2. Materials and methods2.1. Coral

2. Materials and methods
2.1. Coral specimens
Colonies of the branching coral M. digitata were collected from a
coastal region of Okinawa Island, Japan with permission from the
Okinawa prefectural government (No. 22-5). Coral branch tips
(ca. 4 cm long) from large coral colonies were cut and attached to a
polyethylene net. Brancheswere kept for 2 weeks in an outdoor aquariumwith
running seawater, to allow for recovery fromsampling stress.
2.2. Bacterial strains
Five species of bacteria, V. coralliilyticus (AB490821), Vibrio harveyi
(AB490822), Paracoccus carotinifaciens (AB490820), Pseudoalteromonas
sp. (AB691769), and Sulfitobacter sp. (AB691770), were prepared for
this experiment. These bacteria are naturally found in coastal regions
of Okinawa, Japan. V. coralliilyticus and V. harveyi were isolated from
seawater in Sesoko, Okinawa. P. carotinifaciens was isolated from
bleached M. digitata. Pseudoalteromonas sp. and Sulfitobacter sp. were
isolated from the water surrounding bleached M. digitata. All bacteria
were cultured separately to stationary growth phase (108 cells ml−1)
in liquid marine broth medium. Every day, the cultures were mixed,
washed through three consecutive centrifugations to remove themedium,
and diluted in filtered seawater before being mixed. The mixed
solution containing the five cultured bacterial species was used for
the inoculation experiment. After inoculation, the total abundance of
bacteria in each incubation vessel was counted using flow cytometry
(Beckman Coulter) with SYBR Green. The numbers of bacteria
(cells ml−1) under the different conditions were: 6.7×105 at 27 °C
without bacteria, 1.3×106 at 27 °C with bacteria, 5.5×105 at 32 °C
without bacteria, and 1.2×106 at 32 °C with bacteria. To confirm the
effects of each bacterial species, individual species (V. coralliilyticus,
V. harveyi, Pseudoalteromonas sp., and Sulfitobacter sp.) and a mix of
three species (V. coralliilyticus, V. harveyi, and P. carotinifaciens) were
also tested, using a final abundance of approximately 106 cells ml−1.
2.3. Experimental design
A continuous-flow complete-mixing (CFCM) experimental system,
described by Fujimura et al. (2008), was used for incubation
of the coral colonies. Seawater temperatures were set at 27 °C or
32 °C, and two levels of bacterial abundance (no addition andaddition of mixed bacteria) were tested in a 2×2 factorial design
with three replicates per treatment. Seawater was pumped into the
incubation bottles by peristaltic pumps. For trials with bacterial addition,
an additional pump was used to premix the bacteria solution
with seawater, and the inoculated seawater was pumped into the incubation
bottles. Light was provided by metal halide lamps with a
constant photon flux density (280 or 0 μmol m−2 s−1 during a
12:12-h light:dark cycle). Four coral branch tips were placed into
900-ml glass incubation bottles with a flow rate of 15 ml min−1 during
incubation periods. A total of 30 glass bottles were prepared: 15
bottles were kept in a water bath maintained at a constant temperature
of 27 °C, and the other 15 bottles were in a water bath at 32 °C.
After 4 days, the bacteria were inoculated into six bottles at each temperature,
using an additional pump to maintain a total flow rate of
15 ml min−1. The inoculated water flows were started at 9:00 a.m.
Tissue samples and water samples for the measurement of coral metabolisms
were taken on days 0, 4, and 8. Corals from three replicate
bottles under each condition were sacrificed for tissue analysis. Water
samples were taken from three replicate bottles under each condition
and used for the measurement of coral metabolisms.
The same experimental design was used for individual bacterial
testing. Corals were incubated for 4 days at 32 °C in seawater
enriched with bacteria at a final total abundance of 106 cells ml−1.
Five bottles containing one branch each were prepared for each bacterium.
The final state of the corals was evaluated by their coloration,
their maximum photochemical yield (Fv/Fm), and the presence or absence
of tissue necrosis.
2.4. Sample treatments and measurements
Before starting the incubation and after sampling the branches,
the maximum quantum efficiency of Photosystem II (Fv/Fm) was
measured using an underwater fluorometer (DIVING-PAM; Walz,
Germany) after 30 min of dark adaptation. The mean value±SE of
Fv/Fm before incubation was 0.748±0.007 (n=30). Coral tissues
were treated according to Higuchi et al. (2009a). All samples were
washed with 0.7 M NaCl to remove loosely attached plankton and
other organisms, and tissue homogenates were prepared using the
air-jet method, in which 100 mM phosphate buffer was sprayed
using a paint sprayer ST (Asahipen, Japan) to strip the tissue from
the coral skeleton. Then, 15 ml of non-fixed sample was separated
into host coral tissue and endosymbiont zooxanthellae (Zoox) by centrifugation
(time and speed as in Higuchi et al., 2009a). A small portion
of the zooxanthellae fraction was used to count zooxanthellae
density using a Neubauer hemocytometer. Zooxanthellae were lysed
by sonication in phosphate buffer with 0.05% Triton X-100. SOD activity
was assayed spectrophotometrically as described by Elstner and
Heupel (1976) and Oyanagui (1984). Standards for activity were prepared
using bovine erythrocytic SOD (Sigma) for each set of samples.
