย่างเต็มที่ผลไม้ เนื้อเยื่อรกถูกชำแหละจากผลไม้และอาร์เอ็นเอที่แยกได้จากแต่ละสามขั้นตอน Pólya? อาร์เอ็นเอได้รับการจัดทำขึ้นจากรกเนื้อเยื่อของระยะที่ 1 โดยใช้ชุด Oligo-dT กระบวนการและห้องสมุด cDNA ของยีนที่เหล่านี้ถูกสร้างขึ้นในแลมบ์ดาZapII (Stratagene) ห้องสมุดหลักถูก titered 2.5 105 recombinant? PFU: มล. และขยายแล้ว titer ของ1 1010 recombinant PFU: มล. ห้องสมุดนี้ได้รับแตกต่างกันการคัดกรองโดยใช้เส้นใยแรก radiolabeled cDNA จากยีนที่รกจากทั้งที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะผลไม้haban~ero หรือจากที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะที่ไม่ฉุนซี chinense (PI 1721) ผลไม้ โล่ซึ่งไฮบริดอย่างยิ่งที่จะสอบสวน haban~ero และไม่ไปchinense ซีที่ไม่ฉุนถูกบริสุทธิ์และโดดเด่น. 2.4 ลำดับดีเอ็นเอและการจัดแนวดีเอ็นเอได้รับการพิจารณาใน recombinant พลาสมิดโดยใช้วิธีการเลิกจ้าง dideoxy, ชุด SequiTherm EXCEL (ศูนย์กลางเทคโนโลยี) และแบตเตอรี่Li-COR ซีเควนดีเอ็นเออัตโนมัติ DNASTAR ซอฟต์แวร์ที่ถูกใช้ในการรวบรวมและวิเคราะห์ลำดับดีเอ็นเอ ดีเอ็นเอและการคาดการณ์กรดอะมิโนลำดับถูกค้นกับดีเอ็นเอและโปรตีนฐานข้อมูลโดยใช้ระเบิด2.0 [28] ที่เว็บ NCBI เว็บไซต์ (www.ncbi.nlm.nih.gov:BLAST :); ในบางกรณีกับฐานข้อมูลบล็อก ([29]; www.blocks.fhcrc.org :) หรือวิเคราะห์โดย PSORT ที่จะทำนายเว็บไซต์ย่อยเซลล์ของการสะสม([30]; psort.nibb.ac.jp:8800 :) ลำดับเบสข้อมูลใน GenBank เบสลำดับฐานข้อมูลภายใต้หมายเลขภาคยานุวัติ: Pal AF081215 (phenylalanine แอมโมเนียไอเลส); Ca4h AF088847 (cinnamate 4 hydroxylase); COMT AF081214 (caffeic กรด 3-O-methyl transferase); Kas AF085148 (3-Keto-acyl acyl เพชรรัตน์ (ACP) เทส); pAmt AF085149 (transferase อะมิโนสมมุติ); rrn25 AF088849 (25S โซมอลอาร์เอ็นเอ)