ES cellsProduction of tet-226aa/N6

ES cells

Production of tet-226aa/N6 ES cells was described previously [13]. Briefly, for efficient production of the active FVIII protein, we employed 226aa/N6-F8 cDNA [15]. The 226aa/N6-F8 construct encodes a shortened B-domain of 226 amino acids with six N-linked oligosaccharides. Green fluorescent protein (GFP)–brachyury (Bry) Ainv18 ES cells, established by targeting the GFP cDNA to the Bry locus in Ainv18 ES cells [16], were transfected with the 226aa/N6-plox targeting plasmids, yielding tet-226aa/N6 ES cells. Tet-226aa/N6 ES cells drive F8 gene overexpression via a tetracycline (tet)-inducible promoter following doxycycline (Dox) exposure. Undifferentiated tet-226aa/N6 ES cells differentiated into mesendodermal embryoid bodies (EBs) [13] and [16]. Day-3.5 EBs were dissociated with trypsin–EDTA, stained with anti-mouse c-kit-phycoerythrin (BD PharMingen, San Diego, CA, USA), and sorted in a FACSAria cell sorter (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). We prepared GFP-Bry+/c-kit+ cells for transplantation, because they contained a definitive endoderm population and produced active hFVIII more efficiently than pre-sorted populations [13]. The GFP-Bry+/c-kit+ population was subsequently used for all transplantations.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เซลล์ ESการผลิตของเซลล์ ES tet-226aa/N6 อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [13] สั้น ๆ สำหรับการผลิตที่มีประสิทธิภาพของโปรตีน FVIII ใช้งาน เราใช้ cDNA 226aa/N6-F8 [15] สร้าง 226aa/N6-F8 encodes ย่อ B-โดเมนของกรดอะมิโน 226 กับ oligosaccharides N ลิงค์หก สีเขียวโปรตีนฟลูออเรสเซนต์ (GFP) – เซลล์ Ainv18 ES brachyury (Bry) ก่อตั้งขึ้น โดยกำหนดเป้าหมาย cDNA GFP ไปที Bry ในเซลล์ Ainv18 ES [16], ถูก transfected กับการ 226aa/N6-plox เป้าหมาย plasmids, tet-226aa/N6 ES เซลล์ที่ให้ผลผลิต เซลล์ ES Tet-226aa/N6 ไดรฟ์แสดงออกของยีน F8 ผ่านเตตราไซคลีน (tet) -inducible โปรโมเตอร์ต่อแสงดอกซีไซคลีน (Dox) ความแตกต่าง tet-226aa/N6 ES เซลล์ที่แตกต่างร่างกาย embryoid mesendodermal (EBs) [13] และ [16] EBs วัน-3.5 ไม่ มีทริปซิน – EDTA ย้อม ด้วยผู้ต่อต้านเมาส์ c-ชุด-phycoerythrin (BD PharMingen, San Diego, CA, USA), และเรียงเรียงลำดับเซลล์ FACSAria (สัน Becton, San Jose, CA, USA) เราเตรียม GFP Bry ++ c-ชุด + เซลล์ปลูก เพราะพวกเขาประกอบด้วยประชากรชัดเจนเอนโดเดิร์ม และผลิต hFVIII ใช้งานได้อย่างมีประสิทธิภาพกว่าประชากรเรียงลำดับก่อน [13] GFP-Bry ++ c-ชุด + ประชากรหลังใช้สำหรับ transplantations ทั้งหมด

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เซลล์ ES ผลิต Tet-226aa / เซลล์ N6 ES ถูกอธิบายไว้ก่อนหน้า [13] สั้น ๆ สำหรับการผลิตที่มีประสิทธิภาพของโปรตีน FVIII ใช้งานที่เราว่าจ้าง 226aa / N6-F8 cDNA [15] สร้าง 226aa / N6-F8 encodes สั้นลง B-โดเมนของกรดอะมิโน 226 หก oligosaccharides N-เชื่อมโยง สีเขียวเรืองโปรตีน (GFP) -brachyury เซลล์ (Bry) Ainv18 ES ที่จัดตั้งขึ้นโดยการกำหนดเป้าหมาย GFP ยีนไปยังสถานที Bry ในเซลล์ Ainv18 ES [16] ถูก transfected กับการกำหนดเป้าหมาย 226aa / N6-Plox พลาสมิดยอม Tet-226aa / เซลล์ N6 ES เซลล์ Tet-226aa / N6 ES ขับรถ F8 ยีนแสดงออกผ่าน tetracycline (Tet) ก่อการ -inducible ต่อไป doxycycline (Dox) การสัมผัส แตกต่าง Tet-226aa / เซลล์ N6 ES แตกต่างเข้าสู่ร่างกาย mesendodermal embryoid (EBS) [13] และ [16] วัน 3.5 EBS ถูกแยกตัวกับ trypsin-EDTA, ย้อมด้วยสีป้องกันเมาส์ C-KIT-phycoerythrin (BD PharMingen, San Diego, CA, USA) และจัดเรียงในเซลล์เรียงลำดับ FACSAria (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA ) เราเตรียม GFP-Bry + / C-KIT + เซลล์สำหรับการปลูกเพราะพวกเขามีประชากร endoderm ที่ชัดเจนและผลิต hFVIII ที่ใช้งานได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้นกว่าก่อนประชากรเรียง [13] โฆษณา GFP-Bry + / C-KIT + ประชากรต่อมาใช้สำหรับการปลูกทั้งหมด

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

และเซลล์การผลิต tet-226aa / n6 ES เซลล์ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 13 ] สั้นสำหรับการผลิตโปรตีนเอ็กซอนใช้งานได้อย่างมีประสิทธิภาพ เราใช้ 226aa / n6-f8 cDNA [ 15 ] การ 226aa / n6-f8 สร้าง encodes ย่อ b-domain 226 กรดอะมิโนกับหก n-linked เทคโนโลยี . โปรตีนเรืองแสงสีเขียว ( GFP ) – brachyury ( ไบรอัน ) ainv18 ES เซลล์ยีน GFP ก่อตั้งขึ้นโดยเป้าหมายเพื่อความเชื่อในไบร ainv18 ES เซลล์ [ 16 ] , transfected กับ 226aa / n6 plox เป้าหมายเพื่อ tet-226aa / n6 ES เซลล์หยุ่น . tet-226aa / n6 ES เซลล์ขับ F8 ยีน overexpression ผ่านเตตราไซคลีน ( Tet ) - โปรโมเตอร์ inducible ต่อไปนี้ดอกซีไซคลีน ( DOX ) เผย ไม่แตกต่างกัน tet-226aa / n6 ES เซลล์ต่างๆ ในร่างกาย mesendodermal เซ็นต์ ( เดียว ) [ 13 ] และ [ 16 ] day-3.5 ทางใจกับทริปเดียว ) และ EDTA , เปื้อน c-kit-phycoerythrin ป้องกันเมาส์ ( BD pharmingen , San Diego , CA , USA ) และเรียง facsaria เซลล์คัดแยก ( เบคตอนดิกคินสัน San Jose , CA , USA ) เราเตรียม GFP ไบร + / c-kit + เซลล์ที่ปลูกถ่าย , เพราะพวกเขามีประชากรแบล็กเบอร์รีที่ชัดเจนและผลิตงาน hfviii มีประสิทธิภาพมากขึ้นกว่าก่อนเรียงประชากร [ 13 ] โดยไบรอัน c-kit GFP + / + ประชากรและใช้ทุก transplantations .