CAT activity was measured by the depletion of H2O2 at 240 nm (Beers
and Sizer, 1952). All assays were conducted at 25 °C immediately
after sampling, and enzyme activity was expressed as units (U) per
mg protein. Protein content was determined by the Bradford assay
(Bradford, 1976).
Primary production rates were determined using the 13C tracer
technique according to Hama et al. (1993). For tissue analysis, 13C
in the form of sodium bicarbonate was added to the incubation
bottles. The treatment to estimate primary production was according
to Casareto et al. (2009). Briefly, 5 ml of tissue homogenate extract
was filtered onto pre-combusted GF/F filters. Filters were kept
at−20 °C until analysis. After drying at 60 °C, the filters were treated
with acid fumes to eliminate inorganic carbon. Then, organic carbon
and isotope ratios were measured using a mass spectrophotometer
(DELTAplus Advantage; Thermo Finnigan) equipped with an EA1110
elemental analyzer.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. ปะการังไว้เป็นตัวอย่างอาณานิคมของ digitata เมตรปะการังโยงหัวข้อรวบรวมจากการพื้นที่ชายฝั่งของเกาะโอกินาว่า ญี่ปุ่นได้รับอนุญาตจากการโอกินาวารัฐบาล (หมายเลข 22-5) เคล็ดลับสาขาปะการัง(ca. ยาว 4 cm) จากปะการังใหญ่ อาณานิคมถูกตัด และแนบกับตัวเอทิลีสุทธิ Brancheswere เก็บไว้ 2 สัปดาห์ในการ aquariumwith กลางแจ้งใช้น้ำทะเล เพื่อให้การกู้คืน fromsampling ความเครียด2.2. แบคทีเรียสายพันธุ์พันธุ์แบคทีเรีย V. coralliilyticus (AB490821), harveyi ผลห้า(AB490822), Paracoccus carotinifaciens (AB490820), Pseudoalteromonassp. (AB691769), และ Sulfitobacter sp. (AB691770), ถูกเตรียมไว้สำหรับการทดลองนี้ แบคทีเรียเหล่านี้จะพบตามธรรมชาติในพื้นที่ชายฝั่งของโอกินาว่า ญี่ปุ่น V. coralliilyticus และ V. harveyi ได้แยกต่างหากจากทะเลใน Sesoko โอกินาว่า P. carotinifaciens ถูกแยกต่างหากจากเซล digitata เมตร Pseudoalteromonas sp.และ Sulfitobacter spแยกต่างหากจากน้ำรอบเซล digitata เมตร แบคทีเรียทั้งหมดมีอ่างแยกต่างหากกับระยะการเจริญเติบโตของเครื่องเขียน (108 เซลล์ ml−1)ในซุปน้ำทะเล ทุกวัน รวมวัฒนธรรมล้างผ่าน centrifugations ติดกันสามเอา themediumและแตกออกในน้ำทะเลกรองก่อนการผสม การผสมใช้สำหรับโซลูชันที่ประกอบด้วยห้าสายพันธุ์แบคทีเรียอ่างทดลอง inoculation หลังจาก inoculation รวมมายในเรือแต่ละคณะทันตแพทยศาสตร์ถูกนับโดยใช้เซลล์กระแส(Beckman Coulter) กับ SYBR Green จำนวนแบคทีเรีย(เซลล์ ml−1) ภายใต้เงื่อนไขแตกต่างกันได้: 6.7 × 105 ที่ 27 ° Cโดยแบคทีเรีย 1.3 × 106 ที่ 27 ° C มีแบคทีเรีย 5.5 × 105 ที่ 32 ° Cโดยแบคทีเรีย และ 1.2 × 106 ที่ 32 ° C กับแบคทีเรีย เพื่อยืนยันการลักษณะพิเศษของแต่ละสายพันธุ์แบคทีเรีย แต่ละชนิด (V. coralliilyticusV. harveyi, Pseudoalteromonas sp. และ Sulfitobacter sp) และผสมสามสายพันธุ์ (V. coralliilyticus, V. harveyi และ P. carotinifaciens) ได้นอกจากนี้ยัง ทดสอบ ใช้มาย ml−1 ประมาณ 106 เซลล์สุดท้าย2.3 การทดลองออกแบบขั้นตอนที่ต่อเนื่องสมบูรณ์ผสม (CFCM) ทดลองระบบอธิบายโดย Fujimura et al. (2008) ใช้ในคณะทันตแพทยศาสตร์ของอาณานิคมปะการัง อุณหภูมิน้ำทะเลถูกตั้งที่ 27 ° C หรือทดสอบในแบบแฟก 2 × 2 32 ° C และระดับสองของแบคทีเรียมากมาย (ไม่เพิ่ม andaddition ของแบคทีเรียผสม)มีสามเหมือนกับต่อการรักษา มีสูบน้ำทะเลเข้าสู่การขวดบ่ม โดยปั๊ม peristaltic สำหรับการทดลองกับแบคทีเรียเพิ่มปั๊มเพิ่มเติมการใช้โซลูชันแบคทีเรีย premixมีทะเล และน้ำทะเล inoculated ถูกสูบเข้าสู่การบ่มเพาะวิสาหกิจขวด ให้แสงจากโคมไฟเมทัลฮาไลด์มีการความหนาแน่นฟลักซ์คงโฟตอน (280 หรือ 0 μmol m−2 s−1 ในระหว่างการวงจรไฟ: มืด h 12:12) เคล็ดลับ 4 สาขาปะการังถูกวางลงในแก้ว 900 ml บ่มขวด ด้วยอัตราการไหลของ min−1 15 ml ในระหว่างระยะเวลาฟักตัว จำนวน 30 ขวดแก้วได้เตรียม: 15ขวดที่ถูกเก็บไว้ในห้องน้ำที่เก็บรักษาที่อุณหภูมิคง27 องศาเซลเซียส และ 15 ขวดอื่น ๆ อยู่ในอ่างน้ำที่ 32 องศาเซลเซียสหลังจาก 4 วัน แบคทีเรียถูก inoculated ในขวดหกในแต่ละอุณหภูมิใช้การปั๊มเพิ่มเติมเพื่อรักษาอัตราการไหลรวมของmin−1 15 ml ขั้นตอนการ inoculated น้ำเริ่มเวลา 9:00 น.ตัวอย่างเนื้อเยื่อและตัวอย่างน้ำสำหรับวัด metabolisms ปะการังที่ถ่ายในวันที่ 0, 4 และ 8 ปะการังจากจำลองสามขวดภายใต้เงื่อนไขแต่ละเงื่อนไขได้เสียสละสำหรับวิเคราะห์เนื้อเยื่อ น้ำตัวอย่างที่ถ่ายจากขวด replicate สามภายใต้เงื่อนไขแต่ละเงื่อนไขและใช้สำหรับการประเมิน metabolisms ปะการังออกแบบการทดลองเดียวกันใช้สำหรับแบคทีเรียแต่ละทดสอบ แนวปะการังมี incubated 4 วันที่ 32 ° C ในน้ำทะเลอุดมไป ด้วยแบคทีเรียที่เป็นขั้นสุดท้ายรวมมายเซลล์ 106 ml−1ขวดห้าประกอบด้วยหนึ่งสาขาเตรียมไว้สำหรับแบคทีเรียแต่ละสถานะสุดท้ายของแนวปะการังถูกประเมิน โดยการย้อมสีการพิมพ์ photochemical สูงสุด (Fv/Fm), และการมีของการตายเฉพาะส่วนของเนื้อเยื่อ2.4 การรักษาและประเมินตัวอย่างก่อนเริ่มต้นที่คณะทันตแพทยศาสตร์ และสาขา การสุ่มตัวอย่างหลังจากมีประสิทธิภาพสูงสุดควอนตัม Photosystem II (Fv/Fm)วัดโดยใช้ fluorometer ใต้น้ำ (ดำน้ำแพม Walzเยอรมนี) หลังจาก 30 นาทีของความมืดปรับ Value±SE เฉลี่ยของFv/Fm ก่อนบ่มถูก 0.748±0.007 (n = 30) เนื้อเยื่อปะการังได้รับเป็นรักษาตาม Higuchi et al. (2009a) ตัวอย่างทั้งหมดได้ล้าง ด้วย 0.7 M NaCl เอาซึ่งแนบแพลงก์ตอน และสิ่งมีชีวิต และอื่น ๆ homogenates เนื้อเยื่อได้อาหารโดยการแอร์เจ็ทวิธี ถูกพ่นฟอสเฟตบัฟเฟอร์ในที่ 100 มม.ใช้กระบอกฉีดสี ST (Asahipen ญี่ปุ่น) ถลกเนื้อเยื่อจากปะการังโครงกระดูก 15 มล.ของตัวอย่างคงไม่ได้แยกออกแล้วเป็นโฮสต์ปะการังเนื้อเยื่อและ endosymbiont zooxanthellae (Zoox) โดย centrifugation(ระยะเวลาและความเร็วใน Higuchi et al., 2009a) ส่วนขนาดเล็กของ zooxanthellae ที่ ใช้เศษนับ zooxanthellaeความหนาแน่นในการใช้ Neubauer hemocytometer Zooxanthellae ถูก lysedโดย sonication ในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 0.05% ไตรตั้น X 100 กิจกรรมสดassayed spectrophotometrically ตามที่อธิบายไว้ โดย Elstner และHeupel (1976) และ Oyanagui (1984) มาตรฐานสำหรับกิจกรรมเตรียมไว้ใช้วัวสด erythrocytic (ซิกมา) สำหรับแต่ละชุดตัวอย่างกิจกรรมแมวถูกวัด โดยการลดลงของ H2O2 ที่ 240 nm (เบียร์และคัดขนาดผล ชมพู่ 1952) ทั้งหมด assays ได้ดำเนินที่ 25 ° C ทันทีหลังจากสุ่มตัวอย่าง และเอนไซม์ถูกแสดงเป็นหน่วย (U) ต่อมิลลิกรัมโปรตีน โปรตีนถูกกำหนด โดยวิเคราะห์แบรดฟอร์ด(แบรดฟอร์ด 1976)ผลิตหลักราคาถูกกำหนดโดยใช้ติดตาม 13Cเทคนิคตามเป่า et al. (1993) สำหรับการวิเคราะห์เนื้อเยื่อ 13Cในรูปของโซเดียมไบคาร์บอเนตถูกเพิ่มเข้าไปที่คณะทันตแพทยศาสตร์ขวด การรักษาเพื่อประเมินการผลิตหลักได้ตามการ Casareto et al. (2009) สารสกัดจากเนื้อเยื่อ homogenate สั้น ๆ 5 mlมีกรองบนกรอง GF/F ก่อนเป็น ตัวกรองที่ถูกเก็บไว้at−20 ° C จนถึงการวิเคราะห์ หลังจากการอบแห้งที่ 60 ° C ตัวกรองได้รับการรักษามีควันกรดเพื่อกำจัดอนินทรีย์คาร์บอน แล้ว อินทรีย์คาร์บอนและอัตราส่วนของไอโซโทปถูกวัดโดยใช้เครื่องทดสอบกรดด่างโดยรวม(DELTAplus ประโยชน์ เทอร์โม Finnigan) พร้อม EA1110 การวิเคราะห์ธาตุ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 ปะการังตัวอย่าง
อาณานิคมของปะการังกิ่งก้าน M. digitata ถูกเก็บมาจาก
บริเวณชายฝั่งของเกาะโอกินาวาประเทศญี่ปุ่นได้รับอนุญาตจาก
โอกินาว่ารัฐบาลท้องถิ่นในจังหวัด (ฉบับที่ 22-5) เคล็ดลับสาขาคอรัล
(แคลิฟอร์เนีย 4 ซม. ยาว) จากโคโลนีปะการังขนาดใหญ่ถูกตัดและติดอยู่กับ
สุทธิเอทิลีน Brancheswere เก็บไว้เป็นเวลา 2 สัปดาห์ใน aquariumwith กลางแจ้ง
ทำงานน้ำทะเลเพื่อให้สามารถกู้คืน fromsampling ความเครียด.
2.2 สายพันธุ์แบคทีเรีย
ห้าสายพันธุ์ของเชื้อแบคทีเรีย V. coralliilyticus (AB490821) Vibrio harveyi
(AB490822) Paracoccus carotinifaciens (AB490820) Pseudoalteromonas
SP (AB691769) และ Sulfitobacter SP (AB691770) ถูกจัดเตรียมไว้สำหรับ
การทดลองนี้ แบคทีเรียเหล่านี้จะพบตามธรรมชาติในบริเวณชายฝั่ง
โอกินาวา, ​​ญี่ปุ่น V. coralliilyticus และ V. harveyi ที่แยกได้จาก
น้ำทะเลใน Sesoko โอกินาวา P. carotinifaciens แยกได้จาก
ฟอก M. digitata Pseudoalteromonas SP และ Sulfitobacter SP ถูก
แยกออกจากน้ำโดยรอบฟอก M. digitata แบคทีเรียทั้งหมด
ถูกเลี้ยงแยกต่างหากเพื่อการเจริญเติบโตระยะนิ่ง (108 มลเซลล์-1)
ในกลางน้ำซุปทะเลของเหลว ทุกวันวัฒนธรรมที่ได้รับการผสม
ล้างผ่านสาม centrifugations ติดต่อกันในการลบ themedium,
และเจือจางในน้ำทะเลที่ผ่านการกรองก่อนที่จะถูกผสม ผสม
การแก้ปัญหาที่มีห้าชนิดที่เพาะเลี้ยงแบคทีเรียที่ใช้สำหรับ
การทดลองฉีดวัคซีน หลังจากการฉีดวัคซีนที่อุดมสมบูรณ์รวมของ
แบคทีเรียในเรือบ่มแต่ละคนถูกนับโดยใช้ cytometry ไหล
(Beckman Coulter) สีเขียว SYBR หมายเลขของเชื้อแบคทีเรีย
(เซลล์มล-1) ภายใต้เงื่อนไขที่แตกต่างกันคือ 6.7 × 105 วันที่ 27 ° C
โดยไม่ต้องแบคทีเรีย 1.3 × 106 วันที่ 27 ° C ที่มีแบคทีเรีย 5.5 × 105 ที่ 32 ° C
โดยไม่ต้องแบคทีเรียและ 1.2 × 106 ที่ 32 ° C ที่มีเชื้อแบคทีเรีย เพื่อยืนยัน
ผลกระทบของแบคทีเรียสายพันธุ์แต่ละสายพันธุ์ของแต่ละบุคคล (V. coralliilyticus,
V. harveyi, Pseudoalteromonas sp. และ Sulfitobacter Sp.) และการผสมผสานของ
สามชนิด (V. coralliilyticus, V. harveyi และ carotinifaciens พี) เป็น
ทดสอบโดยใช้ความอุดมสมบูรณ์สุดท้ายประมาณ 106 เซลล์มล-1.
2.3 การออกแบบการทดลอง
การไหลอย่างต่อเนื่องที่สมบูรณ์ผสม (CFCM) ระบบการทดลอง
อธิบายโดย Fujimura และคณะ (2008) ถูกนำมาใช้สำหรับบ่ม
อาณานิคมของปะการัง อุณหภูมิน้ำทะเลที่ตั้งอยู่ที่ 27 องศาเซลเซียสหรือ
32 องศาเซลเซียสและสองระดับของความอุดมสมบูรณ์ของแบคทีเรีย (ไม่มีนอกจาก andaddition ของแบคทีเรียผสม) ได้รับการทดสอบใน 2 × 2 รูปแบบปัจจัย
ที่มีสามซ้ำต่อการรักษา น้ำทะเลถูกสูบเข้าไปใน
ขวดบ่มโดยปั๊ม peristaltic สำหรับการทดลองด้วยการเพิ่มแบคทีเรีย
ปั๊มเพิ่มเติมได้ถูกใช้ในการแก้ปัญหาพรีมิกซ์แบคทีเรีย
ที่มีน้ำทะเลและน้ำทะเลเชื้อที่ถูกฉีดเข้าไปฟักตัว
ขวด แสงให้เป็นโคมไฟ halide โลหะที่มี
ความหนาแน่นของของเหลวโฟคงที่ (280 หรือ 0 ไมโครโมล M-2 s-1 ในช่วง
12: 12 ชั่วโมงแสง: วัฏจักรเข้ม) สี่เคล็ดลับสาขาปะการังถูกวางลงใน
ขวดบ่มแก้ว 900 มล. ที่มีอัตราการไหลของ 15 ml 1 นาทีในระหว่าง
ระยะเวลาการบ่ม รวม 30 ขวดแก้วได้จัดทำ: 15
ขวดถูกเก็บไว้ในอ่างน้ำเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิคงที่
. วันที่ 27 ° C และอื่น ๆ 15 ขวดอยู่ในอ่างน้ำที่ 32 องศาเซลเซียส
หลังจากวันที่ 4 แบคทีเรียถูกเชื้อ เป็นหกขวดที่อุณหภูมิแต่ละ
โดยใช้เครื่องสูบน้ำเพิ่มเติมเพื่อรักษาอัตราการไหลรวมของ
15 ml 1 นาที การไหลของน้ำเชื้อเริ่มเวลา 9.00 น
ตัวอย่างเนื้อเยื่อและตัวอย่างน้ำสำหรับการวัด metabolisms ปะการัง
ถูกนำมาในวันที่ 0, 4, และ 8 ปะการังจากสามซ้ำ
ขวดภายใต้เงื่อนไขแต่ละเสียสละเพื่อการวิเคราะห์เนื้อเยื่อ น้ำ
ตัวอย่างถูกนำมาจากสามขวดซ้ำภายใต้เงื่อนไขของแต่ละ
และใช้สำหรับการวัด metabolisms ปะการัง.
การออกแบบการทดลองเดียวกันที่ใช้สำหรับแบคทีเรียแต่ละ
การทดสอบ ปะการังถูกบ่มเป็นเวลา 4 วันที่ 32 ° C ในน้ำทะเล
อุดมไปด้วยแบคทีเรียที่อุดมสมบูรณ์รวมสุดท้ายของเซลล์ 106 มล-1.
ห้าขวดที่มีหนึ่งในแต่ละสาขาได้รับการจัดเตรียมไว้สำหรับแบคทีเรียแต่ละ.
รัฐสุดท้ายของปะการังได้รับการประเมินโดยสีของพวกเขา ,
ผลผลิตแสงสูงสุดของพวกเขา (FV / Fm) และการแสดงตนหรือขาด
ของเนื้อเยื่อเนื้อร้าย.
2.4 การรักษาและการวัดตัวอย่าง
ก่อนที่จะเริ่มฟักตัวและหลังการสุ่มตัวอย่างสาขา,
ควอนตัมที่มีประสิทธิภาพสูงสุดของ Photosystem II (Fv / Fm) ได้รับการ
วัดโดยใช้ fluorometer ใต้น้ำ (ดำน้ำ-PAM; วอลซ์,
เยอรมนี) หลังจาก 30 นาทีของการปรับตัวที่มืด ค่าเฉลี่ย± SE ของ
Fv / Fm ก่อนที่จะฟักตัวเป็น 0.748 ± 0.007 (n = 30) เนื้อเยื่อปะการัง
ได้รับการรักษาตาม Higuchi และคณะ (2009A) ตัวอย่างทั้งหมดถูก
ล้างด้วย 0.7 M NaCl จะลบแพลงก์ตอนที่แนบมาอย่างหลวม ๆ และ
สิ่งมีชีวิตอื่น ๆ และ homogenates เนื้อเยื่อได้จัดทำขึ้นโดยใช้
วิธีการเจ็ทแอร์ซึ่งใน 100 มิลลิฟอสเฟตบัฟเฟอร์ได้รับการฉีดพ่น
โดยใช้เครื่องพ่นสารเคมีสี ST (Asahipen, ญี่ปุ่น) จะตัด เนื้อเยื่อจาก
โครงกระดูกปะการัง จากนั้น 15 ml ของกลุ่มตัวอย่างไม่คงที่ถูกแยกออก
เป็นเนื้อเยื่อปะการังโฮสต์และ endosymbiont zooxanthellae (Zoox) โดยการหมุนเหวี่ยง
(เวลาและความเร็วในขณะที่ Higuchi et al., 2009A) ส่วนเล็ก ๆ
ของส่วน zooxanthellae ถูกใช้ในการนับ zooxanthellae
ความหนาแน่นของการใช้ Neubauer hemocytometer zooxanthellae ถูก lysed
โดย sonication ในฟอสเฟตบัฟเฟอร์กับ 0.05% Triton X-100 กิจกรรม SOD
ได้รับการวิเคราะห์ spectrophotometrically ตามที่อธิบายไว้โดย Elstner และ
Heupel (1976) และ Oyanagui (1984) มาตรฐานสำหรับกิจกรรมที่ได้จัดทำขึ้น
โดยใช้วัว erythrocytic SOD (Sigma) สำหรับแต่ละชุดของตัวอย่าง.
กิจกรรม CAT โดยวัดจากการพร่องของ H2O2 ที่ 240 นาโนเมตร (เบียร์
และ Sizer 1952) การวิเคราะห์ทั้งหมดถูกดำเนินการที่ 25 ° C ทันที
หลังจากการสุ่มตัวอย่างและกิจกรรมของเอนไซม์ได้แสดงออกเป็นหน่วย (U) ต่อ
มิลลิกรัมโปรตีน ปริมาณโปรตีนถูกกำหนดโดยการทดสอบ Bradford
(แบรด, 1976).
อัตราการผลิตหลักได้รับการพิจารณาโดยใช้รอย 13C
เทคนิคตาม Hama และคณะ (1993) สำหรับการวิเคราะห์เนื้อเยื่อ 13C
ในรูปแบบของโซเดียมไบคาร์บอเนตถูกบันทึกอยู่ในบ่ม
ขวด การรักษาในการประมาณการผลิตหลักถูกตาม
ไป Casareto และคณะ (2009) สั้น ๆ 5 ml ของสารสกัดจาก homogenate เนื้อเยื่อ
ถูกกรองไปยังก่อนเผา GF / F ฟิลเตอร์ กรองถูกเก็บไว้
ที่อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียสจนการวิเคราะห์ หลังจากการอบแห้งที่อุณหภูมิ 60 ° C, ฟิลเตอร์ได้รับการรักษา
ด้วยกรดควันเพื่อกำจัดคาร์บอนนินทรีย์ จากนั้นอินทรีย์คาร์บอน
และอัตราส่วนไอโซโทปถูกวัดโดยใช้สเปกมวล
(DELTAplus Advantage; เทอร์โมฟินนิแกน) พร้อมกับ EA1110
วิเคราะห์ธาตุ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . ตัวอย่างของอาณานิคม
ปะการังปะการังกิ่งก้าน ม. digitata ถูกรวบรวมจากพื้นที่ชายฝั่งของเกาะโอกินาวา
ญี่ปุ่นได้รับอนุญาตจากรัฐบาล Prefectural โอกินาวา
( ไม่ 22-5 ) เคล็ดลับปะการัง
( ยาวประมาณ 4 ซม. ) จากโคโลนีปะการังขนาดใหญ่ที่ถูกตัดและแนบกับ
พลาสติกสุทธิ brancheswere เก็บไว้เป็นเวลา 2 สัปดาห์ ในการสระ aquariumwith
หนีน้ำทะเลเพื่อให้สามารถกู้คืน fromsampling ความเครียด .
2.2 . สายพันธุ์เชื้อ สายพันธุ์ของแบคทีเรีย
5 V coralliilyticus ( ab490821 ) , Vibrio harveyi
( ab490822 ) paracoccus carotinifaciens ( ab490820 ) pseudoalteromonas
sp . ( ab691769 ) และ sulfitobacter sp . ( ab691770 ) ถูกเตรียมไว้สำหรับ
การทดลองนี้ แบคทีเรียเหล่านี้จะพบตามธรรมชาติในภูมิภาคชายฝั่ง
โอกินาว่า ประเทศญี่ปุ่น coralliilyticus และ V Vที่แยกได้จากน้ำทะเลใน 5
sesoko , โอกินาว่า . หน้า carotinifaciens ถูกแยกจาก
ฟอกขาวม. digitata . pseudoalteromonas sp . และ sulfitobacter sp . ที่แยกได้จากน้ำรอบๆ
digitata ฟอกขาวเมตร . แบคทีเรียทั้งหมด
เพาะเลี้ยงแยกระยะการเจริญเติบโตคงที่ ( 108 เซลล์ ml − 1 )
ในกลางทะเลน้ำของเหลว ทุกๆ วัน วัฒนธรรมที่ถูกผสม ,
ล้างผ่านสาม centrifugations ติดต่อกันเพื่อลบปานกลาง
เจือจางในกรองน้ำทะเล , และก่อนที่จะถูกผสม ผสมสารละลายที่มีการเพาะเลี้ยงแบคทีเรียนี้

( ชนิดที่ใช้สำหรับการทดลอง หลังจากที่ได้รับปริมาณรวมของแบคทีเรียในแต่ละบ่ม
เรือนับใช้กระแส (
( Beckman Coulter ) กับ SYBR กรีน ตัวเลขของแบคทีเรีย
( เซลล์ ml − 1 ) ภายใต้เงื่อนไขที่แตกต่างกัน : 6.7 × 105 ที่ 27 ° C
ปราศจากแบคทีเรีย 1.3 × 106 ที่ 27 ° C กับแบคทีเรีย , 5.5 × 105 ที่ 32 ° C
ปราศจากแบคทีเรีย และ 1.2 × 106 ที่ 32 ° C กับแบคทีเรีย เพื่อยืนยันผลของแบคทีเรียแต่ละชนิด แต่ละชนิด ( coralliilyticus
V , V . harveyi pseudoalteromonas sp . , และ sulfitobacter sp . ) และส่วนผสมของ
3 ชนิด ( V . V . harveyi coralliilyticus , ,และ P . carotinifaciens )
นอกจากนี้ ทดสอบโดยใช้สุดท้ายมากมายประมาณ 106 เซลล์ ml − 1 .
2.3 การออกแบบการทดลองการไหลอย่างต่อเนื่องสมบูรณ์ผสม ( cfcm ) ระบบทดลอง
อธิบายโดยฟุจิ et al . ( 2008 ) , ใช้สำหรับการบ่ม
อาณานิคมของปะการัง อุณหภูมิน้ำทะเลที่ถูกตั้งที่ 27 ° C หรือ
32 ° Cและสองระดับของแบคทีเรียมากมาย ( ไม่มีส่วนผสมของแบคทีเรีย andaddition ) ถูกทดสอบใน 2 × 2 Factorial Design
3 ซ้ำ ต่อ การรักษา น้ำทะเลถูกสูบเข้าไปในขวดปั๊ม peristaltic
บ่มโดย . สำหรับทดสอบกับแบคทีเรียนอกจากนี้
ปั๊มเพิ่มเติมใช้โซลูชั่นรวม แบคทีเรีย
กับน้ำทะเลและน้ำทะเลที่ถูกสูบเข้าไปในการบ่มเชื้อ
ขวด แสงสว่างโดยโคมไฟ halide โลหะที่มีความหนาแน่นฟลักซ์คงที่ )
( 280 หรือ 0 μ mol m − 2 s − 1 ตอน
12:12-h แสง : วงจรมืด ) สี่เคล็ดลับปะการังถูกวางลงใน 900 มล. 1 ขวด
แก้ว ด้วยอัตราการไหล 15 มิลลิลิตรต่อนาที− 1 ใน
ระยะเวลาการบ่ม รวม 30 ขวดแก้วเตรียม : 15
ขวดถูกเก็บไว้ในน้ำอาบรักษาที่
อุณหภูมิคงที่27 ° C และอีก 15 ขวด อยู่ในอ่างน้ำที่ 32 ° C .
หลังจาก 4 วัน แบคทีเรียและเชื้อหกขวดที่อุณหภูมิแต่ละ
ใช้ปั๊มเพิ่มเติมเพื่อรักษาอัตราการไหลรวมของ
15 มิลลิลิตรต่อนาที− 1 ส่วน หัวเชื้อน้ำไหลเริ่ม 9 โมงเช้า
เนื้อเยื่อตัวอย่างและตัวอย่างน้ำสำหรับการวัดของปะการัง metabolisms
ถ่ายในวันที่ 0 , 4 และ 8ต้นที่ 3 ทำซ้ำ
ขวดในแต่ละสถานการณ์ที่พลีชีพเพื่อการวิเคราะห์เนื้อเยื่อ ตัวอย่างน้ำจากขวด 3
ถูกทำซ้ำในแต่ละสถานการณ์
และใช้ในการวัดของปะการัง metabolisms .
ออกแบบการทดลองเดียวกันถูกใช้สำหรับการทดสอบแบคทีเรีย
แต่ละ ปะการังถูกบ่มเป็นเวลา 4 วัน ที่ 32 ° C ในน้ำทะเล
อุดมไปด้วยแบคทีเรียที่มากมายสุดท้ายรวม 106 เซลล์ ml − 1
5 ขวดที่มีสาขาแต่ละคนเตรียมสำหรับแต่ละ bacterium
สถานะสุดท้ายของปะการังที่ประเมินโดยสี ,
2 ให้ผลผลิตสูงสุด ( FV / FM ) และการแสดงตนหรือขาด

และเนื้อเยื่อเนื้อร้ายได้ . การรักษาและค่า
.ก่อนที่จะเริ่มฟักไข่หลังจากกิ่ง )
สูงสุดประสิทธิภาพควอนตัม photosystem II ( FV / FM ) คือ
การวัดฟลู โรมิเตอร์ใต้น้ำ ( diving-pam ; วอลซ์
, เยอรมนี ) หลังจาก 30 นาทีของการเห็นในที่มืด . ค่าเฉลี่ยของ±เซ
FV / FM ก่อนการบ่มคือ 0.748 ± 0.007 ( n = 30 ) ปะการังเนื้อเยื่อ
รักษาตามกุจิ et al . ( 2009a ) ตัวอย่างทั้งหมดจะถูกล้างด้วย
07 M NaCl เอาหลวมๆแนบแพลงก์ตอนและ
สิ่งมีชีวิตอื่น และ homogenates เนื้อเยื่อเตรียมใช้
เจ็ทแอร์วิธีซึ่งในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 100 มม. ถูกพ่น
ใช้พ่นสีเซนต์ ( asahipen ญี่ปุ่น ) เพื่อตัดเนื้อเยื่อจาก
โครงกระดูกปะการัง แล้ว 15 ml ไม่ตัวอย่างถาวรแยก
เป็นเจ้าภาพปะการังเนื้อเยื่อและ endosymbiont ซูซานเทลลี ( zoox 3
) โดย( เวลาและความเร็วใน กุชิ et al . , 2009a ) เป็นส่วนเล็ก ๆของซูแซนเทลลา
ส่วนถูกใช้นับความหนาแน่นของซูแซนเทลลา
ใช้นูเบาเออร์ hemocytometer . ซูซานเทลลีเป็น lysed
โดย sonication ในฟอสเฟตบัฟเฟอร์กับ 0.05% Triton X-100 . สดกิจกรรม
ซีรั่มนี้ตามที่อธิบายไว้โดย elstner และ
heupel ( 1976 ) และ oyanagui ( 1984 ) มาตรฐานสำหรับกิจกรรมเตรียม
ใช้วัว erythrocytic SOD ( Sigma ) สำหรับแต่ละชุดของตัวอย่าง
กิจกรรมแมววัดจากการพร่องของ H2O2 ที่ 240 nm ( เบียร์
กับไซเซอร์ , 1952 ) สามารถถูกดำเนินการใน 25 ° C ทันที
หลังจากการสุ่มตัวอย่าง และกิจกรรมของเอนไซม์จะแสดงเป็นหน่วยต่อมิลลิกรัมโปรตีน ( U )
. โปรตีนถูกกำหนดโดย Bradford assay

( แบรดฟอร์ด , 1976 )อัตราการผลิตหลักถูกกำหนดโดยใช้ 13C Tracer
เทคนิคตาม Hama et al . ( 1993 ) การวิเคราะห์เนื้อเยื่อ 13C
ในรูปแบบของโซเดียมไบคาร์บอเนต ได้เพิ่ม เพื่อบ่มเพาะ
ขวด การประมาณการผลผลิตปฐมภูมิก็ตาม
เพื่อ casareto et al . ( 2009 ) สั้น 5 มิลลิลิตร ปริมาณสารสกัดจากเนื้อเยื่อ
คือกรองบนก่อนเผาตัวกรอง GF / F . ตัวกรองที่ถูกเก็บไว้
ที่ 20 องศา C −จนถึงการวิเคราะห์ หลังจากการอบแห้งที่ 60 ° C , ตัวกรองได้รับการรักษาด้วยกรดเพื่อกำจัดควัน
อนินทรีย์คาร์บอน แล้วอัตราส่วนไอโซโทปอินทรีย์และคาร์บอน
วัดโดยใช้มวลวัสดุ
( deltaplus ประโยชน์ ; thermo ฟินนิกัน ) พร้อมกับ ea1110
ธาตุที่วิเคราะห์